Name: fully human tumor-based matrix in three-dimensional spheroid invasion assay
Uploaded: 2019-05-07T14:45:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay at JoVE.com

De auteurs bedanken de financiers van deze studie: de Sigrid Jusélius Foundation, de Cancer Society van Finland, en Helsinki University Central Hospital onderzoekfondsen. De auteurs erkennen de Biomedicum Imaging Unit aan de Universiteit van Helsinki voor technische hulp.

1. generatie van multicellulaire tumor Sferoïden
Opmerking: Het protocol is hier aangetoond met UT-SCC-42A en-42B cel lijnen, maar het kan ook worden toegepast met behulp van andere cellen lijnen.
<ol><li>Was de UT-SCC-42A en-42B cellen met 6 mL fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS); Voeg 0,05% trypsine-EDTA (3 mL voor 75 cm2 kolf), en plaats de kolf in een cel kweek incubator (37 °c, 5% Co2, 95% vochtigheid) voor 2-5 min.</li>
	<li>Controleer of de cellen onder een Microscoop zijn losgemaakt. Voeg vervolgens complete Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) media (DMEM + 10% foetale boviene serum, 100 U/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine, 250 ng/mL amfotericine B, 0,4 μg/mL hydrocortison, en 50 μg/mL ascorbinezuur) om het enzym te neutraliseren (6 mL voor 75 cm 2 kolf) en breng de cel schorsing in een 15 ml conische buis. Opmerking: Selecteer de cel cultuurmedium dat past bij de cellen worden bestudeerd.</li>
	<li>Centrifugeer de cel suspensie bij 200 x g voor 5 min.</li>
	<li>Verwijder de bovendrijvende en Suspendeer de Cell pellet in 2-5 mL van de volledige DMEM.</li>
	<li>Tel de cellen en Verdun de cel schorsing met volledige DMEM tot een definitieve concentratie van 20.000 cellen/mL. Opmerking: Voor elke cel regel moet een optimaal aantal cellen worden bepaald.</li>
	<li>Doseer 50 l van de cel schorsing in elke ultra-lage gehechtheid 96-goed ronde bodemplaat goed voor een definitieve concentratie van 1.000 cellen per put.</li>
	<li>Breng de plaat naar de cel kweek incubator (37 °C, 5% CO2, 95% vochtigheid). Vier dagen later, visueel te bevestigen tumor sferoïde vorming met een omgekeerde Microscoop en verder met de assay. Zorg ervoor dat er slechts een sferoïde per well. Opmerking: De tijd die wordt genomen om een sferoïde te vormen varieert tussen verschillende cel lijnen.</li>
</ol>2. driedimensionale sferoïde invasie assay
Opmerking: Bereid 2x oplossing omdat de gel zal worden verdund 1:1 wanneer toegevoegd in de putten.
<ol><li>Dooi HMDM op ijs en fibrinogeen voorraadoplossing in een waterbad gehandhaafd bij 37 °C. Verstoort niet de fibrinogeen tot het volledig solubilized is en zet niet de oplossing op ijs; neerslag zal optreden.</li>
	<li>Meng het juiste volume van elk reagens samen: 1 mg/mL HMDM (eindconcentratie: 0,5 mg/mL), 0,6 U/mL trombine (eindconcentratie: 0,3 U/mL), 66,6 mg/mL aprotinin (eindconcentratie: 33,3 UG/mL), en 1 mg/mL fibrinogeen (eindconcentratie: 0,5 mg/mL ). Opmerking: Voeg fibrinogeen net voor het doseren van het mengsel in de putten en werken snel; het zal vormen een gel in een paar minuten. Behandel slechts een paar putten op een moment.</li>
	<li>Voeg 50 l van de gel in elk goed. Direct de tip naar de binnenwand van de put en pipet langzaam. Vermijd luchtbellen (met behulp van de omgekeerde Pipetting techniek) en probeer niet om de sferoïde te verplaatsen van het centrum van de put.</li>
	<li>Breng de plaat terug naar de cel kweek incubator en laat de HMDM/fibrinematrix te stollen voor 30 min, en zachtjes toe te voegen 100 l van volledige DMEM in elk goed op de top van de gel.</li>
</ol>3. Imaging
<ol><li>Afbeelding van de sferoïden dagelijks met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop. U ook automatische imaging systemen gebruiken.</li>
</ol>4. beeldsegmentatie met Ilastik
<ol><li>Open ilastik en selecteer de werkstroom van de pixel classificatie (Figuur 1a). Het classificeert de pixels op basis van aantekeningen gemaakt door de gebruiker. Sla ilastik project (. Ilp) op de computer op.</li>
	<li>Voeg afbeeldingen toe voor analyses. Klik op invoergegevens en Voeg nieuw toe en kies vervolgens afbeeldingen (Figuur 1B).</li>
	<li>
Klik voor functie selectie op functie selectie en selecteer functies (Figuur 1C, rode rechthoek). Opmerking: de geselecteerde functies moeten ruwweg overeenkomen met de visuele eigenschappen die de objecten scheiden van de achtergrond, en ze zullen worden gebruikt voor het trainen van de classificatie.<ol>
<li>Selecteer functies door op de vakjes te klikken. De geselecteerde vakken worden groen weer (Figuur 1C, blauwe rechthoek). Opmerking: Hier kan de gebruiker kiezen uit verschillende feature types en schalen. Kleur/intensiteit moet worden geselecteerd om objecten te scheiden op basis van kleur of helderheid. De rand moet worden geselecteerd om objecten te scheiden op basis van helderheid of kleurovergangen. Textuur is een belangrijke functie als de objecten in de afbeelding hebben een speciale textuur verschijning. Voor deze analyse worden kleur/intensiteit (Sigma 0) en Edge (Sigma 6) gebruikt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voor training klikt u op training en in de sectie training zijn er twee labels: label 1 en Label 2 (Figuur 1D, rode rechthoek). Als er maar één label is, voegt u een nieuw label toe door op label toevoegen te drukken (Figuur 1D, blauwe rechthoek).
	<ol>
<li>Markeer de achtergrond met een van de labels (Figuur 1d, geel) en de cellen met het andere label (Figuur 1d, blauw).</li>
		<li>Train de software voor de eerste 10% van de beelden. Kies volgende afbeelding uit de huidige weergave.</li>
		<li>Nadat de cellen en de achtergrond zijn gemarkeerd (van de eerste afbeelding), drukt u op Live Update (Figuur 1D, paarse rechthoek). Nota: met het volgende beeld, zal ilastik automatisch de analyse volgens de vorige beelden uitvoeren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na de training is gedaan en ilastik heeft alle afbeeldingen geanalyseerd, klikt u op predictie export. Kies eenvoudige segmentatie van bron; Kies niet waarschijnlijkheden of iets anders (Figuur 1E).</li>
	<li>Kies de gewenste output bestandsformaat van Kies export image settings... in de predictie export sectie (Figuur 1E). Exporteer de resultaten van de labeling door te klikken op Alles exporteren (Figuur 1F). De bestanden zullen worden geëxporteerd naar dezelfde map met de originele beelden. Opmerking: in dit experiment wordt. H5-indeling gebruikt.</li>
</ol>5. de analyse van het gebied met Fiji ImageJ
<ol><li>
Schaalinstelling
	<ol>
<li>Open de originele afbeelding met een schaalbalk in Fiji ImageJ (Figuur 2a). Zorg ervoor dat de afbeelding dezelfde grootte en afmetingen heeft als de geanalyseerde afbeeldingen. Gebruik het gereedschap lijn selecteren om een lijn van een bekende lengte te tekenen (Figuur 2B). Opmerking: Dit protocol wordt uitgevoerd met behulp van Fiji ImageJ 1,51 (64-bit) en ilastik-1.3.2 rc.</li>
		<li>Klik op analyse en Stel schaal in (Figuur 2C). Stel de bekende afstand in op het bekende afstands veld en stel de juiste eenheid in en klik op globaal (Figuur 2D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De macro installeren
	<ol>
<li>Als een plugin ilastik niet is geïnstalleerd, volg deze stappen: Klik op Help, Update.... Klik in het venster ImageJ Updateropenen op Update sites beheren. Klik in het geopende venster Update sites beherenop naast ilastik en klik vervolgens op sluiten. Klik vervolgens op wijzigingen toepassen in het venster ImageJ Updater. Dit proces kan enige tijd duren. Het volgende venster zal informatie zijn met de tekst met succes bijgewerkt. Tikken okee en herstarten ImageJ.</li>
		<li>Klik op Plug-ins, macro'sen installeren (Figuur 3a). Kies vervolgens het bestand Counter. IJM (Zie aanvullende informatie) en klik op openen. Opmerking: De macro is speciaal geschreven voor het meten van het gebied. De macro moet worden geïnstalleerd elke keer dat de software wordt geopend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gebied analyse
	<ol>
<li>Analyseer afbeeldingen wanneer alle plug-ins zijn geïnstalleerd. Klik op plugins en scroll naar beneden naar ilastik (Figuur 3C). Kies import hdf5, kies het bestand met. H5 formaat, klik op openen en laden en toepassen Lut (Figuur 3C, D).</li>
		<li>Druk op de a -knop van het toetsenbord (macro) en het gebied zal verschijnen in de Samenvatting venster als totaal gebied (Figuur 3E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spheroids+with+Enhanced+Aggressiveness+to+Mimic+Human+Liver+Cancer+In+vitro+and+In+Vivo.">Cell Spheroids with Enhanced Aggressiveness to Mimic Human Liver Cancer In vitro and In Vivo.</a> Scientific Reports. 7, 10499-10514 (2017).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29 (2012).</li><li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research:+Focus+on+tumor+spheroid+model.">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology and Therapeutics. , 94-108 (2016).</li><li>Albanese, A., Lam, A. K., Sykes, E. A., Rocheleau, J. V., Chan, W. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-on-a-chip+provides+an+optical+window+into+nanoparticle+tissue+transport.">Tumour-on-a-chip provides an optical window into nanoparticle tissue transport.</a> Nature Communications. 4, 2718 (2013).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nature Protocols. 4, 309-324 (2009).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cancer+Cell+Spheroid+Assay+to+Assess+Invasion+in+a+3D+Setting.">A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53409 (2015).</li><li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+(3D)+Tumor+Spheroid+Invasion+Assay.">Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52686 (2015).</li><li>Salo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+leiomyoma+tissue+derived+matrix+for+cell+culture+studies.">A novel human leiomyoma tissue derived matrix for cell culture studies.</a> BMC Cancer. 15, 981 (2015).</li><li>Nurmenniemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+organotypic+model+mimics+the+tumor+microenvironment.">A novel organotypic model mimics the tumor microenvironment.</a> The American Journal of Pathology. 175, 1281-1291 (2009).</li><li>Salo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+three-dimensional+assays+based+on+human+leiomyoma-derived+matrices.">Organotypic three-dimensional assays based on human leiomyoma-derived matrices.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160482 (2018).</li><li>Overall, C. M., Blobel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+search+of+partners:+linking+extracellular+proteases+to+substrates.">In search of partners: linking extracellular proteases to substrates.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 245-257 (2007).</li><li>Ahmed, T. A. E., Dare, E. V., Hincke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin:+a+versatile+scaffold+for+tissue+engineering+applications.">Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 14 (2), 199-215 (2008).</li><li>Hoornstra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fermented+Lingonberry+Juice+Inhibits+Oral+Tongue+Squamous+Cell+Carcinoma+Invasion+In+vitro+Similarly+to+Curcumin.">Fermented Lingonberry Juice Inhibits Oral Tongue Squamous Cell Carcinoma Invasion In vitro Similarly to Curcumin.</a> In Vivo. 32, 1089-1095 (2018).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De gepresenteerde methode biedt een 3D menselijke tumor-gebaseerde assay om de invasieve van kankercellen te evalueren binnen de menselijke tumor microenvironment nabootsen matrix. Kanker cel invasie kan gemakkelijk worden gemeten door de dagelijkse beeldvorming met een standaard Microscoop en met behulp van beeldanalyse software. De methode toont cel invasie in plaats van alleen proliferatie.
In tegenstelling tot MSDM, de HMDM/fibrinematrix vereist geen temperatuurregeling. Deze methode is eenvoudig uit te voeren, in het bijzonder zonder de noodzaak om de sferoïden van de ene plaat naar de andere. Het heeft slechts één technisch gevoelige stap, de toevoeging van fibrinogeen aan de matrijs. Sinds fibrinogeen begint te gel na een paar minuten, het toevoegen van fibrinogeen vereist robuuste pipetten en de behandeling van slechts een paar putten tegelijk. Er is ook een risico van het verstoren van de sferoïde en het verplaatsen van de centrale positie in de U-vormig goed als pipetten wordt gedaan op een hoge druk manier. Dislocatie van de sferoïde kan compliceren beeldvorming en uiteindelijk de analyse.
De assay kan gewijzigd worden door de concentratie van HMDM of fibrinogeen te veranderen. De cellen kunnen ook worden vastgesteld en gekleurd voor latere moleculaire studies. Hoewel deze methode kan worden aangepast aan een volledig geautomatiseerde vorm, kan het ook worden uitgevoerd met een normale Microscoop en twee open source software, met geen behoefte aan dure apparatuur.
In vergelijking met de traditionele MSDM-gebaseerde 3D-assays, kan deze analyse weer te geven beter de cel invasie eigenschappen. Sferoïden geteeld in een kelder membraan-bevattende laminin-rijke matrix, zoals MSDM, zou kunnen hebben meer proliferatie van kankercellen dan de werkelijke invasie, waardoor het ongeschikt voor invasie-analyses in verschillende kankercellen lijnen als gevolg van hun lage invasie capaciteit. Een andere vaak gebruikte matrijs, type I collageen, neigt om van de randen tijdens 3D cultuur te krimpen, die sferoïde localisatie en weergave van de putten beïnvloedt. Daarnaast zijn de verschillen tussen de intrinsieke invasieve eigenschappen van de meer (hulp-3) en minder (SCC-25) agressieve tong carcinoom cellen lijnen zijn aangetoond met behulp van menselijke tumor microenvironment nabootsen modellen (myoma schijven en de oplosbare vorm matrijs)10,13.
De assay is ook meer ethisch dan het gebruik van MSDM sinds HMDM wordt gewonnen uit het overgebleven materiaal van de menselijke leiomyoma tumor. Momenteel, HMDM is de enige beschikbare menselijke tumor-afgeleide ECM-product dat lijkt te zijn geschikt voor veel kanker-gerelateerde in vitro assays8,10. In de toekomst, dierlijke weefsel-afgeleide matrices kunnen worden vervangen door menselijke tumor-gebaseerde matrices om de noodzaak om dieren te offeren voor matrix productie te verminderen.
Vervanging van 2D-cel cultuur assays met 3D-methoden biedt meer accurate informatie over kankercellen gedrag. Momenteel zijn er verschillende 3D-modellen en commerciële matrices, maar helaas, geen zijn geschikt voor alle kankercellen lijnen. Onderzoekers moeten kiezen voor de meest geschikte matrix voor hun specifieke assay. Optimale matching van de assay en matrix kan worden uitdagend, maar het kan een aanzienlijke verhoging van de betrouwbaarheid van de resultaten.

Conventionele twee-dimensionale (2D) cel cultuurstudies hebben aanzienlijk bijgedragen aan het onderzoek naar kanker. Momenteel zijn onderzoekers verschuiven meer naar drie-dimensionale (3D) cel cultuur assays beter na te bootsen de in vivo voorwaarden1. De 3D-kanker cel cultuur nauwkeuriger weerspiegelt de complexe tumor micromilieu in termen van cel-cel en cel-matrix interacties, genexpressie profielen, gevoeligheid van de drug, en signalering pathway activiteit2,3.
Verscheidene 3D de cultuur modellen van de cel worden gebruikt in kankeronderzoek zoals tumorweefsel explant, tumor op een spaander, en multicellulaire tumor sferoïden3,4. Multicellulaire tumor sferoïden worden nu wijd gebruikt, aangezien zij verscheidene eigenschappen van de in vivo voorwaarden in menselijke tumors1,5nabootsen. Wanneer de sferoïde diameter groter is dan 500 μm, heeft het zelfs hypoxische gebieden en een necrotic centrum, dat zo de in vivo tumor situatie vertegenwoordigt2.
Veel synthetische (bijv. Polydimethylsiloxaan) en dierlijke-afgeleide (bijv. rat staart type I collageen en muis Sarcoom-afgeleide matrix, Matrigel, aangeduid als MSDM) matrices zijn ontwikkeld voor 3D-cel cultuur assays3,6, 7,8. Tot nu toe zijn geen van de in de handel verkrijgbare matrices afkomstig van menselijk tumorweefsel. Daarom hebben ze niet de kenmerken van de menselijke tumor microenvironment, die significante effecten heeft op kanker cel invasie processen8.
Myogel (menselijke myoma-afgeleide matrijs, die als HMDM wordt bedoeld) wordt gehaald uit menselijke baarmoeder leiomyoma tumorweefsel9. Het is aangetoond dat het eiwitgehalte van HMDM aanzienlijk verschilt van die van MSDM. In feite, 66% van HMDM eiwitten zijn verschillend van MSDM eiwitten. Aan de andere kant, sommige eiwitten, zoals laminin, type IV collageen, heparan sulfaat proteoglycanen, nidogen, en epidermale groeifactor, aanwezig zijn in beide matrices10. Bovendien, verschilt de muis van de mens in enzym inhoud, met mensen die 78 minder proteasen dan muizen11hebben.
Fibrine is op grote schaal gebruikt alleen of in combinatie met andere materialen als een steigermateriaal12. In 3D de cultuur analyses van de cel, worden de commercieel beschikbare menselijke fibrinogeen en trombine gecombineerd om een fibrine hydrogel12te vormen.
Dit protocol beschrijft een verbetering van de eerder geïntroduceerde 3D tumor sferoïde invasie assay7. Dit nieuwe protocol is van toepassing menselijke tumor-afgeleide matrix in plaats van muis-afgeleide tumor matrix. Het gaat ook om Imaging en analysetechnieken met behulp van ilastik en Fiji ImageJ software. Dit protocol kan worden gebruikt voor sferoïde assay van verschillende vaste kankercellen lijnen. Het biedt een biologisch relevant instrument om nieuwe anti-kankertherapieën te ontwikkelen en om de effecten van specifieke moleculen op de invasie van kankercellen te bestuderen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:791px;" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:256px;">Amphotericin B solution</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">A2942</td>
			<td style="width:323px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Aprotinin from bovine lung</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">A6279</td>
			<td>Measure the protein concentration before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:93px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A1052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">BioLite Cell Culture Treated Flasks</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">130190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:93px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">31330-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">DS-Fi2 Digital Camera</td>
			<td style="width:93px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">DS-U3 Digital Camera Controller</td>
			<td style="width:93px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Eclipse TS100 Inverted Microscope</td>
			<td style="width:93px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:93px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10270106</td>
			<td>Heat inactivate for 30 min at 56&#176;C in waterbath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">341578</td>
			<td>Solubility: 25 mg/ml in H&#8322;O. Warm the H&#8322;O and the fibrinogen to 37&#176;C prior to dissolution. Do not disturb until the fibrinogen is completely solubilized. Stock solutions stored at -70&#176;C should be thawed in a water bath maintained at 37&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Fiji ImageJ 1.51 image processing program</td>
			<td style="width:93px;">Freeware, NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Ilastik software for image classification and segmentation</td>
			<td style="width:93px;">Freeware</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System</td>
			<td style="width:93px;">Essen BioScience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Myogel</td>
			<td style="width:93px;">Lab made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:93px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:93px;">Lab made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Scepter 2.0 Cell Counter</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">PHCC20040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Scepter Cell Counter Sensors, 60 &#181;m</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">PHCC60050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Thrombin from human plasma</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">T6884-100UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Trypsin-EDTA (0.5%) 10X, no phenol red</td>
			<td style="width:93px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Ultra-Low Attachment 96-Well Plate</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">UT-SCC-42A and UT-SCC-42-B cell lines</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The cell lines were established at the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Turku University Hospital (Turku, Finland).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully human tumor-based matrix in three-dimensional spheroid invasion assay

Twee-dimensionale cel op cultuur gebaseerde assays worden vaak gebruikt in in vitro kankeronderzoek. Nochtans, missen zij verscheidene basiselementen die de tumor microenvironment vormen. Om meer betrouwbare in vitro resultaten te verkrijgen, zijn er verschillende driedimensionale (3D) Cell cultuur assays geïntroduceerd. Deze tests kunnen kankercellen om te interageren met de extracellulaire matrix. Deze interactie beïnvloedt het gedrag van cellen, zoals proliferatie en invasie, maar ook de morfologie van de cel. Bovendien, deze interactie kan induceren of onderdrukken van de expressie van verschillende Pro-en anti-tumorigenic moleculen. Sferoïde invasie assay werd ontwikkeld om een geschikte 3D in vitro methode te bieden om kankercellen invasie te bestuderen. Op dit moment, dierlijke-afgeleide matrices, zoals de muis Sarcoom-afgeleide matrix (MSDM) en rat staart type I collageen, worden voornamelijk gebruikt in de sferoïde invasie assays. Rekening houdend met de verschillen tussen de menselijke tumor microenvironment en dierlijke-afgeleide matrices, een menselijke myoma-afgeleide matrix (HMDM) werd ontwikkeld uit goedaardige baarmoeder leiomyoma weefsel. Het is aangetoond dat HMDM induceert migratie en invasie van carcinoom cellen beter dan MSDM. Dit protocol verstrekte een eenvoudige, reproduceerbare, en betrouwbaar 3D menselijke tumor-gebaseerde sferoïde invasie assay gebruikend de HMDM/fibrine matrijs. Het bevat ook gedetailleerde instructies over beeldvorming en analyse. De sferoïden groeien in een U-vormige ultra-lage bevestigingsplaat binnen de HMDM/fibrinematrix en binnenvallen er doorheen. De invasie wordt dagelijks afgebeeld, gemeten en geanalyseerd met behulp van ilastik en Fiji ImageJ software. De assay platform werd aangetoond met behulp van menselijke keel primaire en gemetastaseerde plaveiselcel cel carcinoom cellen lijnen. Echter, het protocol is ook geschikt voor andere vaste kankercellen lijnen.

Vier dagen na de UT-SCC-42B (uitgezaaide keel SCC cel lijn) Cell seeding, de matrix (HMDM/fibrine, MSDM, of collageen) werd toegevoegd op de gevormde sferoïden (dag 0) en de invasie werd gecontroleerd voor drie dagen. Beelden hier werden verkregen dagelijks met behulp van een omgekeerde Microscoop (Figuur 4).
Eenmaal ingebed, cellen in de HMDM/fibrinematrix begon te snel binnen te vallen na een dag en uitgebreid in de matrix (Figuur 4A). Cellen in de MSDM niet binnenvallen in de omliggende matrix, in plaats daarvan de vorming van een asymmetrische structuur (Figuur 4B). Aan de andere kant, cellen in de collageen binnengedrongen licht, maar door de matrix krimp de analyse was moeilijk (Figuur 4C). In sommige collageen putten, de sferoïden zelfs verdwenen na drie dagen (Figuur 4C).
Figuur 5 illustreert de kwantificering van de cel invasie in HMDM/fibrine van de primaire keel-SCC cel lijn UT-SCC-42a en de overeenkomstige gemetastaseerde cel lijn UT-SCC-42b. De video (film 1) genomen met behulp van een Live-Cell analyse systeem van de HMDM/fibrine sferoïde toont de beweging van de SCC cellen in de matrix waar ze vormen strengen, gevolgd door de andere cellen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig1v2.jpg"> Figuur 1 : Beeldsegmentatie. Geselecteerde stappen van beeldsegmentatie met behulp van ilastik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig2.jpg"> Figuur 2 : Schaalinstelling. Geselecteerde stappen van schaalinstelling met behulp van Fiji ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig3.jpg"> Figuur 3 : Invasie analyse met behulp van ImageJ. Geselecteerde stappen van beeldanalyse met behulp van Fiji ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig4.jpg"> Figuur 4 : UT-SCC-42b cel invasie in drie verschillende matrices. Representatieve beelden van SCC Cell invasie in de 3D sferoïden. Invasie werd gevolgd voor drie dagen en beelden werden dagelijks genomen met behulp van een omgekeerde Microscoop. AHMDM/fibrine, (B) MSDM, (C) collageen. De laatste kolom vertegenwoordigt verduidelijking van dag 3 invasie. Schaalbalk = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig5.jpg"> Figuur 5 : Kwantificering van SCC cel invasie in HMDM/fibrine. Primaire keel UT-SCC-42A en overeenkomstige gemetastaseerde keel-UT-SCC-42B SCC Cell line invasie werd geanalyseerd met behulp van ilastik en Fiji ImageJ software. De resultaten vertegenwoordigen gemiddelde ± standaardafwijking van drie onafhankelijke experimenten, elk in drievoud. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59567/59567video1.jpg"> Video 1: SCC Cell beweging binnen de HMDM/fibrine voor drie dagen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/Video_1.wmv" target="_blank">Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay at JoVE.com

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Tumor microenvironment is een essentieel onderdeel van kankergroei en invasie. Om kanker progressie na te bootsen, is een biologisch relevante menselijke matrix nodig. Dit protocol introduceert een verbetering voor de drie-dimensionale sferoïde invasie assay in vitro door het toepassen van een menselijke leiomyoma-gebaseerde matrix. Het protocol introduceert ook een computer-based cel invasie analyse.

Volledig menselijke tumor-gebaseerde matrijs in driedimensionele sferoïde invasie assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Zoals we al weten, de tumor micro-omgeving is een essentieel onderdeel van de groei van kanker en invasie. Om de progressie van carcinoom na te bootsen, hebben we een biologisch relevante menselijke tumormatrix nodig. Dit is de enige menselijke tumor matrix gebaseerd in vitro invasie test.Vergeleken met de klassieke sferoïde test, deze methode is niet als temperatuurgevoelig en vereist geen sferoïde overdracht. Deze techniek is geschikt voor patiënt-afgeleide vaste kanker monsters zoals hoofd en nek carcinoom en kan uitgebreid naar gepersonaliseerde geneeskunde, waaronder chemoradiatie therapieën. Deze menselijke tumor-gebaseerde matrix is al gebruikt voor verschillende toepassingen, waaronder high-throughput drug testen, live-cel analyse, wondgenezing, en overdracht testen.De meest technisch gevoelige stap is de behandeling van de fibrinogen wordt toegevoegd, dus misschien wilt u deze stap eerst oefenen met lege putten. Het is belangrijk om de juiste behandeling van de matrix te laten zien en het is gemakkelijk te analyseren door de methode visueel weer te geven. Voor meercellige tumor sferoïde generatie, een keer 10 uitdelen aan de derde cellen van de cel lijn van belang in 50 microliters van compleet medium in elke put van een 96-well ultra-lage bevestiging ronde bodemplaat.Plaats de plaat vervolgens in een 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxidecelcultuur incubator voor vier dagen voordat visueel bevestigen tumor sferoïde vorming met een omgekeerde microscoop. Om een driedimensionale sferoïde invasietest op te zetten, ontdooi je menselijke myoma-afgeleide matrix op ijs en ontdooi fibrinogen voorraadoplossing in een 37 graden Celsius waterbad. Wanneer de reagentia zijn opgewarmd, meng de juiste volumes van volledige medium, menselijke myoma-afgeleide matrix, trombine, aprotinine, en fibrinogen, het toevoegen van de fibrinogen net voor het verstrekken van de matrix mengsel in de cellen.Voeg onmiddellijk 50 microliters van de resulterende gel toe in elke put van de sferoïde kweekplaat, die de punt naar de binnenwand van elke put leidt en pipetting vertraagt zonder de sferoïde uit het midden van de put te bewegen. Aangezien de fibrinogen begint te gelen na een paar minuten, het vereist een robuuste maar nauwkeurige omgekeerde pipetting en de behandeling van slechts een paar putten tegelijk. Breng de plaat 30 minuten terug naar de couveuse van de celkweek om de menselijke myoma-afgeleide matrixfibringel te laten stollen voordat u voorzichtig 100 microliters van volledig medium aan de bovenkant van elke gel toevoegt.Beeld dan dagelijks de sferoïde invasie in. Open voor beeldsegmentatie met ilastik de open-source beeldclassificatie- en segmentatiesoftware en selecteer Pixelclassificatieworkflow. Sla het ilastik-project op de computer op.De pixels worden ingedeeld op basis van annotaties gemaakt door de gebruiker. Klik op Invoergegevens en Nieuw toevoegen om afbeeldingen voor de analyse te selecteren. Klik voor functieselectie op Functieselectie en Selecteer Onderdelen.Klik op de juiste vakken om de kenmerken van belang te selecteren. De geselecteerde vakken worden groen. Klik voor een training op Trainen.In de sectie Training moeten er twee labels zijn: Label 1 en Label 2. Markeer de achtergrond met een van de labels en markeer de cellen met het andere label. Wanneer alle cellen en achtergronden in de eerste afbeelding zijn gelabeld, selecteert u de volgende afbeelding in de huidige weergave om de cellen en achtergrond te blijven markeren totdat 10% van de afbeeldingen is gemarkeerd.Selecteer vervolgens Live Update om alle afbeeldingen te analyseren. Wanneer de training is voltooid en ilastik alle afbeeldingen heeft geanalyseerd, klikt u op Voorspelling exporteren en selecteert u Eenvoudige segmentatie van bron. Selecteer vervolgens de gewenste uitvoerbestandsindeling in De afbeeldingsinstellingen exporteren kiezen en klik op Alles exporteren om de resultaten van de etikettering te exporteren.De bestanden worden geëxporteerd naar dezelfde map met de oorspronkelijke afbeeldingen. Open voor gebiedsanalyse eerst de oorspronkelijke afbeelding met een schaalbalk in Fiji ImageJ, waarbij u ervoor zorgt dat de afbeelding dezelfde grootte en dimensie heeft als de geanalyseerde afbeeldingen. Gebruik het gereedschap Lijnselectie om een lijn van een bekende lengte te tekenen en klik op Schaal analyseren en instellen.Stel vervolgens de bekende afstand in in het veld Bekende afstand. Stel de juiste eenheid in en klik op Globaal. Als u de ilastik-plug-in wilt installeren, klikt u op Help en bijwerken en klikt u op Updatesites beheren in het imagej-updatevenster.Klik naast ilastik, Sluiten en Wijzigingen toepassen. Na enkele minuten verschijnt er een informatievenster waarin wordt vermeld dat het is bijgewerkt. Klik op OK en start ImageJ opnieuw.Klik vervolgens op Plug-ins, macro's en installeren en selecteer de teller. ijm-bestand. Klik vervolgens op Openen.Als u de gebiedsanalyse wilt voltooien, klikt u op Plug-ins en scrolt u om ilastik te selecteren. Selecteer HDF5 importeren en selecteer het bestand met de h5-indeling. Klik op Tabel Openen en laden en opzoekt.Klik vervolgens op de A-knop op het toetsenbord en het gebied wordt weergegeven in het overzichtsvenster als het totale gebied. In dit representatieve experiment, vier dagen na gemetastaseerde laryngeale plaveiselcelcarcinoom cellijn zaaien, matrix werd toegevoegd aan de gevormde sferoïden zoals aangetoond en de invasie werd dagelijks gecontroleerd op een omgekeerde microscoop. Eenmaal ingebed, cellen in de menselijke myoma-afgeleide fibrine matrix begon snel binnen te vallen na een dag en uitgebreid in de matrix in de komende twee dagen.Cellen in de muis sarcoom-afgeleide matrix niet binnen te dringen in de omringende matrix, in plaats daarvan vormen een asymmetrische structuur. Cellen in het collageen vielen iets binnen, maar door matrixkrimp werd de analyse moeilijk. In sommige putten verdwenen de sferoïden zelfs na drie dagen.Hier wordt kwantificering van de invasie van een primaire en een gemetastaseerde laryngeale plaveiselcelcarcinoomcel in menselijke myoma-afgeleide fibrinematrix getoond. Live-cel analyse van menselijke myoma-afgeleide fibrine matrix sferoïde invasie onthult celbeweging in strengen in de matrix die wordt gevolgd door andere cellen in de tijd. Vergeet niet om voorzichtig te zijn niet te bewegen de sferoïde van het centrum positie bij het toevoegen van de matrix aan de putten.Deze procedure kan worden gebruikt om te bestuderen hoe bestraling en specifieke moleculen zoals kankermedicijnen invasie beïnvloeden. De cellen kunnen worden vastgesteld en gekleurd voor latere studies. In het klassieke muis sarcoom model vermenigvuldigen de cellen zich voornamelijk en is het invasieaspect minimaal.Deze menselijke tumor-gebaseerde matrix induceert invasie, waardoor de remming studies efficiënter.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Studie van virale vectoren in een drie-dimensionale lever Model herbevolkt met de menselijke hepatocellulair carcinoom cellijn HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Analyseren van de communicatie tussen monocyten en primaire borstkankercellen in een extracellulaire Matrix extraheren (ECME)-gebaseerde driedimensionaal systeem

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generatie van High-Throughput driedimensionale Tumor spheroïden voor Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Een sferoïde doden Assay door auto T cellen

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Driedimensionale bot extracellulaire Matrix Model voor Osteosarcoom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering van de effecten van migraine remmers op de invasie van 3D-tumor Spheroid door confocale microscopie met hoge resolutie

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Celdood evalueren met celvrije supernatant van probiotica in driedimensionale sferoïde culturen van colorectale kankercellen

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Driedimensionaal in vitro biomimetisch model van neuroblastoom met behulp van op collageen gebaseerde steigers

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...