Name: a precise pathogen delivery and recovery system for murine models of secondary bacterial pneumonia
Uploaded: 2019-09-21T13:00:00
Duration: 13 s
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Los autores agradecieron a Nicole Meissner, M.D./Ph.D., De la Universidad Estatal de Montana, por su ayuda en el establecimiento del método de insinscripción intratraal. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (Grants NIH-1R56AI135039-01A1, GM110732, R21AI128295, U54GM115371), así como fondos de la Iniciativa de Investigación del Sistema Universitario de Montana (51040-MUSRI2015-03) y la Iniciativa de Investigación del Sistema Universitario de Montana (51040-MUSRI2015-03) y la Universidad Estatal de Montana Estación Experimental Agrícola.

Todos los métodos se ajustan a las directrices de los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de Montana.
1. Insinsatación intratraal
<ol><li>Prepare un espacio de trabajo que contenga los siguientes suministros: una plataforma de intubación, una jeringa estéril de 1 ml, fórceps estériles con puntas romas, aguja estéril de punta contundente de calibre 21 y dos tubos cónicos para almacenar la jeringa y fórceps. NOTA: Las plataformas de intubación se pueden comprar comercialmente o construir internamente. La plataforma de intubación utilizada aquí fue construida usando plexiglás de 0,25 pulgadas. En resumen, se aplicó calor al plexiglás y la placa se dobla a un ángulo interior aproximado de 65o. En el lado exterior de la plataforma de intubación, dos tornillos de la máquina fueron sembrados 3 pulgadas de distancia y una banda de goma fue suspendida entre los dos tornillos.</li>
	<li>Preparar el inóculo patógeno diluyendo en serie la muestra para obtener la concentración final deseada en un volumen total de 50 l. Almacenar el inóculo sobre hielo.</li>
	<li>Usando guantes estériles, doble una aguja de 21 G con punta sin rodeos a aproximadamente 35o. NOTA: Se necesita una aguja separada para cada ratón.</li>
	<li>Fije la aguja doblada de 21 G con punta contundente a una jeringa de 1 ml. Extraiga un cojín de aire de 100 ml en la jeringa seguido de 50 ml del agente infeccioso. Coloque la aguja cargada y la jeringa en un lugar de fácil acceso por la mano dominante.</li>
	<li>Anestetiza profundamente un ratón usando una mezcla de isoflurano/oxígeno del 4% o un método de anestesia aprobado por la IACUC similar. La profundidad adecuada de la anestesia se obtiene típicamente cuando las tasas de respiración disminuyen a aproximadamente 1 inhalación por 5-8 s y se puede confirmar pellizcando un apéndice y observando ninguna reacción del ratón. NOTA: Este método de anestesia proporcionó una duración de anestetización suficiente de aproximadamente 1,5 min. Esto fue suficiente para que los miembros de nuestro laboratorio aprendieran y realizaran este procedimiento de instilación; sin embargo, otros métodos de anestesia aprobados institucionalmente pueden emplearse11,12,13.</li>
	<li>Retire el ratón anestesiado de la cámara de anestesia y suspenda el ratón en la plataforma de intubación de los incisivos maxilares.</li>
	<li>Para abrir un pasaje claro hacia la tráquea, usa los fórceps con puntas romas para agarrar y extender suavemente la lengua fuera de la boca. Transfiera la lengua de los fórceps al pulgar y al dedo índice de la mano no dominante.</li>
	<li>Permanezca sosteniendo la lengua en la mano no dominante y recoja la jeringa precargada. Apunte el extremo doblado de la aguja lejos del cuerpo e inserte la aguja en la cavidad oral a la base de la lengua.</li>
	<li>Con la aguja en la base de la lengua, angulo suavemente la muñeca para causar un ligero empujón de la aguja lejos del cuerpo. Este paso asegura que la aguja se insertará en la tráquea y no en el esófago.</li>
	<li>Guiar lentamente la aguja hacia abajo en la tráquea; a menudo se siente una garrapata leve a medida que la aguja pasa a través del pliegue vocal. Pase la aguja a través de la tráquea hasta que se sienta una ligera resistencia a medida que la aguja se encuentra con la carina.</li>
	<li>Levante ligeramente la aguja en la dirección proximal para suspender la aguja por encima de la carina. Esto permite el parto en los dos bronquios primarios. Presione completamente el émbolo de la jeringa para entregar la carga infecciosa. Retire la aguja de la tráquea levantando hacia arriba y deseche.</li>
	<li>Retire el ratón de la plataforma de intubación presionando la banda de goma, pero mantenga el ratón en posición vertical. Obstruir las vías respiratorias nasales colocando un dedo directamente sobre las nares. Mantenga esta posición durante aproximadamente 1 min o hasta que se observen varias respiraciones profundas. NOTA: Este último paso garantiza que el volumen total del inóculo se entregue en el tracto respiratorio inferior.</li>
	<li>Devuelva el ratón a su jaula y observe una recuperación completa de la anestesia.</li>
</ol>2. Escisión de los pulmones infectados
<ol><li>Trabajando dentro de una campana de flujo laminar para mantener la esterilidad, prepare un espacio de trabajo con los siguientes elementos: una báscula y un bote de pesaje estéril, una plataforma de disección, un kit de disección que contenga tijeras y fórceps, PBS estéril libre de ARS y gasa estéril.</li>
	<li>Euthanizar un ratón infectado con CO2 o similar IACUC aprobado método de eutanasia.</li>
	<li>Coloque un ratón infectado en una plataforma de disección y fije el ratón con alfileres al final de cada apéndice. Rocíe el ratón con etanol para ayudar a mantener la esterilidad de las superficies de trabajo.</li>
	<li>Comenzando en el umbilicus, usa un par de fórceps para levantar la piel y hacer una incisión hasta la base de la tráquea. Sujetar la piel a ambos lados de la incisión inicial, alejar la piel del cuerpo y cortar las conexiones tisulares. NOTA: Puede ser útil hacer varios cortes laterales a través de la piel para revelar más de la región torácica.</li>
	<li>Comenzando en la base del proceso de xifoide, haga una pequeña incisión con la intención de puncturar el diafragma. Esto resulta en un aumento en la presión en la cavidad torácica que hace que los pulmones se retraigan. Con los pulmones retraídos continuar la incisión para liberar el diafragma.</li>
	<li>Retire las costillas haciendo una incisión a lo largo de ambos lados de la caja torácica. Esto expondrá completamente la cavidad torácica y los pulmones.</li>
	<li>Para extirpar los pulmones, agarre la base del corazón con los fórceps y levántese hacia arriba. Coloque las tijeras detrás de los pulmones y comience a hacer pequeñas incisiones a través de las conexiones de tejido mientras continúa hasta levantar el corazón hacia arriba.</li>
	<li>Una vez que los pulmones hayan sido extirpados, colóquelos sobre la gasa estéril y retire el corazón. El corazón se puede extraer fácilmente al levantarlo de los pulmones con los fórceps y cortar las conexiones de tejido restantes.</li>
	<li>Transfiera los pulmones a un bote de pesaje pre-tared y registre el peso.</li>
	<li>Después de que los pulmones hayan sido pesados, transfiéralos a la solución salina tamponada de fosfato estéril (PBS) y guárdelos temporalmente en hielo hasta avanzar a los pasos de recuperación y análisis de patógenos.</li>
</ol>3. Recuperación y Análisis de Patógenos
<ol><li>Continuando trabajando dentro de una campana de flujo laminar, prepare un espacio de trabajo con los siguientes suministros: una trituradora de tejido, PBS estéril libre de ARSa, Buffer RLT complementado con mercaptoetanol (1:100) y tubos de microcentrífuga sin ARDes de 1,5 ml. ADVERTENCIA: El mercaptoetanol puede ser peligroso en caso de contacto con la piel, ingestión, contacto con los ojos o inhalación. La dilución de é-mercaptoetanol en el tampón RLT debe hacerse en una campana de humo.</li>
	<li>Comience agregando primero 1 ml de PBS estéril libre de ARS a la trituradora de tejido. Una vez lleno, guarde la trituradora de tejido en hielo.</li>
	<li>Preparar una serie de tubos de dilución en serie estériles libres de ARSa que se utilizarán para cuantificar la carga bacteriana recuperada de los pulmones infectados. Esto se logra más fácilmente alísando 900 l de agua estéril en cada tubo de microcentrífuga seguido de dilución en serie del inóculo patógeno. NOTA: El número de tubos de dilución necesarios para la enumeración precisa de patógenos variará en función de la entrada inicial de patógenos y la duración de la infección. Esto debe ser empíricamente determinado.</li>
	<li>Usando fórceps estériles, transfiera los pulmones a la trituradora de tejido preparada y homogeneice completamente el tejido presionando hacia abajo sobre el pedestal mientras gira.</li>
	<li>Abra la trituradora de tejido y la alícuota de 100 ml de la muestra homogeneizada en el primero de los tubos de dilución en serie preparados. Diluir en serie las muestras y enumerar las UFC mediante el enchapado en el agar nutritivo. Las UFC se pueden registrar como UFC/ml o UFC/mL/mg de tejido pulmonar. NOTA: En este paso se pueden extraer 200 oC adicionales de la muestra homogeneizada para la purificación del ARN viral (ver Tabla de Materiales)o almacenarse a -80 oC para su análisis futuro.</li>
	<li>Después de que las alícuotas hayan sido retiradas para la determinación de la UFC y/o el aislamiento viral del ARN, sustituya el pedestal de molienda y peletice el tejido homogeneizado por centrifugación a 4.000 rpm (3724 x g)durante 10 min a 4 oC.</li>
	<li>Con una pipeta, retire el sobrenadante de la muestra peletada y colóquelo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. NOTA: El sobrenadante está libre de bacterias y se puede almacenar a -80 oC para el análisis de los factores de patógenos secretos y huésped soluble.</li>
	<li>Resuspenda el pellet de tejido homogeneizado pipeteando o vórtice en 700 ml de tampón RLT-o-mercaptoetanol y transfiera la muestra a un tubo estéril de microcentrífuga libre de ARVsa de 1,5 ml. NOTA: En este punto, las muestras se pueden almacenar a -80 oC durante varios meses.</li>
	<li>Purificar el ARN utilizando ligeras modificaciones al protocolo del fabricante de un kit de purificación (ver Tabla de Materiales); véase Voyich et al. 200814.<ol>
<li>Transfiera la suspensión pulmonar homogeneizada a un tubo de microcentrífuga de 2 ml que contenga perlas de sílice de 0,1 mm y se procese a través de un batidor de perlas durante 20 s a 6 m/s.</li>
		<li>Centrifugar la muestra a 1.500 rpm durante 3 minutos. Después de la centrifugación, pipetee el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.</li>
		<li>Añadir 350 s l de etanol de 96%-100% a la muestra y mezclar a fondo mediante pipeteo o inversión.</li>
		<li>Transfiera 700 l de la muestra a una columna de purificación colocada en un tubo de recogida de 2 ml. Centrifugar la muestra a 8.000 x g durante 15 s y desechar el flujo. Ejecute cualquier muestra de exceso a través de la misma columna como se describió anteriormente.</li>
		<li>Lavar la columna con 700 ml de tampón RW1 y una muestra de centrífuga a 8.000 x g durante 15 s. Deseche el flujo y transfiera la columna de membrana de sílice a un nuevo tubo de recogida de 2 ml.</li>
		<li>Aplique 500 l de RPE de búfer a la columna. Lavar la columna por centrifugación a 8.000 x g durante 15 s. Deseche el flujo.</li>
		<li>Aplique 500 l adicionales de RPE tampón a la columna RNeasy y centrífuga a 8.000 x g durante 2 min. Deseche el flujo a través y centrifuque la columna a 10.000 x g durante 1 min.</li>
		<li>Para eluir el ARN purificado, comience transfiriendo la columna a un nuevo tubo de microcentrífuga libre de ARNide de 1,5 ml. Pipetear 50 l de agua libre de RNase directamente sobre la membrana de sílice-gel de la columna y centrifugar a 8000 x g durante 1 min. NOTA: El ARN eludado se puede ejecutar sobre la misma columna de nuevo para aumentar el rendimiento del ARN.</li>
		<li>Añadir 50 l de agua libre de RNase al ARN purificado para llevar el volumen total a 100 ol. Aliquot 350 l de RLT-o-mercaptoetanol seguido de 250 ml de etanol del 96%-100% a la muestra y mezclar a fondo mediante pipeteo o inversión.</li>
		<li>Aplicar la muestra a una columna de purificación colocada en un tubo de recogida y centrifugar a 8000 x g durante 15 s. Deseche el flujo y reemplace el tubo de recogida.</li>
		<li>Lavar la columna añadiendo 350 ml de tampón RW1 seguido de centrifugación a 8000 x g durante 15 s.</li>
		<li>Preparar una solución de DNase que contenga aproximadamente 27 unidades de Kunitz añadiendo 10 ml de stock de DNase (750 unidades de Kunitz/ml) a 70 l de RDD tampón. Añadir 80 ml de solución de DNase directamente sobre la membrana de sílice-gel e incubar la muestra durante 15 minutos a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave la columna con 350 ml de tampón RW1 y centrífuga a 8000 x g durante 15 s y deseche el flujo.</li>
		<li>Repita los pasos 3.9.6–3.9.8 para purificar el ARN. NOTA: Se recomienda repetir el procedimiento de limpieza del ARN siguiendo los pasos 3.9.9–3.9.10 y 3.9.6–3.9.8 (omita los pasos 3.9.11–3.9.13 de DNase). Esta limpieza adicional resulta en ARN de muy alta calidad.</li>
	</ol></li>
	<li>El rendimiento del ARN se puede cuantificar utilizando un espectrofotómetro con lecturas a 260 nM para determinar la concentración y 260:280 nM para la pureza. Una vez obtenido el rendimiento del ARN, estandarizar la concentración de cada muestra de ARN a 50 ng/L. NOTA: Se recomienda hacer múltiples alícuotas a una concentración de 50 ng /L para evitar ciclos de congelación/descongelación que pueden conducir a la degradación del ARN.</li>
	<li>Almacene el ARN purificado a -80 oC o utilícelo inmediatamente para el análisis de transcripción. NOTA: En publicaciones anteriores, el ARN de 3 a 5 ratones se agrupaba para el análisis de transcripciones. A través de la optimización de la técnica anterior, el ARN de 1 ratón se ha determinado empíricamente como suficiente para el análisis de transcripción (80-120 ng / L).</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

El uso de este modelo proporciona un método altamente eficiente y reproducible para estudiar las infecciones bacterianas secundarias. La capacidad de controlar estrechamente la entrega del inóculo patógeno permite observaciones más precisas de los efectos individuales y combinatoriales de cada patógeno. Las ineficiencias en la vía de la instilación intranasal más común probablemente han contribuido a las discrepancias en los volúmenes de dosis y las concentraciones presentes en la literatura. Es razonable que la falta de un sistema murino preciso para estudiar la neumonía bacteriana secundaria haya retrasado los hallazgos que identifican respuestas específicas bacterianas que contribuyen a la gravedad de las coinfecciones pulmonares. El desarrollo de un modelo reproducible para estudiar la expresión de virulencia durante las infecciones bacterianas secundarias podría conducir a la identificación de vacunas o dianas farmacológicas para mejorar estas infecciones.
El paso de la instilación intratraal es crítico para establecer con éxito una infección del tracto respiratorio inferior y cualquier análisis aguas abajo de los patógenos. Al aprender esta técnica, puede ser útil practicar usando un tinte (como se describe en los métodos) antes de administrar material infeccioso. El uso de un tinte permite la visualización directa del inóculo en el tracto respiratorio. Un error común que puede ocurrir es la inserción de la aguja contundente en el esófago en lugar de la tráquea. Esto resultará en la entrega del inóculo en el estómago en lugar de los pulmones. Para corregir este error, angulo la aguja más lejos del cuerpo y pasarla hacia abajo en la tráquea. Una vez masterizado, este procedimiento es muy eficiente y se puede utilizar para llevar a cabo experimentos con un gran número de ratones. Trabajando en lotes para anestesiar ratones, la instilización intratraal se puede completar en aproximadamente 30 segundos por ratón. Además, la escisión de los pulmones se puede completar en 2 a 3 minutos por ratón.
La recuperación del ARN bacteriano viable y puro de los tejidos infectados es fundamental para el análisis de transcripciones. Las RNases son omnipresentes y pueden arruinar rápidamente un experimento15. Algunos métodos incluyen el uso de inhibidores de la RNase; sin embargo, hemos descubierto que congelar la muestra a -80 oC en RLT-o-mercaptoetanol o procesar inmediatamente la muestra para el aislamiento de ARN utilizando todos los tubos y reactivos libres de RNase son eficaces para reducir la contaminación por RNase. Además, recomendamos que se purifique un máximo de seis muestras a la vez. La inclusión de más de seis muestras puede dar lugar a latencias prolongadas entre los pasos del protocolo que pueden culminar en la degradación del ARN. Una vez purificado, también se debe tener cuidado de evitar cualquier ciclos innecesarios de congelación-descongelación. Por lo tanto, si se realizan múltiples análisis en una muestra, se recomienda alísarse con ARN purificado para su almacenamiento a -80 oC.
Además de las técnicas revisadas aquí, este método se puede complementar realizando lavado salveolar bronquial antes de la escisión y homogeneización de los pulmones16. Esto se puede lograr mediante el lavado de todo el tracto respiratorio inferior o mediante el uso de hilo de sutura para restringir un brazo ramificado del árbol bronquial seguido de lavado a través de la rama restante. A menudo esto conduce a una reducción en la recuperación de la carga de patógenos, pero proporciona una muestra con lo cual se puede obtener información como la actividad de lactato deshidrogenasa, la identidad de la población celular y los perfiles de citoquinas16. Juntos, estos datos pueden formar una comprensión más completa de las interacciones huésped-patógeno que se producen durante la neumonía bacteriana secundaria.
Si bien los métodos discutidos han sido en el contexto de la neumonía bacteriana secundaria, son adecuados para extenderse a cualquier modelo murino de infección respiratoria inferior; específicamente, aquellos que se beneficiarían de la entrega y recuperación del inóculo instalado. Además, al igual que muchas otras vías de infección, la instilación intratraal se puede utilizar en aplicaciones no infecciosas, como la administración de terapias y compuestos ambientales12.

La neumonía bacteriana secundaria tras la infección por gripe es una de las principales causas de muerte en los Estados Unidos y un área activa de investigación1,2. A pesar de numerosos estudios utilizando modelos murinos de neumonía bacteriana secundaria, las incoherencias con respecto a la inscriplación e interrogación de patógenos siguen siendo3,4,5. Además, si bien muchos esfuerzos anteriores se han centrado en los efectos inmunomoduladores de la gripe que conducen a un aumento susceptible mente a una infección bacteriana secundaria, datos más recientes sugieren que la regulación de la virulencia del patógeno bacteriano es igual contribuyente al establecimiento de la enfermedad6,7,8,9. Estos nuevos datos requieren un método más preciso para explorar la neumonía bacteriana secundaria en modelos murinos de coinfección que facilitan la investigación de la respuesta del patógeno.
Los organismos huésped, exclusivos de los modelos de coinfección de la gripe, se inmunovenla intencionalmente por una infección por gripe primaria antes de la administración del agente bacteriano secundario. Con el fin de replicar mejor la patogénesis de la enfermedad observada en los huéspedes humanos, es imperativo que la carga de patógenos de los agentes primarios y secundarios se controle para observar los efectos individuales y combinatoriales de cada agente infeccioso. Más comúnmente, las infecciones respiratorias en ratones se han establecido a través de una administración intranasal3,4,5,6,10. En la medida en que esta ruta se observa por ser técnicamente simple y puede ser apropiada en algunas aplicaciones de infección de un solo agente, no es adecuada para los modelos de coinfección, ya que los procedimientos de instilación, los volúmenes de dosis y la eficacia son muy variables dentro de literatura publicada3,4,5,6.
Para obtener una comprensión más completa de la patogénesis de la neumonía bacteriana secundaria, se deben considerar las contribuciones tanto del huésped como del patógeno. Para ello, hemos desarrollado un enfoque sencillo y reproducible para la recuperación de bacterias viables y ARN patógeno de los pulmones infectados. Este método utiliza un procedimiento de instilación intratraal simplificada y no invasiva seguido de un posterior aislamiento del ARN bacteriano. El procedimiento de insculación intratraal descrito en el presente documento es similar a los métodos descritos anteriormente y no se limita a la administración de patógenos11,12,13. El uso de este procedimiento en particular se beneficia de ser de bajo costo y no requiere el uso de equipos especializados tales como cánulas, cables guía o cable de fibra óptica; además, debido a que este procedimiento no es invasivo, asegura un estrés mínimo en sujetos murinos, minimiza una respuesta inflamatoria de la mecánica de la inoculación y proporciona una vía de entrega eficiente para la infección de múltiples sujetos. Brevemente, los ratones anestetizados con isoflurano se suspenden de los incisivos. Los fórceps se utilizan para agarrar suavemente la lengua seguido de la inserción de una aguja precargada doblada, con punta contundente y calibre 21 en la tráquea y la entrega de carga de patógenos. La validación de este procedimiento se demuestra mediante la confirmación visual del tinte distribuido equitativamente en el compartimento pulmonar y la recuperación de la carga bacteriana. A continuación, demostramos cómo recuperar viable Staphylococcus aureus (S. aureus) de los pulmones infectados y describir un método reproducible para aislar el ARN patógeno de alta calidad.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix B</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>6911100</td>
			<td>Referred to in text as &#34;0.1 mm silica beads&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-gauge blunt needle</td>
			<td>SAI</td>
			<td>B21-150</td>
			<td>1.5&#34; is recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>DNase used in the accompanying text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 Classic Instrument</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116004500</td>
			<td>FastPrep FP120 is no longer available. Referred to in text as &#34;Bead Beater&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan AIV-Matrix Reagents</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4405543</td>
			<td>Influenza A M-segment qRT-PCR kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intubation Stand</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>ETI-MES-01</td>
			<td>Referred to in text as &#34;intubation platform.&#34; Intubation platform used in the accompanying video was made in house.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>RNA purification kit; contains RNeasy columns, Buffer RLT, Buffer RW1, and Buffer RPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52904</td>
			<td>Viral RNA purification kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Grinders</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-542-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (&#946;-Mercaptoethanol)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>UN2966</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a precise pathogen delivery and recovery system for murine models of secondary bacterial pneumonia

Las neumonías bacterianas secundarias después de las infecciones por gripe se sitúan constantemente entre las diez principales causas de muerte en los Estados Unidos. Hasta la fecha, los modelos murinos de coinfección han sido la principal herramienta desarrollada para explorar las patologías de las infecciones primarias y secundarias. A pesar de la prevalencia de este modelo, se presentan considerables discrepancias con respecto a los procedimientos de instilación, los volúmenes de dosis y las eficacias en los estudios. Además, estos esfuerzos han sido en gran medida incompletos para abordar cómo el patógeno puede estar influyendo directamente en la progresión de la enfermedad después de la infección. Aquí proporcionamos un método preciso de administración, recuperación y análisis de patógenos para ser utilizado en modelos murinos de neumonía bacteriana secundaria. Demostramos que la insinsatación intratraal permite una entrega eficiente y precisa de volúmenes controlados directa y uniformemente en las vías respiratorias inferiores. Los pulmones se pueden extirpar para recuperar y cuantificar la carga de patógenos. Después de la escisión de los pulmones infectados, describimos un método para extraer ARN patógeno de alta calidad para el análisis transcripcional posterior. Este procedimiento se beneficia de ser un método no quirúrgico de parto sin el uso de equipos de laboratorio especializados y proporciona una estrategia reproducible para investigar las contribuciones de patógenos a la neumonía bacteriana secundaria.

La Figura 1 utiliza una solución azul brillante Coomassie de peso/volumen del 0,1% para demostrar que una insitación intratraal entrega el inóculo directa y uniformemente dentro del tracto respiratorio inferior. La Figura 2 muestra que las bacterias (S. aureus) UFC se recuperaron directamente del tejido pulmonar homogeneizado. La Figura 3 demuestra el uso de este sistema para la entrega y recuperación precisa del inóculo en el tracto respiratorio inferior trazando las UFC de entrada y recuperación de ratones individuales. La Figura 4 muestra la curva de amplificación qRT-PCR del gen de limpieza bacteriana gyrB para demostrar que el ARN bacteriano se puede extraer directamente del tejido pulmonar infectado con una contaminación mínima del ADN. La Figura 5 muestra la construcción de una curva estándar utilizando la amplificación qRT-PCR del segmento M del virus de la gripe A para demostrar que el ARN viral se puede extraer directamente del tejido pulmonar infectado.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig01.jpg"> Figura 1: La insinsatación intratraal permite una distribución uniforme en el tracto respiratorio inferior. (A, B) Los pulmones no infectados fueron extirpados de un ratón sano después de la insinsinfección intratraal de PBS estéril y fotografiados desde (A) dorsal y (B) perspectivas ventrales. (C, D) 50 l de una solución azul brillante Coomassie al 0,1% se administró a un ratón anestesiado a través de la administración intratraal. (C) Dorsal. (D) Ventral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig02.jpg"> Figura 2: Recuperación representativa de las UFC bacterianas del homogeneato pulmonar infectado. Los pulmones fueron extirpado un día después del desafío con S. aureus. Después de la homogeneización, 100 l de la suspensión pulmonar se diluyó en serie a través de 10-6. Para enumerar las UFC recuperadas, se celenaron 10 oL gotas de las diluciones de 10-5 y 10-6 en el agar de soja tríptico (TSA) e incubadas a 37 oC con 5% C02 durante la noche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig03.jpg"> Figura 3: Entrega precisa y recuperación del inóculo patógeno después de la administración intratraal. Los ratones se dividieron en dos grupos que contenían tres ratones por grupo. Los ratones fueron sometidos a instilización intratraal de S. aureus a 1 x 108 (bajo) y 2 x 108 (alto) CFU/ml. Una hora después de la infección, los ratones fueron eutanasiados y los pulmones fueron extirpidos para demostrar la precisión de la insitación y recuperación. El inóculo bacteriano y las bacterias recuperadas del homogeneato pulmonar se faban en TSA (agar de soja tríptico). No se notificaron diferencias significativas entre la entrada bacteriana y la recuperación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig04.jpg"> Figura 4: Recuperación y pureza representativas del ARN bacteriano. Seis horas después de la inscripción intratraal con 1 x 108 UFC/50 l de S. aureus, se eutanasiaron ratones. Los pulmones fueron extirgados y homogeneizados seguidos de la resuspensión de la suspensión pulmonar en el tampón RLT-o-mercaptoetanol. El ARN se purificó como se describe en el paso 3.914. qRT-PCR se utilizó para detectar transcripciones del gen de limpieza bacteriana gyrB. Se incluyó un control que no contenía transcriptasa inversa (nRT) para demostrar la pureza del ARN recuperado. En un umbral de 0,1, las transcripciones de la gyrB se detectaron en un ciclo medio de 21,1, 20,3 y 20,5. No se detectaron controles nRT hasta los promedios del ciclo 35,9, 35,5 y 35,0. n 3 réplicas biológicas, que contienen 3 réplicas técnicas/replicas biológicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig05.jpg"> Figura 5: Recuperación representativa del ARN viral. Seis días después de la inscripción intratraal con 100 PFU/50 l de gripe A/PR/8/1934(H1N1), los ratones fueron eutanasiados. Los pulmones fueron extirpado y homogeneizados, y se recogieron 200 l de la suspensión homogeneizada y pasaron a través de un colador celular de 70 m antes de la purificación viral del ARN. El ARN purificado se diluyó en serie (10-1-10-4) seguido de la amplificación del segmento M de la gripe A. (A) Gráfica de amplificación del ARN de la gripe A recuperado de un pulmón infectado y diluido 10-1–10-4. (B) Curva estándar del segmento M de la gripe A. Umbral de 0,2, R2 a 0,994, pendiente -3,46. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia

Aquí, presentamos métodos para mejorar los estudios secundarios de neumonía bacteriana proporcionando una vía no invasiva de instilización en el tracto respiratorio inferior seguida de recuperación de patógenos y análisis de transcripción. Estos procedimientos son reproducibles y se pueden realizar sin equipos especializados como cánulas, cables guía o cables de fibra óptica.

Un sistema preciso de entrega y recuperación de patógenos para modelos murinos de neumonía bacteriana secundaria

Secondary bacterial pneumonias following influenza infections consistently rank within the top ten leading causes of death in the United States. To date, ...

El objetivo general de este procedimiento es mejorar los estudios secundarios de neumonía bacteriana proporcionando una vía simple y no invasiva de inoculación bacteriana en el tracto respiratorio inferior seguido de recuperación bacteriana y purificación de ARN para el análisis de transcripción. Esto se logrará primero anestesiando profundamente un ratón e insertando una aguja doblada con puntas contundentes precargada en la tráquea de un ratón que ha sido suspendida verticalmente de los incisivos maxilares. En segundo lugar, después de una infección exitosa, las unidades bacterianas formadoras de colonias se recuperan por escisión y homogeneización de los pulmones.El homogeneato pulmonar resultante se diluye en serie y se encuina en el agar nutritivo para enumerar las unidades formadoras de colonias. Por último, el ARN se purifica a partir del homogeneizado pulmonar. Las ventajas de este procedimiento es que permite un parto controlado directamente en el tracto respiratorio inferior.Esto nos permite examinar tanto las contribuciones combinatorias como las individuales del patógeno hacia el resultado de la enfermedad. Los avances recientes en este campo han demostrado que la regulación de genes bacterianos puede tener un papel importante en la determinación del resultado de la infección. Esta técnica se beneficia de la capacidad de recuperar tanto las UFC bacterianas como el ARN.Una vez que el ARN está aislado, podemos evaluar las contribuciones de genes de virulencia específicos hacia la infección. Además, esta técnica se beneficia de ser no quirúrgico. Esto permite un tensión mínima en cualquier animal utilizado dentro de este procedimiento y les permite tener una recuperación inmediata.Este procedimiento se beneficia del uso de equipos de laboratorio comunes sin el uso de ningún tipo de cánulas, cables guía o cables de fibra óptica. Individuos nuevos en esta técnica pueden luchar al principio con la instalación real a través de la tráquea. Una vez que esta técnica se conceptualiza, se convierte en un procedimiento simple y eficaz para interrogar la neumonía bacteriana secundaria dentro de un huésped murino.Antes de comenzar el procedimiento, prepare el espacio de trabajo con los siguientes suministros: una plataforma de intubación, una jeringa estéril de un ml, fórceps estériles con puntas romas, aguja estéril de punta contundente de calibre 21 y dos tubos cónicos para almacenar la jeringa y los fórceps. Comience el procedimiento preparando los inóculos patógenos para obtener la concentración final deseada en un volumen de 50 microlitros. A continuación, con guantes estériles, prepare una aguja de punta contundente de calibre de 1,5 pulgadas y 21 doblándola a un ángulo aproximado de 35 grados.Después de fijar la aguja a la jeringa, extraiga un cojín de aire de 100 microlitros, seguido de 50 microlitros del agente infeccioso. El cojín de aire de 100 microlitros garantiza la entrega completa de la carga del patógeno una vez que la jeringa está deprimida. Coloque la aguja y la jeringa cargadas en un lugar de fácil acceso con la mano dominante.Retire y anestesice el ratón de la cámara de anestesia y suspenda el ratón en la plataforma de intubación de los incisivos maxilares. Usando los fórceps de punta contundente, agarre suavemente y extienda la lengua. Transfiera la lengua de las fuerzas al pulgar hacia el pulgar y el dedo índice de la mano no dominante.Permanezca sosteniendo la lengua en la mano nonteminante y recoja la jeringa precargada. Apunte el extremo doblado de la aguja lejos del cuerpo. Inserte la aguja en la cavidad oral.En la base de la lengua ángulo suavemente la muñeca para causar un ligero empuje de la aguja lejos del cuerpo. Esta acción asegura que la aguja se inserte en la tráquea y no en el esófago. Guía lentamente la aguja hacia abajo en la tráquea.A menudo se siente una ligera garrapata a medida que la aguja pasa a través del pliegue vocal. Pase la aguja a través de la tráquea hasta que se sienta una ligera resistencia mientras la aguja encuentra la carina. Levante ligeramente la aguja en la dirección ascendente para suspender la aguja por encima de la carina.Esto permite la entrega en los bronquios primarios. Presione completamente el émbolo de la jeringa para entregar la carga infecciosa. Retire la aguja de la tráquea y deseche.Retire el ratón de la plataforma de intubación presionando la banda de goma, pero mantenga el ratón en posición vertical. Obstruya las vías respiratorias nasales colocando un dedo directamente sobre las narinas. Mantenga esta posición durante aproximadamente un minuto o hasta que se observen varias respiraciones profundas.Este último paso asegura que el volumen total de inóculo se entregue en el tracto respiratorio inferior. Devolver el animal a su jaula y asegurarse de que hay una pronta recuperación de la anestesia. En puntos de tiempo seleccionados después de la infección, los pulmones infectados pueden extirparse para cuantificar y evaluar las contribuciones bacterianas al aumento de las morbilidades asociadas con la neumonía bacteriana secundaria.Prepare un espacio de trabajo con los siguientes artículos: una báscula y un bote de pesaje estéril, una plataforma de disección, un kit de disección que contenga tijeras y fórceps, y gasa estéril. A los efectos de esta demostración, la escisión de los pulmones se realizará en un banco. Sin embargo, con el fin de mantener la esterilidad durante todo este procedimiento se recomienda que la escisión pulmonar se realice dentro de una campana de flujo laminar.Eutanasia un ratón infectado con CO2 o método similar aprobado por la IACUC de eutanasia. Coloque y asegure el ratón infectado en la plataforma de disección. Rocíe el ratón con etanol para mantener la esterilidad en las superficies de trabajo.Comenzando en el umbilicus, usa un par de fórceps para levantar la piel y hacer una incisión hacia la laringe. Agarrar la piel a ambos lados de la incisión inicial, alejar la piel del cuerpo y cortar a través de las conexiones del tejido. Puede ser útil hacer cortes laterales a través de la piel para revelar más de la región torácica.Comenzando en la base del proceso de xifoide, hacer una pequeña incisión con la intención de perforar el diafragma. Esto resulta en un aumento de la presión en la cavidad torácica haciendo que los pulmones se retraigan. Con los pulmones retraídos, continúe la incisión para liberar el diafragma.Retire las costillas haciendo una incisión a cada lado. Esto expondrá la cavidad torácica y los pulmones. Para extirpar los pulmones, agarra la base del corazón con los fórceps y levanta hacia arriba.Coloque las tijeras detrás de los pulmones y comience a hacer pequeñas incisiones a través de las conexiones del tejido mientras continúa levantando el corazón hacia arriba. Una vez que los pulmones han sido extirpados, colóquelos en una gasa estéril y retire el corazón levantándolo de los pulmones y cortando las conexiones de tejido restantes. Transfiera los pulmones al bote de pesaje pre-tared y registre la masa.Después de que los pulmones han sido pesados, transfiera los pulmones a solución salina estéril con fosfato y guárdelos temporalmente en hielo. Ahora que los pulmones han sido extirpados y pesados, las bacterias se pueden recuperar para determinar su papel hacia la patogénesis. En preparación para la recuperación bacteriana, se necesitarán los siguientes suministros: un molinillo de tejido, PBS estéril libre de RNase, Tampón RLT complementado con beta-mercaptoetanol, y 1,5 ml de tubos de microcentrífuga sin RNase.Comience agregando primero un ml de PBS estéril libre de RNase a la trituradora de tejido. Una vez rellenada, guarde la trituradora de tejido en hielo. A continuación, prepare una serie de tubos de dilución en serie estériles libres de RNase para cuantificar la carga bacteriana recuperada de los pulmones infectados.Transfiera los pulmones a la trituradora de tejido preparada y homogeneice a fondo el tejido presionando hacia abajo en el pedestal mientras gira. Abra la amoladora de tejido y aliquot 100 microlitros de la muestra homogeneizada en el primero de los tubos de dilución serie preparados. Diluir en serie las muestras y la placa en el agar nutritivo para enumerar las unidades formadoras de colonias.Las UFC se pueden registrar como UFC por ml o UFC por ml, por miligramo de tejido pulmonar. Después de que se haya eliminado la alícuota de 100 microlitr, sustituya el pedestal de molienda y centrifuga la muestra a 4.000 rpm durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Una vez completada la centrifugación, retire el sobrenadante de la muestra peletada.El sobrenadante se puede guardar y almacenar a menos 80 grados Centígrados para su posterior análisis en una fecha posterior. Re-suspenda el pellet de tejido homogeneizado en 700 microlitros de RLT beta-mercaptoetanol y transfiera la muestra a un tubo de centrífuga estéril sin RNase de 1,5 ml. En este punto, la muestra se puede almacenar a menos 80 grados.El ARN se puede purificar a partir de la suspensión homogeneiza pulmonar RLT cargando la muestra en un tubo de microcentrífuga de dos ml que contiene perlas de sílice de 1 milímetro y se procesa a través de un batidor de perlas durante 20 segundos a seis metros por segundo. El ARN se purifica inmediatamente utilizando una adaptación del método RNeasy como se indica en Voyich, et al. Métodos de Biología Molecular"2008, y descritos en el manuscrito que acompaña a este video.Después de la purificación, el rendimiento del ARN se puede cuantificar utilizando un espectrofotómetro. Una vez cuantificado, es beneficioso diluir el ARN resultante en varias alícuotas de 50 nanogramos por microlitro. Esto permite que el ARN de la muestra se utilice para múltiples análisis sin estar sujeto a múltiples ciclos de congelación-descongelación.El uso de esta técnica permite la instalación de una carga de patógenos controlado directamente en el tracto respiratorio inferior. La eficiencia de este sistema de entrega se puede demostrar mediante la instalación de una solución azul brillante 1%Coomassie. La fila superior muestra un par de pulmones no infectados para servir como control, mientras que la fila inferior muestra un par de pulmones que han recibido 50 microlitros del 1%Coomassie brillante tinte azul a través de una instalación intratraqueal.El uso de este tinte demuestra cómo la instalación intratraqueal proporciona una distribución uniforme de la carga del patógeno dentro y a través de los pulmones izquierdo y derecho. Una vez infectada, la carga del patógeno se puede recuperar y analizar en varios puntos de tiempo después de la instalación intratraqueal por escisión y homogeneización del tejido pulmonar. Para demostrar la eficiencia de esta técnica de recuperación, dos grupos que contenían tres ratones cada uno se infectaron con una dosis baja y alta de Staphylococcus aureus.La entrada bacteriana fue chapada en agar nutritivo para enumerar las UFC. Una hora después de la instalación intratraqueal, los ratones fueron eutanasiados, los pulmones extirpados y homogeneizados en una trituradora de tejido. El tejido homogeneizado se diluyó en serie y se encuplaó en el agar nutritivo para enumerar las UFC.El ARN aislado del tejido pulmonar homogeneizado puede examinarse mediante la PCR de la transcriptasa inversa y utilizarse para cuantificar la abundancia relativa de transcripción de genes diana. Para garantizar una contaminación mínima del ADN de fondo, se recomienda que una reacción PCR, sin la adición de transcriptasa inversa, se ejecute junto con cualquier reacción qRT-PCR. Además de las cargas bacterianas, esta técnica se puede extender a la instalación y aislamiento de cargas virales.Después de la homogeneización del tejido pulmonar, el ARN viral se puede aislar y utilizar para medir la abundancia de transcripción de genes virales o construir una curva estándar para la cuantificación viral. El uso de este sistema proporciona un sistema altamente eficiente y reproducible para estudiar la neumonía bacteriana secundaria. Una vez masterado, este procedimiento se puede utilizar en experimentos a gran escala.Trabajando en lotes para eutanasiar ratones, la instalación intratraqueal puede ocurrir dentro de 30 segundos por ratón. Después de esto se completa, pasando a la escisión de los pulmones, esto se puede completar en aproximadamente dos a tres minutos por ratón. Si bien los métodos discutidos aquí habían sido dentro del contexto de una infección bacteriana secundaria, pueden extenderse hacia cualquier procedimiento donde sea necesario un parto controlado y la recuperación de un inóculo.Además de los métodos descritos aquí, este procedimiento se puede complementar con la adición de un lavado broncoalveolar antes de la escisión de los pulmones. Mientras que esto a menudo resulta en una disminución de la recuperación de la carga de patógenos, se beneficia de la obtención de datos, como el análisis de citoquinas, la actividad de lactato deshidrogenasa, y la identificación de diferentes poblaciones celulares. Para obtener una comprensión más completa de la patogénesis de la enfermedad se hace importante interrogar tanto las contribuciones del huésped como de los patógenos a la enfermedad.El propósito de este video era proporcionar un método simple y eficiente para explorar la neumonía bacteriana secundaria dentro de un huésped murino.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

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Desarrollo de un marcador negativo seleccionable para Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Investigación

Inmunología e Infección

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

La invasión de las células humanas por un patógeno bacteriano

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Un día de flujo de trabajo Método de detección de patógenos bacterianos y pruebas de resistencia a los antimicrobianos de cultivos de sangre

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Utilización del modelo de EpiAirway para la caracterización de largo plazo Interacciones Huésped-Patógeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Recuperación Genética inversa mediada por norovirus murino Infecciosas

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

Medida de la alodinia táctil en un modelo murino de la prostatitis bacteriana

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

La separación automatizada de<em&gt; C. elegans</em&gt; Variablemente colonizada por un patógeno bacteriano

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

Un modelo de ratón para Patógenos inducida inflamación crónica en los sitios locales y sistémicos

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Implementación de un Sistema de infección basada en la inserción de membrana permeable para estudiar los efectos de toxinas secretadas bacterianas en células huésped de mamífero

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Un método no invasivo y técnicamente no intensivos para la inducción y Fenotipificación Experimental de neumonía bacteriana en ratones

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...