Name: a precise pathogen delivery and recovery system for murine models of secondary bacterial pneumonia
Uploaded: 2019-09-21T13:00:00
Duration: 13 s
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Gli autori ringraziano Nicole Meissner, M.D./Ph.D., Montana State University, per il suo aiuto nella creazione del metodo di instillazione intratracheale. Questo lavoro è stato sostenuto dagli U.S. National Institutes of Health (Grants NIH-1R56AI135039-01A1, GM110732, R21AI128295, U54GM115371), così come i fondi della Montana University System Research Initiative (51040-MUSRI2015-03) e Montana State University Stazione sperimentale agricola.

Tutti i metodi sono conformi alle linee guida dei National Institutes of Health e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) della Montana State University.
1. Instillazione intratracheale
<ol><li>Preparare uno spazio di lavoro contenente le seguenti forniture: una piattaforma di intubazione, una siringa sterile da 1 mL, pinze sterili con punta smussata, ago con punta smussata sterile da 21 calibro e due tubi conici per memorizzare la siringa e le pinze. NOTA: le piattaforme di intubazione possono essere acquistate commercialmente o costruite internamente. La piattaforma di intubazione utilizzata qui è stata costruita utilizzando plexiglass da 0,25 pollici. In breve, il calore è stato applicato al plexiglass e la scheda è piegata ad un angolo interno approssimativo di 65 gradi. Sul lato esterno della piattaforma di intubazione, due viti macchina sono stati seminati 3 pollici di distanza e un elastico è stato sospeso tra le due viti.</li>
	<li>Preparare l'inoculum patogeno diluindo serialmente il campione in modo che la concentrazione finale desiderata si ottenga in un volume totale di 50 l. Conservare l'inoculum sul ghiaccio.</li>
	<li>Indossando guanti sterili, piegare un ago con punta smussata da 21 G a circa 35 gradi. NOTA: è necessario un ago separato per ogni mouse.</li>
	<li>Fissare l'ago piegato da 21 G con punta smussata su una siringa da 1 mL. Disegnare nella siringa un cuscino d'aria da 100 gradi, seguito da 50 l dell'agente infettivo. Posizionare l'ago caricato e la siringa in un luogo facilmente accessibile dalla mano dominante.</li>
	<li>Anestesizzare profondamente un topo usando una miscela di isoflurane/ossigeno del 4% o un metodo di anestesia approvato IACUC simile. La corretta profondità di anestesia si ottiene in genere quando i tassi di respirazione rallentano a circa 1 inalazione per 5-8 s e possono essere confermate pizzicando un'appendice e non osservando alcuna reazione dal mouse. NOTA: Questo metodo di anestesia ha fornito una durata sufficiente di anestesizzazione di circa 1,5 min. Questo è stato sufficiente per i membri del nostro laboratorio per imparare ed eseguire questa procedura di instillazione; tuttavia, altri metodi di anestesia approvati istituzionalmente possono essere impiegati11,12,13.</li>
	<li>Rimuovere il topo anestetizzato dalla camera di anestesia e sospendere il mouse sulla piattaforma di intubazione dagli incisivi mascellari.</li>
	<li>Per aprire un chiaro passaggio nella trachea, utilizzare le pinze con punta smussata per afferrare delicatamente ed estendere la lingua al di fuori della bocca. Trasferire la lingua dalle pinze nel pollice e nell'indice della mano non dominante.</li>
	<li>Rimanere tenendo la lingua nella mano non dominante e raccogliere la siringa precaricata. Puntare l'estremità piegata dell'ago lontano dal corpo e inserire l'ago nella cavità orale alla base della lingua.</li>
	<li>Con l'ago alla base della lingua, angolare delicatamente il polso per causare una leggera pressione dell'ago lontano dal corpo. Questa fase assicura che l'ago verrà inserito nella trachea e non nell'esofago.</li>
	<li>Guidare lentamente l'ago verso il basso nella trachea; spesso un leggero segno di spunta si fa sentire mentre l'ago passa attraverso la piega vocale. Passare l'ago attraverso la trachea fino a quando si sente una leggera resistenza mentre l'ago incontra la carina.</li>
	<li>Sollevare leggermente l'ago in direzione prossimale per sospendere l'ago sopra la carina. Ciò consente la consegna nei due bronchi primari. Deprimere completamente lo stantuffo della siringa per fornire il carico infettivo. Rimuovere l'ago dalla trachea sollevando verso l'alto e scartare.</li>
	<li>Rimuovere il mouse dalla piattaforma di intubazione premendo l'elastico ma mantenere il mouse in posizione verticale. Ostruire le vie nasali posizionando un dito direttamente sopra le nares. Mantenere questa posizione per circa 1 min o fino a quando non si osservano diversi respiri profondi. NOTA: Quest'ultimo passo assicura che il volume totale di inoculo venga consegnato nel tratto respiratorio inferiore.</li>
	<li>Riportare il topo alla sua gabbia e osservare un completo recupero dall'anestesia.</li>
</ol>2. Escissione dei polmoni infetti
<ol><li>Lavorando all'interno di una cappa a flusso laminare per mantenere la sterilità, preparare uno spazio di lavoro con i seguenti elementi: una barca a grandezza e sterile, una piattaforma di dissezione, un kit di dissezione contenente forbici e pinze, PBS sterile senza RNA e garza sterile.</li>
	<li>Eutanasia un topo infetto con CO2 o un metodo simile approvato IACUC di eutanasia.</li>
	<li>Posizionare un mouse infetto su una piattaforma di dissezione e fissare il mouse utilizzando i perni alla fine di ogni appendice. Spruzzare il mouse con etanolo per mantenere la sterilità delle superfici di lavoro.</li>
	<li>A partire dall'ombelico, utilizzare un paio di pinze per sollevare la pelle e fare un'incisione fino alla base della trachea. Afferrando la pelle su entrambi i lati dell'incisione iniziale, tirare la pelle lontano dal corpo e tagliare attraverso le connessioni dei tessuti. NOTA: Può essere utile effettuare diversi tagli laterali sulla pelle per rivelare più della regione toracica.</li>
	<li>Partendo dalla base del processo xifoideo, fai una piccola incisione con l'intenzione di forare il diaframma. Ciò si traduce in un aumento della pressione nella cavità toracica che provoca la ritrazione dei polmoni. Con i polmoni retratti continuare l'incisione per liberare il diaframma.</li>
	<li>Rimuovere le costole facendo un'incisione lungo entrambi i lati della gabbia toracica. Questo esporrà completamente la cavità toracica e polmoni.</li>
	<li>Per accisare i polmoni, afferrare la base del cuore con le pinze e sollevare verso l'alto. Posizionare le forbici dietro i polmoni e iniziare a fare piccole incisioni attraverso le connessioni tissutali, pur continuando verso l'ascensore il cuore verso l'alto.</li>
	<li>Una volta che i polmoni sono stati espulsi, posizionarli sulla garza sterile e rimuovere il cuore. Il cuore può essere facilmente rimosso sollevandolo dai polmoni con le pinze e tagliando le connessioni dei tessuti rimanenti.</li>
	<li>Trasferire i polmoni su una barca di pesatura pre-tared e registrare il peso.</li>
	<li>Dopo che i polmoni sono stati pesati, trasferirli in sterili salini tamponati di fosfato (PBS) e conservarli temporaneamente sul ghiaccio fino a passare alle fasi di recupero e analisi degli agenti patogeni.</li>
</ol>3. Recupero e analisi dei patogeni
<ol><li>Continuando a lavorare all'interno di una cappa a flusso laminare, preparare uno spazio di lavoro con le seguenti forniture: una smerigliatrice di tessuti, PBS sterile senza RNAse, Buffer RLT integrato con tubi di microcentrismo senza z-mercaptoetanol (1:100) e tubi di microcentrifuga senza RNAse da 1,5 mL. AVVISO: la z-mercaptoetanolo può essere pericolosa in caso di contatto cutaneo, ingestione, contatto visivo o inalazione. La diluizione di z-mercaptoetanolo nel TAMP tampone deve essere eseguita in un cofano di fumi.</li>
	<li>Iniziare aggiungendo prima 1 mL di PBS sterile senza RNA alla smerigliatrice dei tessuti. Una volta riempito, conservare il tritatessuto sul ghiaccio.</li>
	<li>Preparare una serie di tubi di diluizione seriali sterili senza RNA che verranno utilizzati per quantificare il carico batterico recuperato dai polmoni infetti. Ciò è più facile da ottenere con l'aliquota di 900 l di acqua sterile in ogni tubo di microcentrifuga seguito dalla diluizione seriale dell'inoculo patogeno. NOTA: Il numero di tubi di diluizione necessari per l'esatta enumerazione degli agenti patogeni varia in base all'input iniziale dell'agente patogeno e alla durata dell'infezione. Questo deve essere determinato empiricamente.</li>
	<li>Utilizzando pinze sterili, trasferire i polmoni nella smerigliatrice dei tessuti preparata e omogeneizzare accuratamente il tessuto premendo verso il basso sul piedistallo durante la rotazione.</li>
	<li>Aprire la smerigliatrice tissutale e decomposto 100 l del campione omogeneizzato nel primo dei tubi di diluizione seriale preparati. Diluire serialmente i campioni ed enumerare le CFU placcando sull'agar nutritivo. I CFU possono essere registrati come CFU/mL o CFU/mL/mg del tessuto polmonare. NOTA: In questa fase è possibile rimuovere altri 200 l del campione omogeneizzato per la purificazione dell'RNA virale (cfr. tabella dei materiali)o immagazzinato a -80 gradi centigradi per analisi future.</li>
	<li>Dopo che gli aliquot sono stati rimossi per la determinazione della CFU e/o l'isolamento dell'RNA virale, sostituire il piedistallo di macinazione e pellet il tessuto omogeneizzato con centrifugazione a 4.000 giri (3724 x g)per 10 min a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta, rimuovere il supernatante dal campione pelletto e metterlo in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. NOTA: Il supernatante è privo di batteri e può essere conservato a -80 gradi centigradi per l'analisi dei fattori patogeni solubili dell'ospite e dei patogeni secermobili.</li>
	<li>Risospendere il pellet di tessuto omogeneizzato con pipettaggio o vortice in 700 -L di tampone RLT-z-mercaptoetanolo e trasferire il campione in un tubo sterile di microcentrifuga di 1,5 mL privo di RNAse. NOTA: A questo punto i campioni possono essere conservati a -80 gradi centigradi per diversi mesi.</li>
	<li>Purificare l'RNA utilizzando lievi modifiche al protocollo del produttore di un kit di purificazione (vedi Tabella dei materiali); vedere Voyich et al. 200814.<ol>
<li>Trasferire il liquame polmonare omogeneizzato in un tubo di microcentrifuga da 2 ml contenente perline di silice da 0,1 mm e lavorato tramite un battitore di perline per 20 s a 6 m/s.</li>
		<li>Centrifugare il campione a 1.500 giri/min per 3 minuti. Dopo la centrifugazione, pipetta il supernatante in nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml.</li>
		<li>Aggiungere al campione 350 ll del 96%-100% di etanolo e mescolare accuratamente con pipettaggio o inversione.</li>
		<li>Trasferire 700 l del campione in una colonna di purificazione posta in un tubo di raccolta da 2 mL. Centrifugare il campione a 8.000 x g per 15 s e scartare il flusso attraverso. Eseguire qualsiasi campione in eccesso attraverso la stessa colonna descritta in precedenza.</li>
		<li>Lavare la colonna con 700 gradi l di tampone di RW1 e centrifugare a 8.000 x g per 15 s. Scartare il flusso attraverso e trasferire la colonna di membrana di silice in un nuovo tubo di raccolta da 2 mL.</li>
		<li>Applicare 500 valori di RPE del buffer alla colonna. Lavare la colonna con centrifugazione a 8.000 x g per 15 s. Scartare il flusso attraverso.</li>
		<li>Applicare altri 500 bit l di RPE tampone alla colonna RNeasy e centrifugare a 8.000 x g per 2 min. </li>
		<li>Per eluire l'RNA purificata, iniziare trasferendo la colonna in un nuovo tubo di microcentrifuga senza RNAse da 1,5 mL. Pipette 50 - L di acqua senza RNase direttamente sulla membrana silice-gel della colonna e centrifuga a 8000 x g per 1 min. NOTA: L'RNA eluito può essere eseguito nuovamente sulla stessa colonna per aumentare la resa dell'RNA.</li>
		<li>Aggiungete 50 l di acqua senza RNase all'RNA purificato per portare il volume totale a 100.L. Aliquota 350 L RLT-z-mercaptoetanolo seguita da 250 L del 96%-100% di etanolo nel campione e mescolare accuratamente con pipettaggio o inversione.</li>
		<li>Applicare il campione a una colonna di purificazione posta in un tubo di raccolta e centrifugare a 8000 x g per 15 s. Eliminare il flusso attraverso e sostituire il tubo di raccolta.</li>
		<li>Lavare la colonna aggiungendo 350 l of buffer RW1 seguito dalla centrifugazione a 8000 x g per 15 s.</li>
		<li>Preparare una soluzione DNase contenente circa 27 unità Kunitz aggiungendo 10 -L di stock DNase (750 unità Kunitz/mL) a 70 -L di buffer RDD. Aggiungete 80 - L di soluzione DNase direttamente sulla membrana silice-gel e incubate il campione per 15 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavare la colonna con 350 gradi di buffer RW1 e centrifugare a 8000 x g per 15 s e scartare il flusso attraverso.</li>
		<li>Ripetere i passaggi da 3.9.6–3.9.8 per purificare l'RNA. NOTA: si consiglia di ripetere la procedura di pulizia dell'RNA seguendo i passaggi 3.9.9–3.9.10 e 3.9.6–3.9.8 (salta dNase passaggi 3.9.11–3.9.13). Questa pulizia aggiuntiva si traduce in RNA di altissima qualità.</li>
	</ol></li>
	<li>La resa dell'RNA può essere quantificata utilizzando uno spettrofotometro con letture a 260 nM per determinare la concentrazione e 260:280 nM per la purezza. Una volta ottenuta la resa dell'RNA, standardizzare la concentrazione di ogni campione di RNA a 50 ng/L. NOTA: Si raccomanda di effettuare più multipli ad una concentrazione di 50 ng/L per evitare cicli di congelamento/scongelamento che possono portare alla degradazione dell'RNA.</li>
	<li>Conservare l'RNA purificata a -80 gradi centigradi o utilizzarlo immediatamente per l'analisi della trascrizione. NOTA: nelle pubblicazioni precedenti l'RNA da 3 a 5 topi era raggruppato per l'analisi della trascrizione. Attraverso l'ottimizzazione della tecnica di cui sopra, l'RNA da 1 topo è stato empiricamente determinato come sufficiente per l'analisi della trascrizione (80-120 ng/L).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Xu, J., Murphy, S. L., Kochanek, K. D., Bastian, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+Vital+Statistics+Reports+Deaths:+Final+Data+for+2013.">National Vital Statistics Reports Deaths: Final Data for 2013.</a> National Center for Health Statistics. 64 (2), 1 (2013).</li><li>Morris, D. E., Cleary, D. W., Clarke, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+Bacterial+Infections+Associated+with+Influenza+Pandemics.">Secondary Bacterial Infections Associated with Influenza Pandemics.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1041 (2017).</li><li>Lee, M., Arrecubieta, C., Martin, F. J., Prince, A., Borczuk, A. C., Lowy, F. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'uso di questo modello fornisce un metodo altamente efficiente e riproducibile per studiare le infezioni batteriche secondarie. La capacità di controllare strettamente la consegna dell'inoculo patogeno consente osservazioni più precise degli effetti individuali e combinatori di ogni agente patogeno. Le inefficienze nel più comune percorso di instillazione intranasale hanno probabilmente contribuito alle discrepanze nei volumi di dose e nelle concentrazioni presenti nella letteratura. È ragionevole che la mancanza di un sistema murino preciso per studiare la polmonite batterica secondaria abbia ritardato i risultati che identificano le risposte specifiche batteriche che contribuiscono alla gravità delle co-infezioni polmonari. Lo sviluppo di un modello riproducibile per studiare l'espressione della virulenza durante le infezioni batteriche secondarie potrebbe portare all'identificazione di bersagli di vaccino o farmaci per migliorare queste infezioni.
La fase di instillazione intratracheale è fondamentale per stabilire con successo un'infezione del tratto respiratorio inferiore e qualsiasi analisi a valle degli agenti patogeni. Quando si impara questa tecnica, può essere utile praticare l'uso di un tinrito (come descritto nei metodi) prima di somministrare materiale infettivo. L'utilizzo di un tinrito consente la visualizzazione diretta dell'inoculum nel tratto respiratorio. Un errore comune che può verificarsi è l'inserimento dell'ago smussato nell'esofago piuttosto che nella trachea. Questo si tradurrà in consegna dell'inoculo nello stomaco piuttosto che nei polmoni. Per correggere questo errore, inclinare l'ago più lontano dal corpo e passarlo verso il basso nella trachea. Una volta padroneggiata, questa procedura è molto efficiente e può essere utilizzata per condurre esperimenti con un gran numero di topi. Lavorando in lotti per anestesizzare i topi, l'instillazione intratracheale può essere completata in circa 30 secondi per mouse. Inoltre, l'escissione dei polmoni può essere completata in 2 o 3 minuti per mouse.
Il recupero di RNA batterico vitale e puro dai tessuti infetti è fondamentale per l'analisi della trascrizione. Le Nasie sono onnipresenti e possono rovinare rapidamente un esperimento15. Alcuni metodi includono l'utilizzo di inibitori di RNase; tuttavia, abbiamo scoperto che il congelamento del campione a -80 gradi centigradi nel RLT-mercaptoenolo o l'elaborazione immediata del campione per l'isolamento dell'RNA utilizzando tutti i tubi liberi di RNase e reagenti sono efficaci nel ridurre la contaminazione da RNase. Inoltre, si consiglia di purificarsi un massimo di sei campioni contemporaneamente. L'inclusione di più di sei campioni può comportare latenze prolungate tra passaggi di protocollo che possono culminare nella degradazione dell'RNA. Una volta purificato, dovrebbe anche essere presa cura per evitare inutili cicli di congelamento-scongelamento. Pertanto, se verranno eseguite più analisi su un campione, si raccomanda di deporre l'RNA purificata dall'aliquota per l'immagazzinamento a -80 gradi centigradi.
Oltre alle tecniche esaminate nel presente documento, questo metodo può essere integrato eseguendo lavaggio alveolar bronchiale prima dell'escissione e dell'omogeneità dei polmoni16. Questo può essere ottenuto lavando l'intero tratto respiratorio inferiore o utilizzando filo di sutura per limitare un braccio ramificato dell'albero bronchiale seguito da lavanda attraverso il ramo rimanente. Spesso questo porta a una riduzione del recupero del carico patogeno, ma fornisce un campione per cui informazioni come l'attività di dehydrogenase lattato, identità della popolazione cellulare, e profili citochine possono essere ottenuti16. Insieme questi dati possono formare una comprensione più completa delle interazioni ospite-patogeno che si verificano durante la polmonite batterica secondaria.
Mentre i metodi discussi sono stati nel contesto della polmonite batterica secondaria, sono adatti per essere estesi a qualsiasi modello murino di infezione respiratoria inferiore; in particolare, quelli che beneficerebbero di una consegna e di un recupero strettamente controllati dell'inoculum installato. Inoltre, come molte altre vie di infezione, l'instillazione intratracheale può essere utilizzata in applicazioni non infettive, come la somministrazione di terapie e composti ambientali12.

La polmonite batterica secondaria in seguito all'infezione influenzale è una delle principali cause di morte negli Stati Uniti e un'area attiva di ricerca1,2. Nonostante numerosi studi che utilizzano modelli murini di polmonite batterica secondaria, le incoerenze riguardanti l'instillazione e l'interrogatorio rimangono3,4,5. Inoltre, mentre molti sforzi precedenti si sono concentrati sugli effetti immunomodulatori dell'influenza che portano ad un aumento suscettibile di infezione batterica secondaria, dati più recenti suggeriscono che la regolazione della virulenza del patogeno batterico è uguale contributo all'instaurazione della malattia6,7,8,9. Questi nuovi dati richiedono un metodo più preciso per esplorare la polmonite batterica secondaria in modelli murini di coinfezione che facilitano lo studio della risposta dell'agente patogeno.
Unici per i modelli di co-infezione influenzale, gli organismi ospiti sono intenzionalmente immunocompromessi da un'infezione influenzale primaria prima della somministrazione dell'agente batterico secondario. Al fine di replicare al meglio la patogenesi della malattia osservata negli ospiti umani, è imperativo controllare il carico patogeno di agenti primari e secondari in modo da osservare gli effetti individuali e combinatori di ogni agente infettivo. Più comunemente, le infezioni respiratorie nei topi sono state stabilite attraverso una somministrazione intranasale3,4,5,6,10. In quanto questo percorso è noto per essere tecnicamente semplice e può essere appropriato in alcune applicazioni di infezione singolo agente, è inadatto per i modelli di co-infezione, in quanto le procedure di instillazione, i volumi di dose e l'efficacia sono altamente variabili all'interno letteratura pubblicata3,4,5,6.
Per ottenere una comprensione più completa della patogenesi della polmonite batterica secondaria, devono essere considerati i contributi sia dell'ospite che dell'agente patogeno. A tal fine, abbiamo sviluppato un approccio semplice e riproducibile per il recupero di batteri vitali e RNA patogeno dai polmoni infetti. Questo metodo utilizza una procedura di instillazione intratracheale semplificata e non invasiva seguita da un successivo isolamento dell'RNA batterico. La procedura di instillazione intratracheale qui descritta è simile ai metodi descritti in precedenza e non è limitata alla somministrazione di agenti patogeni11,12,13. L'uso di questa particolare procedura trae vantaggio dall'essere a basso costo e non richiede l'uso di attrezzature specializzate come cannula, fili guida o cavi in fibra ottica; inoltre, poiché questa procedura non è invasiva assicura lo stress minimo sui soggetti murini, riduce al minimo una risposta infiammatoria dalla meccanica di inoculazione e fornisce un percorso di consegna efficiente per l'infezione di più soggetti. In breve, i topi anestetizzati isoflurano sono sospesi dagli incisivi. Le pinze sono utilizzate per afferrare delicatamente la lingua seguita dall'inserimento di un ago piegato, smussato, 21 motrici nella trachea e la consegna del carico patogeno. La convalida di questa procedura è dimostrata dalla conferma visiva del tinrio equamente distribuito nel compartimento polmonare e dal recupero del carico batterico. Dimostriamo quindi come recuperare lo Staphylococcus aureus vitale (S. aureus) dai polmoni infetti e descriviamo un metodo riproducibile per isolare l'RNA patogeno di alta qualità.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix B</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>6911100</td>
			<td>Referred to in text as &#34;0.1 mm silica beads&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-gauge blunt needle</td>
			<td>SAI</td>
			<td>B21-150</td>
			<td>1.5&#34; is recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>DNase used in the accompanying text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 Classic Instrument</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116004500</td>
			<td>FastPrep FP120 is no longer available. Referred to in text as &#34;Bead Beater&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan AIV-Matrix Reagents</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4405543</td>
			<td>Influenza A M-segment qRT-PCR kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intubation Stand</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>ETI-MES-01</td>
			<td>Referred to in text as &#34;intubation platform.&#34; Intubation platform used in the accompanying video was made in house.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>RNA purification kit; contains RNeasy columns, Buffer RLT, Buffer RW1, and Buffer RPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52904</td>
			<td>Viral RNA purification kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Grinders</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-542-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (&#946;-Mercaptoethanol)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>UN2966</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a precise pathogen delivery and recovery system for murine models of secondary bacterial pneumonia

Le polmonite batteriche secondarie che seguono le infezioni influenzali si collocano costantemente all'interno delle prime dieci cause di morte negli Stati Uniti. Ad oggi, i modelli murini di co-infezione sono stati lo strumento principale sviluppato per esplorare le patologie delle infezioni primarie e secondarie. Nonostante la prevalenza di questo modello, tra gli studi sono prevalenti notevoli discrepanze per quanto riguarda le procedure di instillazione, i volumi di dose e gli efficaci. Inoltre, questi sforzi sono stati in gran parte incompleti nell'affrontare il modo in cui l'agente patogeno può influenzare direttamente la progressione della malattia dopo l'infezione. Qui forniamo un metodo preciso di consegna degli agenti patogeni, recupero e analisi da utilizzare in modelli murini di polmonite batterica secondaria. Dimostriamo che l'instillazione intratracheale consente una somministrazione efficiente e accurata di volumi controllati direttamente e uniformemente nel tratto respiratorio inferiore. I polmoni possono essere eccitati per recuperare e quantificare il carico patogeno. Dopo l'escissione dei polmoni infetti, descriviamo un metodo per estrarre l'RNA patogeno di alta qualità per la successiva analisi trascrizionale. Questa procedura trae vantaggio dall'essere un metodo non chirurgico di consegna senza l'uso di attrezzature di laboratorio specializzate e fornisce una strategia riproducibile per studiare i contributi dei patogeni alla polmonite batterica secondaria.

Figura 1 utilizza un 0.1% peso/volume Coomassie brillante soluzione blu per dimostrare che un'instillazione intratracheale fornisce l'inoculum direttamente e in modo uniforme all'interno del tratto respiratorio inferiore. La figura 2 mostra che i batteri (S. aureus) CFU recuperato direttamente dal tessuto polmonare omogeneizzato. La figura 3 illustra l'uso di questo sistema per la consegna e il recupero precisi dell'inoculo nel tratto respiratorio inferiore tracciando le CFU di ingresso e recupero dai singoli topi. La figura 4 mostra la curva di amplificazione qRT-PCR del gene delle pulizie batteriche gyrB per dimostrare che l'RNA batterico può essere estratto direttamente dal tessuto polmonare infetto con contaminazione minima del DNA. La figura 5 mostra la costruzione di una curva standard utilizzando l'amplificazione qRT-PCR del segmento M del virus dell'influenza A per dimostrare che l'RNA virale può essere estratto direttamente dal tessuto polmonare infetto.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig01.jpg"> Figura 1: l'instillazione intratracheale consente una distribuzione uniforme nel tratto respiratorio inferiore. (A, B) I polmoni non infetti sono stati asbici da un topo sano a seguito di instillazione intratratracheale di PBS sterile e fotografati da (A) da prospettive dorsali e (B)ventrali. (C, D) 50 - L di una soluzione blu brillante Coomassie 0,1% sono stati somministrati a un topo anetizzato tramite la somministrazione intratracheale. (C) Dorsale. (D) Ventrale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig02.jpg"> Figura 2: Recupero rappresentativo delle CFU batteriche dall'omogenea polmonare infetta. I polmoni sono stati eccitati un giorno post-sfida con S. aureus. Dopo l'omolazione, 100 l del liquame polmonare è stato diluito in serie fino a 10-6. Per enumerare le CFU recuperate, sono state placcate 10 gocce di ll dalle dilutions 10-5 e 10-6 sull'agar di soia a catena (TSA) e incubate a 37 gradi centigradi con il 5% C02 durante la notte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig03.jpg"> Figura 3: consegna precisa e recupero dell'inoculo patogeno a seguito della somministrazione intratracheale. I topi sono stati divisi in due gruppi contenenti tre topi per gruppo. I topi sono stati sottoposti a instillazione intratracheale di S. aureus a 1 x 108 (basso) e 2 x 108 (alto) CFU/mL. Un'ora dopo l'infezione, i topi sono stati eutanasia e i polmoni sono stati ascisi per dimostrare la precisione dell'instillazione e del recupero. L'inoculum batterico e i batteri recuperati dall'omogenea polmonare sono stati placcati su TSA (agar di soia da forato). Non sono state segnalate differenze significative tra l'input batterico e il recupero. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig04.jpg"> Figura 4: Recupero e purezza dell'RNA batterico rappresentativo. Sei ore dopo l'instillazione intratratratale con 1 x 108 CFU/50 -L di S. aureus, i topi sono stati eutanasia. I polmoni sono stati ascisi e omogeneizzati seguiti dalla sospensione del liquame polmonare nel tampone RLT-z-mercaptoenolo. L'RNA è stato purificato come descritto al punto 3.914. qRT-PCR è stato utilizzato per rilevare le trascrizioni del gene delle pulizie batteriche gyrB. È stato incluso un controllo che non contiene trascrizioni inversa (nRT) per dimostrare la purezza dell'RNA recuperato. A una soglia di 0,1, le trascrizioni ginrB sono state rilevate in un ciclo medio di 21,1, 20,3 e 20,5. I controlli nRT non sono stati rilevati fino a quando la media del ciclo 35,9, 35,5 e 35,0. n - 3 repliche biologiche, contenenti 3 repliche tecniche/replicate biologiche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig05.jpg"> Figura 5: Recupero dell'RNA virale rappresentativo. Sei giorni dopo l'instillazione intratratale con 100 PFU/50 -L di influenza A/PR/8/1934(H1N1), i topi sono stati eutanasia. I polmoni sono stati ascisi e omogeneizzati, e 200 -L del liquame omogeneizzato è stato raccolto e passato attraverso un ceppo di 70 cellule prima della purificazione dell'RNA virale. L'RNA purificato è stato diluito in serie (10-1-10-4) seguito dall'amplificazione dell'influenza Un segmento M. (A) Grafico di amplificazione dell'influenza Un RNA recuperato da un polmone infetto e diluito 10-1–10-4. (B) Curva standard dell'influenza A-segmento M. Soglia: 0,2, R2 , 0,994, pendenza - -3,46. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia

Qui, presentiamo metodi per migliorare gli studi secondari sulla polmonite batterica fornendo un percorso non invasivo di instillazione nel tratto respiratorio inferiore seguito dal recupero di patogeni e dall'analisi della trascrizione. Queste procedure sono riproducibili e possono essere eseguite senza apparecchiature specializzate come cannula, cavi guida o cavi in fibra ottica.

Un sistema preciso di distribuzione e recupero di patogeni per i modelli Murine di polmonite batterica secondaria

Secondary bacterial pneumonias following influenza infections consistently rank within the top ten leading causes of death in the United States. To date, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di migliorare gli studi secondari sulla polmonite batterica fornendo una via semplice e non invasiva di inoculazione batterica nel tratto respiratorio inferiore seguita dal recupero batterico e dalla purificazione dell'RNA per l'analisi della trascrizione. Ciò sarà realizzato prima anestetizzando profondamente un mouse e inserendo un ago piegato con punta smussata precaricata nella trachea di un topo che è stato sospeso verticalmente dagli incisivi mascellari. In secondo luogo, a seguito di un'infezione riuscita, le unità batteriche che formano colonie vengono recuperate per escissione e omogeneizzazione dei polmoni.L'omogeneato polmonare risultante viene diluito serialmente e placcato su un agar nutriente per enumerare le unità che formano colonie. Infine, l'RNA viene purificato dall'omogeneato polmonare. Il vantaggio di questa procedura è che consente una consegna controllata direttamente nelle vie respiratorie inferiori.Questo ci consente di esaminare sia i contributi combinatori che individuali dell'agente patogeno verso l'esito della malattia. Recenti progressi in questo campo hanno dimostrato che la regolazione genica batterica può avere un ruolo importante nel determinare l'esito dell'infezione. Questa tecnica beneficia della capacità di recuperare sia i CFU batterici che l'RNA.Una volta isolato l'RNA, possiamo quindi valutare i contributi di specifici geni di virulenza all'infezione. Inoltre, questa tecnica trae vantaggio dall'essere non chirurgica. Ciò consente di posizionare uno stress minimo su tutti gli animali utilizzati nell'ambito di questa procedura e consente loro di avere un recupero immediato.Questa procedura beneficia dell'utilizzo di attrezzature di laboratorio comuni senza l'uso di alcun tipo di cannule, fili guida o cavi in fibra ottica. Gli individui nuovi a questa tecnica possono lottare all'inizio con l'installazione effettiva attraverso la trachea. Una volta concettualizzata questa tecnica, diventa una procedura semplice ed efficace interrogare la polmonite batterica secondaria all'interno di un ospite murino.Prima di iniziare la procedura, preparare lo spazio di lavoro con le seguenti forniture: una piattaforma di intubazione, una siringa sterile da un mL, pinza sterile a punta smussata, ago sterile a punta smussata calibro 21 e due tubi conici per conservare la siringa e le pinza. Iniziare la procedura preparando gli inoculi patogeni in modo che la concentrazione finale desiderata sia ottenuta in un volume di 50 microlitri. Successivamente, l'uso di guanti sterili prepara un ago con punta smussata da uno a 1,5 pollici calibro 21 piegalo ad un angolo approssimativo di 35 gradi.Dopo aver sistemato l'ago alla siringa, disegnare un cuscino d'aria da 100 microlitri, seguito da 50 microlitri dell'agente infettivo. Il cuscino d'aria da 100 microliter assicura la piena consegna del carico patogeno una volta che la siringa è depressa. Posizionare l'ago caricato e la siringa in una posizione facilmente accessibile dalla mano dominante.Rimuovere e anestetizzare il mouse dalla camera di anestesia e sospendere il mouse sulla piattaforma di intubazione dagli incisivi mascellari. Utilizzando le forcep a punta smussata, afferrare ed estendere delicatamente la lingua. Trasferire la lingua dalle forcep nel pollice e nell'indice della mano non dominante.Rimanere tenendo la lingua nella mano non dominante e prendere la siringa precaricata. Puntare l'estremità piegata dell'ago lontano dal corpo. Inserire l'ago nella cavità orale.Alla base della lingua inclinare delicatamente il polso per causare una leggera spinta dell'ago lontano dal corpo. Questa azione assicura che l'ago venga inserito nella trachea e non nell'esofago. Guida lentamente l'ago verso il basso nella trachea.Spesso si sente un leggero segno di spunta mentre l'ago passa attraverso la piega vocale. Passare l'ago attraverso la trachea fino a quando non si sente una leggera resistenza mentre l'ago incontra la carena. Sollevare leggermente l'ago nella direzione verso l'alto per sospendere l'ago sopra la carena.Ciò consente la consegna nei bronchi primari. Deprimere completamente lo stantuffo della siringa per fornire il carico infettivo. Rimuovere l'ago dalla trachea e scartare.Rimuovere il mouse dalla piattaforma di intubazione deprimendo l'elastico, ma continuare a tenere il mouse in posizione verticale. Ostruire le vie aeree nasali posizionando un dito direttamente sopra i nares. Mantenere questa posizione per circa un minuto o fino a quando non si osservano diversi respiri profondi.Quest'ultimo passaggio assicura che il volume totale dell'inoculo sia consegnato nelle vie respiratorie inferiori. Riportare l'animale nella sua gabbia e assicurarsi che ci sia un rapido recupero dall'anestesia. In determinati punti di tempo i polmoni infetti possono essere asportati per quantificare e valutare i contributi batterici all'aumento delle morbilità associate alla polmonite batterica secondaria.Preparare uno spazio di lavoro con i seguenti elementi: una bilancia e una barca di pesata sterile, una piattaforma di dissezione, un kit di dissezione contenente forbici e forcep e garza sterile. Ai fini di questa dimostrazione l'escissione dei polmoni verrà eseguita su un banco. Tuttavia, al fine di mantenere la sterilità durante questa procedura si raccomanda di eseguire l'escissione polmonare all'interno di una cappa a flusso laminare.Eutanasia di un topo infetto con CO2 o un metodo di eutanasia approvato dalla IACUC simile. Posizionare e fissare il mouse infetto sulla piattaforma di dissezione. Spruzzare il topo con etanolo per mantenere la sterilità sulle superfici di lavoro.A partire dall'ombelico, utilizzare un paio di forcelle per sollevare la pelle e fare un'incisione verso la laringe. Afferrando la pelle su entrambi i lati dell'incisione iniziale, allontanare la pelle dal corpo e tagliare le connessioni tissutali. Può essere utile effettuare tagli laterale sulla pelle per rivelare più della regione toracica.Partendo dalla base del processo xifoide, fare una piccola incisione con l'intenzione di forare il diaframma. Ciò si traduce in un aumento della pressione nella cavità toracica causando la retrazione dei polmoni. Con i polmoni retratti, continuare l'incisione per liberare il diaframma.Rimuovere le costole facendo un'incisione su entrambi i lati. Questo esporrà la cavità toracica e i polmoni. Per asportare i polmoni afferrare la base del cuore con le forcep e sollevare verso l'alto.Posizionare le forbici dietro i polmoni e iniziare a fare piccole incisioni attraverso le connessioni tissutali continuando a sollevare il cuore verso l'alto. Una volta che i polmoni sono stati asportati, posizionarli su una garza sterile e rimuovere il cuore sollevandolo dai polmoni e tagliando le restanti connessioni tissutali. Trasferire i polmoni sulla barca di pesatura pre-tarata e registrare la massa.Dopo aver pesato i polmoni, trasferire i polmoni in soluzione salina sterile tamponata da fosfati e conservarli temporaneamente sul ghiaccio. Ora che i polmoni sono stati asportati e pesati, i batteri possono essere recuperati per determinare il loro ruolo verso la patogenesi. In preparazione al recupero batterico, saranno necessarie le seguenti forniture: una smerigliatrice tissutale, PBS sterile privo di RNasi, RLT tampone integrato con beta-mercaptoetanolo e tubi di microcentrifugo senza RNasi da 1,5 ml.Inizia aggiungendo prima un mL di PBS sterile privo di RNasi alla smerigliatrice tissutale. Una volta riempito, conservare la smerigliatrice di tessuto sul ghiaccio. Successivamente, preparare una serie di tubi di diluizione seriale sterili senza RNasi per quantificare la carica batterica recuperata dai polmoni infetti.Trasferire i polmoni nella smerigliatrice di tessuto preparata e omogeneizzare accuratamente il tessuto premendo sul piedistallo mentre si ruota. Aprire la smerigliatrice tissutale e aliquota 100 microlitri del campione omogeneizzato nel primo dei tubi di diluizione seriali preparati. Diluire serialmente i campioni e la piastra sull'agar nutriente per enumerare le unità che formano la colonia.I CFC possono essere registrati come CFC per mL o CFC per mL, per milligrammo di tessuto polmonare. Dopo aver rimosso l'aliquota di 100 microliter, sostituire il piedistallo di macinazione e centrifugare il campione a 4.000 giri/min per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, rimuovere il supernatante dal campione pelletato.Il supernatante può essere salvato e conservato a meno 80 gradi Celsius per ulteriori analisi in un secondo momento. Sospendere di nuovo il pellet di tessuto omogeneizzato in 700 microlitri di beta-mercaptoetanolo RLT e trasferire il campione in un tubo di centrifuga sterile privo di RNasi da 1,5 ml. A questo punto il campione può essere conservato a meno 80 gradi.L'RNA può essere purificato dal liquame omogeneato polmonare RLT caricando il campione in un tubo di microcentrifugo da due ml contenente perline di silice da 1 millimetro ed elaborato tramite un battitore di perline per 20 secondi a sei metri al secondo. L'RNA viene quindi immediatamente purificato usando un adattamento del metodo RNeasy come riportato in Voyich, et al. Methods in Molecular Biology"2008, e descritto nel manoscritto che accompagna questo video.Dopo la purificazione, la resa dell'RNA può essere quantificata utilizzando uno spettrofotometro. Una volta quantificato, è utile diluire l'RNA risultante in diverse aliquote di 50 nanogrammi per microlitro. Ciò consente di utilizzare l'RNA del campione per più analisi senza essere soggetto a cicli multipli di congelamento-scongelamento.L'uso di questa tecnica consente l'installazione di un carico patogeno controllato direttamente nelle vie respiratorie inferiori. L'efficienza di questo sistema di erogazione può essere dimostrata attraverso l'installazione di una soluzione blu brillante 1%Coomassie. La riga superiore mostra un paio di polmoni non infetti per fungere da controllo, mentre la riga inferiore mostra un paio di polmoni che hanno ricevuto 50 microlitri della tintura blu brillante 1%Coomassie attraverso un'installazione intratracheale.L'uso di questo colorante dimostra come l'installazione intratracheale fornisca una distribuzione uniforme del carico patogeno nei polmoni sinistro e destro e in tutti i polmoni sinistro. Una volta infettato, il carico patogeno può essere recuperato e analizzato in vari punti di tempo dopo l'installazione intratracheale mediante escissione e omogeneizzazione del tessuto polmonare. Per dimostrare l'efficienza di questa tecnica di recupero due gruppi contenenti tre topi ciascuno sono stati infettati da una dose bassa e alta di Staphylococcus aureus.L'input batterico è stato placcato sull'agar nutriente per enumerare i CFC. Un'ora dopo l'installazione intratracheale, i topi sono stati eutanasiati, i polmoni asportati e omogeneizzati in una smerigliatrice tissutale. Il tessuto omogeneizzato è stato diluito serialmente e placcato su agar nutriente per enumerare i CFC.L'RNA isolato dal tessuto polmonare omogeneizzato può essere esaminato mediante PCR con trascrittasi inversa e utilizzato per quantificare l'abbondanza relativa di trascrizione dei geni bersaglio. Per garantire una contaminazione minima del DNA di fondo si raccomanda di eseguire una reazione PCR, senza l'aggiunta di trascrittasi inversa, insieme a eventuali reazioni qRT-PCR. Oltre ai carichi batterici, questa tecnica può essere estesa all'installazione e all'isolamento di carichi virali.Dopo l'omogeneizzazione del tessuto polmonare, l'RNA virale può essere isolato e utilizzato per misurare l'abbondanza di trascrizione di geni virali o costruire una curva standard per la quantificazione virale. L'uso di questo sistema fornisce un sistema altamente efficiente e riproducibile per studiare la polmonite batterica secondaria. Una volta padroneggiata, questa procedura può essere utilizzata in esperimenti su larga scala.Lavorando in lotti per eutanasiare i topi, l'installazione intratracheale può avvenire entro 30 secondi per mouse. Una volta completato questo, passando all'escissione dei polmoni, questo può essere completato in circa due o tre minuti per topo. Mentre i metodi qui discussi erano stati nel contesto di un'infezione batterica secondaria, possono essere estesi a qualsiasi procedura in cui sia necessario un parto controllato e il recupero di un inoculo.Oltre ai metodi qui descritti, questa procedura può essere integrata dall'aggiunta di un lavaggio broncoalveolare prima dell'escissione dei polmoni. Mentre questo spesso si traduce in una diminuzione del recupero del carico patogeno, beneficia dell'ottenimento di dati, come l'analisi delle citochine, l'attività della lattato deidrogenasi e l'identificazione di diverse popolazioni cellulari. Per ottenere una comprensione più completa della patogenesi della malattia diventa importante interrogare sia i contributi dell'ospite che degli agenti patogeni alla malattia.Lo scopo di questo video era quello di fornire un metodo semplice ed efficiente per esplorare la polmonite batterica secondaria all'interno di un ospite murino.

Research

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Sviluppo di un marcatore negativo selezionabile per Entamoeba histolytica</em

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Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

L&#39;uso del Modello EpiAirway per Caratterizzare a lungo termine interazioni ospite-patogeno

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Reverse Genetics recupero mediato del Infettive Norovirus Murine

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