Name: fully human tumor-based matrix in three-dimensional spheroid invasion assay
Uploaded: 2019-05-07T14:45:00
Duration: 8 min 15 s
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作者感谢这项研究的资助者: Sizrid Jusélius 基金会、芬兰癌症协会和赫尔辛基大学中心医院研究基金。作者感谢赫尔辛基大学的生物成像部门寻求技术帮助。

1. 多细胞肿瘤球体的产生
请注意:该协议在这里用 UT-SC-42A 和-42b 细胞系进行了演示, 但也可以使用其他细胞系应用。
<ol><li>用6毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗 UT-SC-42A 和-42b 细胞, 加入0.05% 的色氨酸 edta (75 厘米2瓶3毫升), 并将烧瓶放入细胞培养孵化器 (37°c, 5% co2, 95% 湿度) 2-5。</li>
	<li>检查细胞是否在显微镜下分离。然后添加完整的杜尔贝科改良老鹰的培养基 (DMEM) 培养基 (DMEM + 10% 的胎牛血清, 100 umml 青霉素、100μgml 链霉素、250 ngml 两性霉素 B、0.4μgml 氢化可待因酮和酶 (6 毫升, 75 厘米) 中和酶2烧瓶), 并将细胞悬浮液转移到15毫升的锥形管中。 注: 选择适合所研究的细胞的细胞培养培养基。</li>
	<li>以 200 x g 离心细胞悬浮液 5分钟 。</li>
	<li>取出上清液, 悬浮细胞颗粒2-5 毫升的完整 Dmem。</li>
	<li>用完整的 DMEM 计数细胞, 并将细胞悬浮液稀释到最终浓度为 20, 000 细胞。 请注意:必须为每个细胞系确定最佳的细胞计数。</li>
	<li>将细胞悬浮液50Μl 分配到每个超低附件96孔圆形底板井中, 最终浓度为每口 1, 000个细胞。</li>
	<li>将钢板转移到细胞培养孵化器 (37°c, 5% co2, 95% 湿度)。四天后, 用倒置显微镜直观地确认肿瘤球体的形成, 并进行检测。确保每口井只有一个球体。 请注意:形成球体所需的时间因细胞系而异。</li>
</ol>2. 三维球体入侵检测
请注意:准备2倍溶液, 因为凝胶加入井后会被稀释1:1。
<ol><li>在37°c 的水浴中, 在冰和纤维蛋白原储备溶液中解冻 HMDM。不要打扰纤维蛋白原, 直到它完全溶解, 不要把溶液放在冰上;降水将发生。</li>
	<li>将每种试剂的适当体积混合在一起: 1 Mg/mml HMDM (最终浓度: 0.5 Mg/ml)、0.6 Um/ml 凝血酶 (最终浓度: 0.3 U/ml)、66.6 mg/mL 前列腺素 (最终浓度: 33.3 ug/mL) 和 1 Mg/ml 纤维蛋白原 (最终浓度: 0.5 Mg/ml)). 请注意:在将混合物放入井中并快速工作之前, 先加入纤维蛋白原;几分钟后就会形成凝胶一次只治疗几口井。</li>
	<li>在每口井中加入50Μl 的凝胶。将尖端指向井内壁, 慢慢地将管道引导。避免气泡 (使用反向移液技术), 尽量不要将球体从井的中心移动。</li>
	<li>将板返回到细胞培养孵化器, 并允许 Hmmm/fbin 基质凝固 30分钟, 然后轻轻地将100Μl 的完整 DMEM 添加到凝胶顶部的每个井中。</li>
</ol>3. 成像
<ol><li>每天使用倒置光学显微镜拍摄球体图像。或者, 使用自动成像系统。</li>
</ol>4. 图像分割与伊拉提克
<ol><li>打开 "像素分类", 然后选择"像素分类" 工作流 (图 1a)。它根据用户的批注对像素进行分类。将 ilastik 项目 (. ilp) 保存到计算机。</li>
	<li>添加用于分析的图像。单击 "输入数据"并添加新数据, 然后选择图像 (图 1b)。</li>
	<li>
有关功能选择, 请单击 "功能选择" 和 "选择功能" (图 1c, 红色矩形)。 注:所选要素应大致对应于将对象与背景分开的可视属性, 并将用于训练分类器。<ol>
<li>通过单击框选择要素。选定的框将变为绿色 (图 1c, 蓝色矩形)。 请注意:在这里, 用户可以从几种不同的功能类型和比例中进行选择。应选择 "颜色强度", 以便根据颜色或亮度分隔对象。应选择边缘以根据亮度或颜色渐变分隔对象。如果图像中的对象具有特殊的纹理外观, 纹理是一个重要特征。对于此检测, 使用 "颜色强度" (sigma 0) 和 "边缘" (sigma 6)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
对于培训, 请单击 "培训", 在 "培训" 部分有两个标签: 标签1和标签 2 (图 1d, 红色矩形)。如果只有一个标签, 请按 "添加标签" (图 1d, 蓝色矩形) 添加新标签。
	<ol>
<li>用其中一个标签标记背景 (图 1d, 黄色), 用另一个标签标记单元格 (图 1d, 蓝色)。</li>
		<li>训练前10% 图像的软件。从"当前视图" 中选择下一个图像。</li>
		<li>标记单元格和背景 (第一个图像的) 后, 按"实时更新" (图 1d, 紫色矩形)。 注: 对于下一个图像, ilastik 将根据以前的图像自动执行分析。</li>
	</ol>
</li>
	<li>培训完成后, 并对所有图像进行了分析, 请单击 "预测导出"。从源中选择简单的分段;不要选择概率或其他任何内容 (图 1e)。</li>
	<li>从 "预测导出" 部分 (图 1e) 中的 "选择导出图像设置..."中选择所需的输出文件格式。通过单击 "全部导出" 导出标签的结果 (图 1f)。这些文件将被导出到具有原始图像的同一文件夹中。 注: 在本实验中, 使用. h5 格式。</li>
</ol>5. 斐济图像的区域分析 j
<ol><li>
缩放设置
	<ol>
<li>使用斐济 ImageJ 中的刻度栏打开原始图像 (图 2a)。确保图像的大小和尺寸与分析的图像相同。使用 "线条选择" 工具绘制已知长度的线条 (图 2b)。 请注意:此协议是使用斐济 ImageJ 1.51 (64位) 和 ilastik-1.3.2rc 执行的。</li>
		<li>单击 "分析" 和"设置比例" (图 2c)。在 "已知距离"字段中设置已知距离, 并设置适当的单位, 然后单击"全局" (图 2d)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
安装宏
	<ol>
<li>如果未安装插件ilastik , 请按照下列步骤操作: 单击 "帮助"、 "更新..."。在打开的窗口Imagej 更新程序上, 单击 "管理更新网站"。在打开的 "管理更新网站"窗口中, 单击 "反式" 旁边的"关闭"。然后单击 "应用更改" 窗口 "Imagej 更新程序"。此过程可能需要一些时间。下一个窗口将是文本已成功更新的信息。单击"确定" , 然后重新启动 imagej。</li>
		<li>单击 "插件"、 "宏" 和"安装" (图 3a)。然后选择反. ijm 文件 (请参阅补充信息), 然后单击 "打开"。 请注意:该宏是专门为测量该区域而编写的。每次打开软件时都应安装宏。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
区域分析
	<ol>
<li>安装所有插件时分析图像。单击 "插件"并向下滚动到ilastik (图3 c)。选择"导入 HDF5", 选择具有. h5 格式的文件, 单击 "打开并加载" 并应用 lut (图 3c, d)。</li>
		<li>按下键盘 (宏) 中的按钮, 该区域将显示在"摘要"窗口中, 即 "总区域" (图3 e)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spheroids+with+Enhanced+Aggressiveness+to+Mimic+Human+Liver+Cancer+In+vitro+and+In+Vivo.">Cell Spheroids with Enhanced Aggressiveness to Mimic Human Liver Cancer In vitro and In Vivo.</a> Scientific Reports. 7, 10499-10514 (2017).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29 (2012).</li><li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research:+Focus+on+tumor+spheroid+model.">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology and Therapeutics. , 94-108 (2016).</li><li>Albanese, A., Lam, A. K., Sykes, E. A., Rocheleau, J. V., Chan, W. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-on-a-chip+provides+an+optical+window+into+nanoparticle+tissue+transport.">Tumour-on-a-chip provides an optical window into nanoparticle tissue transport.</a> Nature Communications. 4, 2718 (2013).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nature Protocols. 4, 309-324 (2009).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cancer+Cell+Spheroid+Assay+to+Assess+Invasion+in+a+3D+Setting.">A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53409 (2015).</li><li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+(3D)+Tumor+Spheroid+Invasion+Assay.">Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52686 (2015).</li><li>Salo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+leiomyoma+tissue+derived+matrix+for+cell+culture+studies.">A novel human leiomyoma tissue derived matrix for cell culture studies.</a> BMC Cancer. 15, 981 (2015).</li><li>Nurmenniemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+organotypic+model+mimics+the+tumor+microenvironment.">A novel organotypic model mimics the tumor microenvironment.</a> The American Journal of Pathology. 175, 1281-1291 (2009).</li><li>Salo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+three-dimensional+assays+based+on+human+leiomyoma-derived+matrices.">Organotypic three-dimensional assays based on human leiomyoma-derived matrices.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160482 (2018).</li><li>Overall, C. M., Blobel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+search+of+partners:+linking+extracellular+proteases+to+substrates.">In search of partners: linking extracellular proteases to substrates.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 245-257 (2007).</li><li>Ahmed, T. A. E., Dare, E. V., Hincke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin:+a+versatile+scaffold+for+tissue+engineering+applications.">Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 14 (2), 199-215 (2008).</li><li>Hoornstra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fermented+Lingonberry+Juice+Inhibits+Oral+Tongue+Squamous+Cell+Carcinoma+Invasion+In+vitro+Similarly+to+Curcumin.">Fermented Lingonberry Juice Inhibits Oral Tongue Squamous Cell Carcinoma Invasion In vitro Similarly to Curcumin.</a> In Vivo. 32, 1089-1095 (2018).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

该方法提供了一种基于三维人体肿瘤的检测方法, 用于评估肿瘤微环境中癌细胞在模拟基质中的侵入性。通过使用标准显微镜的日常成像和图像分析软件, 可以很容易地测量癌细胞的入侵。该方法显示细胞入侵, 而不仅仅是增殖。
与 MDM 不同, Hmdm/纤维蛋白基质不需要任何温度控制。这种方法很容易执行, 特别是不需要将球体从一个盘子转移到另一个板块。它只有一个技术上敏感的步骤, 在基质中添加纤维蛋白原。由于纤维蛋白原在几分钟后开始凝胶, 添加纤维蛋白原需要强大的移液和治疗只有几口井一次。如果移液是以高压方式进行的, 也有干扰球体并将其从 u 形井中心位置移动的风险。球体的错位会使成像和最终的分析复杂化。
该检测方法可通过改变 HMDM 或纤维蛋白原的浓度进行改性。这些细胞也可以被固定和染色, 以便随后进行分子研究。尽管这种方法可以修改为完全自动化的形式, 但也可以用普通显微镜和两个开源软件进行, 不需要昂贵的设备。
与传统的基于 msdm 的三维检测方法相比, 该检测方法能更好地显示细胞入侵特性。生长在含有富含层压蛋白的基底基质中的球虫, 如 MDM, 可能比实际入侵更大的癌细胞增殖, 因此由于其入侵能力较低, 不适合在几个癌细胞系进行入侵检测。另一个常用的基质, I 型胶原蛋白, 往往收缩从边缘在3D 培养过程中, 这影响了球体定位和成像的井。此外, 利用人类肿瘤微环境模拟模型 (myoma 圆盘及其可溶性形态), 证明了多 (HSC-3) 和少 (SCC-25) 侵犯性舌癌细胞系的内在侵入性之间的差异矩阵)10,13。
该检测方法也比使用 MSDM 更符合伦理性, 因为 HMDM 是从人平滑肌瘤肿瘤的剩余物质中提取出来的。目前, hmdm 是唯一可用的人类肿瘤衍生 ecm 产品, 似乎适用于许多癌症相关的体外检测 8,10。今后, 动物组织衍生基质可以被人类肿瘤基基质所取代, 以减少牺牲动物进行基质生产的需要。
用三维方法取代2D 细胞培养检测, 可提供更准确的癌症细胞行为信息。目前, 有几个三维模型和商业矩阵, 但不幸的是, 没有一个适合所有的癌症细胞系。研究人员应选择最适合其特定检测的基质。检测和矩阵的最佳匹配具有挑战性, 但可以显著提高结果的可靠性。

传统的二维 (2D) 细胞培养研究为癌症研究做出了巨大贡献。目前, 研究人员正更多地转向三维细胞培养检测, 以更好地模仿体内条件1。三维肿瘤细胞培养在细胞和细胞基质相互作用、基因表达谱、药物敏感性和信号转导活性2、3 等方面更准确地反映了复杂的肿瘤微环境。
在肿瘤研究中使用了多种三维细胞培养模型, 如肿瘤组织外植体、芯片上的肿瘤和3、4的多细胞肿瘤球体。多细胞肿瘤球体现在被广泛使用, 因为它们模仿了人类肿瘤 1,5的体内条件的几个特征。当球体直径大于500μm 时, 它甚至有缺氧区域和坏死中心, 因而代表体内肿瘤情况2。
许多合成 (例如, 聚二甲基硅氧烷) 和动物衍生 (例如, 老鼠尾巴类型 i 型胶原蛋白和小鼠肉瘤衍生基质, 基质, 称为 msdm) 矩阵已开发用于三维细胞培养检测3,6, 7,8。到目前为止, 没有一个市售的基质来源于人类肿瘤组织。因此, 它们缺乏人类肿瘤微环境的特征, 对癌细胞的侵袭过程有显著影响8。
肌胶蛋白 (人肌瘤衍生基质, 简称 HMDM) 是从人子宫平滑肌瘤肿瘤组织9中提取的。结果表明, HMDM 的蛋白质含量与 MSDM 有显著差异。事实上, 66% 的 HMDM 蛋白与 MDM 蛋白不同。另一方面, 一些蛋白质, 如层压蛋白, IV 型胶原蛋白, 肝素硫酸盐蛋白多糖, 尼多原和表皮生长因子, 存在于这两个基质 10.此外, 小鼠在酶含量上与人类不同, 人类的蛋白酶比小鼠少78种, 比小鼠少11。
纤维蛋白作为脚手架材料已被单独或与其他材料结合广泛使用.在三维细胞培养检测中, 市售的人纤维蛋白原和凝血酶结合形成纤维蛋白水凝胶12。
该方案描述了以前介绍的3D 肿瘤球体入侵检测7的改进。这一新的方案应用于人类肿瘤衍生基质, 而不是鼠源性肿瘤基质。它还涉及使用 ilastik 和斐济 ImageJ 软件的成像和分析技术。该方案可用于几种不同的固体癌细胞系的球体检测。它为开发新的抗癌疗法和研究特定分子对癌细胞入侵的影响提供了一个与生物学相关的工具。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:791px;" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:256px;">Amphotericin B solution</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">A2942</td>
			<td style="width:323px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Aprotinin from bovine lung</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">A6279</td>
			<td>Measure the protein concentration before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:93px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A1052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">BioLite Cell Culture Treated Flasks</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">130190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:93px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">31330-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">DS-Fi2 Digital Camera</td>
			<td style="width:93px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">DS-U3 Digital Camera Controller</td>
			<td style="width:93px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Eclipse TS100 Inverted Microscope</td>
			<td style="width:93px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:93px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10270106</td>
			<td>Heat inactivate for 30 min at 56&#176;C in waterbath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">341578</td>
			<td>Solubility: 25 mg/ml in H&#8322;O. Warm the H&#8322;O and the fibrinogen to 37&#176;C prior to dissolution. Do not disturb until the fibrinogen is completely solubilized. Stock solutions stored at -70&#176;C should be thawed in a water bath maintained at 37&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Fiji ImageJ 1.51 image processing program</td>
			<td style="width:93px;">Freeware, NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Ilastik software for image classification and segmentation</td>
			<td style="width:93px;">Freeware</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System</td>
			<td style="width:93px;">Essen BioScience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Myogel</td>
			<td style="width:93px;">Lab made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:93px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:93px;">Lab made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Scepter 2.0 Cell Counter</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">PHCC20040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Scepter Cell Counter Sensors, 60 &#181;m</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">PHCC60050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Thrombin from human plasma</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">T6884-100UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Trypsin-EDTA (0.5%) 10X, no phenol red</td>
			<td style="width:93px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Ultra-Low Attachment 96-Well Plate</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">UT-SCC-42A and UT-SCC-42-B cell lines</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The cell lines were established at the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Turku University Hospital (Turku, Finland).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully human tumor-based matrix in three-dimensional spheroid invasion assay

基于二维细胞培养的检测是体外癌症研究中常用的方法。然而, 它们缺乏形成肿瘤微环境的几个基本要素。为了获得更可靠的体外结果, 引入了几种三维 (3D) 细胞培养检测方法。这些检测允许癌细胞与细胞外基质相互作用。这种相互作用影响细胞行为, 如增殖和入侵, 以及细胞形态。此外, 这种相互作用可以诱导或抑制几个原蛋白和抗肿瘤分子的表达。建立了球体侵袭法, 为研究癌细胞浸润提供了合适的三维体外方法。目前, 动物源性基质, 如小鼠肉瘤衍生基质 (MSDM) 和大鼠尾 i 型胶原蛋白, 主要用于球体侵袭检测。考虑到人类肿瘤微环境与动物源性基质的差异, 从良性子宫平滑肌瘤组织中形成了人肌瘤衍生基质 (HMDM)。研究表明, HMDM 比 MSDM 能诱导癌细胞的迁移和侵袭。该协议提供了一种简单、可重复、可靠的基于人肿瘤的球状侵袭方法, 该方法采用了 Hmdm/纤维蛋白基质。它还包括有关成像和分析的详细说明。球体生长在一个 u 形的超低连接板在 Hmdm/纤维蛋白矩阵内, 并通过它入侵。每天使用 ilastik 和斐济 ImageJ 软件对入侵进行成像、测量和分析。该检测平台采用人喉原代细胞和转移性鳞状细胞癌细胞系进行了验证。然而, 该协议也适用于其他固体癌症细胞系。

UT-SC-42B (转移性喉部 SCC 细胞系) 细胞播种后四天, 在形成的球体 (第0天) 上加入基质 (Hmdm/fbin、MDM 或胶原蛋白), 并对其入侵进行了三天的监测。这里的图像是每天使用倒置显微镜获得的 (图 4)。
一旦嵌入, Hmdm/纤维蛋白基质中的细胞在一天后开始迅速侵入, 并扩展到基质中 (图 4a)。MSDM 中的细胞没有侵入周围的基质, 而是形成了不对称的结构 (图 4b)。另一方面, 细胞在胶原蛋白中稍有侵袭, 但由于基质收缩的原因, 分析起来很困难 (图 4c)。在一些胶原蛋白井中, 球体甚至在三天后消失 (图 4c)。
图 5显示了初级喉部 scc 细胞系 ut-sc-42a 和相应的转移细胞系 ut-sc-42b 的 HMDM/fbin 中细胞入侵的定量。使用 Hmdm/fbin 球体的活细胞分析系统拍摄的视频 (电影 1) 显示了 scc 细胞在基质中的运动, 它们在矩阵中形成链, 然后是其他细胞。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig1v2.jpg"> 图 1: 图像分割.使用 ilastik 进行图像分割的选定步骤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig2.jpg"> 图 2: 缩放设置.使用斐济 ImageJ 进行缩放设置的选定步骤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig3.jpg"> 图 3: 使用 ImageJ 进行入侵分析.使用斐济 ImageJ 进行图像分析的选定步骤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig4.jpg"> 图 4: UT-SCC-42B 细胞在三个不同的基质中的入侵.三维球体中 SCC 细胞入侵的代表性图像。入侵被跟踪了三天, 每天用倒置显微镜拍摄图像。(A) Hmdm/ffin, (b) msdm, (c) 胶原蛋白。最后一列表示第3天入侵的澄清。刻度杆 = 200μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig4large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig5.jpg"> 图 5: HMDM/纤维蛋白中 scc 细胞入侵的定量.利用 ilastik 和斐济 ImageJ 软件分析了原发性喉 ut-scc-42a 和相应的转移性喉部 UTC-SC-42B scc 细胞系入侵。结果代表三个独立实验的平均±标准偏差, 每个实验一式三份。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig5large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59567/59567video1.jpg"> 视频 1:Scc 细胞在 Hmdm/纤维蛋白内运动三天.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/Video_1.wmv" target="_blank">请点击这里观看此视频。(右键单击下载.</a>

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Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

肿瘤微环境是癌症生长和侵袭的重要组成部分。为了模仿癌症的进展, 需要一个与生物学相关的人类基质。该方案介绍了应用人平滑肌瘤基基质进行体外三维球体入侵检测的改进。该协议还介绍了基于计算机的细胞入侵分析。

三维流状入侵检测中的全人肿瘤基基质

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

正如我们已经知道的，肿瘤微环境是癌症生长和入侵的重要组成部分。为了模仿癌进展，我们需要一个与生物学相关的人类肿瘤基质。这是唯一基于体外入侵检测的人类肿瘤基质。与传统的球类测定相比，该方法温度不敏感，不需要球类转移。该技术适用于患者衍生的固体癌症样本，如头部和颈部癌，可以扩展到个性化医学，包括化疗疗法。这种基于肿瘤的基质已经用于多种应用，包括高通量药物测试、活细胞分析、伤口愈合和转移检测。技术上最敏感的步骤是添加方法对纤维蛋白原的处理，因此您可能需要首先使用空井练习此步骤。显示矩阵的正确处理很重要，并且通过直观地显示方法很容易进行分析。对于多细胞肿瘤球体生成，将1倍10至第三细胞从感兴趣的细胞系中放入50微升的完整介质，进入96井超低附着圆底板的每个井中。然后将板放入37摄氏度和5%的二氧化碳细胞培养箱中四天，然后用倒置显微镜直观地确认肿瘤球状物的形成。为了建立一个三维球体入侵测定，在37摄氏度的水浴中，在冰上解冻人类肌瘤衍生基质和解冻纤维蛋白原存量溶液。当试剂加热后，将适当体积的完整介质、人类肌瘤衍生基质、血栓、阿普罗汀和纤维蛋白原混合在一起，在将基质混合物分配到细胞中之前加入纤维蛋白原。立即将所得凝胶的 50 微升添加到球体培养板的每个井中，将尖端指向每一个井的内壁，并且移液速度变慢，而无需将球体从井的中心移动。由于纤维蛋白原在几分钟后开始凝胶，它需要一个坚固但精确的反向移液和一次只有几口井的治疗。将板返回细胞培养箱 30 分钟，让人类肌瘤衍生基质纤维蛋白凝胶凝固，然后轻轻地将 100 微升的完整介质添加到每个凝胶的顶部。然后每天对球体入侵进行成像。对于使用 ilastik 进行图像分割，请打开开源图像分类和分段软件，然后选择像素分类工作流。将 ilastik 项目保存到计算机。像素将基于用户进行注释进行分类。单击"输入数据"并"添加新"以选择用于分析的图像。对于要素选择，请单击"要素选择"和"选择要素"。单击相应的框以选择感兴趣的要素。所选框将变绿。有关培训，请单击"培训"。在"培训"部分中，应有两个标签，标签 1 和标签 2。使用其中一个标签标记背景，用另一个标签标记单元格。标记第一个图像中的所有单元格和背景后，从当前视图中选择下一个图像以继续标记单元格和背景，直到标记了 10% 的图像。然后选择"实时更新"以分析所有图像。培训完成后，ilastik 已分析所有图像，单击预测导出并选择"源简单细分"。然后从"选择导出图像设置"中选择所需的输出文件格式，然后单击"全部导出"以导出标签结果。这些文件将导出到与原始图像相同的文件夹中。对于区域分析，首先在斐济 ImageJ 中使用比例栏打开原始图像，注意图像的大小和尺寸与分析的图像相同。使用线条选择工具绘制已知长度的线条，然后单击"分析并设置比例"。然后在"已知距离"字段中设置已知距离。设置正确的单位，然后单击"全局"。要安装 ilastik 插件，请单击"帮助和更新"，然后单击 ImageJ 更新器窗口中的"管理更新网站"。单击"ilastik"、"关闭"和"应用更改"旁边的操作。几分钟后，将显示一个信息窗口，表示已成功更新。单击"确定"并重新启动 ImageJ。接下来，单击"插件"、"宏"并安装并选择计数器。ijm 文件。然后单击"打开"。要完成区域分析，请单击插件并滚动以选择 ilastik。选择"导入 HDF5"并选择 h5 格式的文件。单击"打开"并"加载"并应用查找表。然后单击键盘上的 A 按钮，该区域将显示在摘要窗口中作为总面积。在这个具有代表性的实验中，在转移性喉膜鳞状细胞系播种四天后，如所证明，将基质添加到形成球体上，每天在倒置显微镜上监测入侵情况。一旦嵌入，人类肌瘤衍生纤维蛋白基质中的细胞在一天后开始快速入侵，并在接下来的两天内扩展到基质中。小鼠肉瘤衍生矩阵中的细胞没有侵入周围的基质，而是形成不对称结构。胶原蛋白中的细胞轻微侵入，但由于基质收缩，分析变得困难。在一些油井中，球体甚至在三天后就消失了。在这里，显示了人类肌瘤衍生纤维蛋白基质中原发性喉膜细胞的入侵和转移性喉膜鳞状细胞的定量。人类肌瘤衍生纤维素基体球体入侵的活细胞分析揭示了整个基质链中的细胞运动，随着时间的推移，其他细胞随后被其他细胞跟踪。当将矩阵添加到孔中时，请注意不要将球体从中心位置移动。该程序可用于研究辐照和特定分子（如抗癌药物）如何影响入侵。细胞可以固定和染色，以便随后的研究。在经典的小鼠肉瘤模型中，细胞主要增殖，入侵方面极小。这种基于肿瘤的基质能诱发入侵，使抑制研究更加有效。

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