Name: fully human tumor-based matrix in three-dimensional spheroid invasion assay
Uploaded: 2019-05-07T14:45:00
Duration: 8 min 15 s
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Les auteurs remercient les bailleurs de fonds de cette étude: la Fondation Sigrid Jusélius, la société du cancer de la Finlande et l’Université d’Helsinki Centre de recherche de l’hôpital central. Les auteurs reconnaissent l’unité d’imagerie Biomedicum à l’Université d’Helsinki pour obtenir de l’aide technique.

1. génération de sphéroïdes de tumeurs multicellulaires
Remarque: Le protocole est illustré ici avec les lignées cellulaires UT-SCC-42A et-42B, mais il peut également être appliqué à l’aide d’autres lignées cellulaires.
<ol><li>Laver les cellules UT-SCC-42A et-42B avec 6 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), ajouter 0,05% de trypsine-EDTA (3 mL pour le flacon de 75 cm2 ) et placer le flacon dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° c, 5% co2, 95% d’humidité) pendant 2-5 min.</li>
	<li>Vérifiez que les cellules se sont détachées sous un microscope. Ajoutez ensuite le support d’Eagle (DMEM) modifié de Dulbecco (DMEM + 10% de sérum bovin fœtal, 100 U/ml de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 250 ng/mL d’amphotéricine B, 0,4 μg/mL d’hydrocortisone et 50 μg/mL d’acide ascorbique) pour neutraliser l’enzyme (6 mL pour 75 cm 2 flacon) et transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml. Remarque: sélectionnez le milieu de culture de cellules qui convient aux cellules étudiées.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer le surnageant et suspendre le culot de la cellule dans 2-5 mL de DMEM complet.</li>
	<li>Comptez les cellules et diluez la suspension cellulaire avec le DMEM complet jusqu’à une concentration finale de 20 000 cellules/mL. Remarque: Le nombre optimal de cellules doit être déterminé pour chaque ligne de cellule.</li>
	<li>Distribuer 50 μL de la suspension cellulaire dans chaque pièce d’attache ultra-faible 96-plaque de fond ronde bien pour une concentration finale de 1 000 cellules par puits.</li>
	<li>Transférer la plaque à l’incubateur de culture cellulaire (37 ° c, 5% CO2, 95% d’humidité). Quatre jours plus tard, confirmer visuellement la formation de sphéroïdes de tumeur avec un microscope inversé et procéder au dosage. Assurez-vous qu’il n’y a qu’un seul sphéroïde par puits. Remarque: Le temps pris pour former un sphéroïde varie entre les différentes lignées cellulaires.</li>
</ol>2. essai d’invasion de sphéroïdes tridimensionnels
Remarque: Préparez 2x solution parce que le gel sera dilué 1:1 lorsqu’il est ajouté dans les puits.
<ol><li>Décongeler HMDM sur glace et solution de fibrinogène dans un bain d’eau maintenu à 37 ° c. Ne pas déranger le fibrinogène jusqu’à ce qu’il soit complètement solubilisé et ne pas mettre la solution sur la glace; précipitations se produiront.</li>
	<li>Mélanger ensemble le volume approprié de chaque réactif: 1 mg/mL de HMDM (concentration finale: 0,5 mg/mL), 0,6 U/mL de thrombine (concentration finale: 0,3 U/mL), 66,6 mg/mL d’aprotinine (concentration finale: 33,3 ug/mL) et 1 mg/mL de fibrinogène (concentration finale: 0,5 mg/mL ). Remarque: Ajouter le fibrinogène juste avant de distribuer le mélange dans les puits et de travailler rapidement; Il formera un gel en quelques minutes. Ne traitez que quelques puits à la fois.</li>
	<li>Ajouter 50 μL de gel dans chaque puits. Dirigez la pointe vers la paroi intérieure du puits et pipettant lentement. Évitez les bulles d’air (en utilisant la technique de pipetage inverse) et essayez de ne pas déplacer le sphéroïde du centre du puits.</li>
	<li>Retournez la plaque à l’incubateur de culture cellulaire et laissez la matrice HMDM/fibrine se solidifier pendant 30 min, et ajoutez délicatement 100 μL de DMEM complet dans chaque puits sur le dessus du gel.</li>
</ol>3. l’imagerie
<ol><li>Image les sphéroïdes quotidiennement à l’aide d’un microscope à lumière inversée. Vous pouvez également utiliser des systèmes d’imagerie automatique.</li>
</ol>4. segmentation d’image avec Ilastik
<ol><li>Ouvrez ilastik et sélectionnez workflow de classification des pixels (figure 1A). Il classifie les pixels en fonction des annotations effectuées par l’utilisateur. Enregistrez le projet ilastik (. ILP) sur l’ordinateur.</li>
	<li>Ajoutez des images pour les analyses. Cliquez sur données d’entrée et Ajoutez nouveau , puis choisissez des images (figure 1B).</li>
	<li>
Pour la sélection d’entités, cliquez sur sélection des entités et sélectionnez entités (figure 1C, rectangle rouge). Remarque: les entités sélectionnées doivent correspondre à peu près aux propriétés visuelles qui séparent les objets de l’arrière-plan, et ils seront utilisés pour la formation du classifieur.<ol>
<li>Sélectionnez les entités en cliquant sur les cases. Les cases sélectionnées vont tourner en vert (figure 1C, rectangle bleu). Remarque: Ici, l’utilisateur peut choisir parmi plusieurs types d’entités et échelles différents. La couleur/l’intensité doit être sélectionnée pour séparer les objets en fonction de la couleur ou de la luminosité. L’arête doit être sélectionnée pour séparer les objets en fonction de la luminosité ou des dégradés de couleurs. La texture est une caractéristique importante si les objets de l’image ont un aspect texture spécial. Pour ce dosage, la couleur/l’intensité (Sigma 0) et le bord (Sigma 6) sont utilisés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pour la formation, cliquez sur formation et dans la section formation il y a deux étiquettes: l’étiquette 1 et l’étiquette 2 (figure 1D, rectangle rouge). S’il n’y a qu’une seule étiquette, ajoutez une nouvelle étiquette en appuyant sur Ajouter une étiquette (figure 1D, rectangle bleu).
	<ol>
<li>Marquez l’arrière-plan avec l’une des étiquettes (figure 1d, jaune) et les cellules avec l’autre étiquette (figure 1d, bleu).</li>
		<li>Formez le logiciel pour les 10 premiers% des images. Choisissez l’image suivante dans la vue actuelle.</li>
		<li>Une fois que les cellules et l’arrière-plan sont marqués (de la première image), appuyez sur mise à jour en direct (figure 1D, Rectangle violet). Remarque: avec l’image suivante, ilastik effectuera automatiquement l’analyse en fonction des images précédentes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Après l’entraînement est fait et ilastik a analysé toutes les images, cliquez sur l' exportation de prédiction. Choisissez segmentation simple à partir de la source; Ne choisissez pas de probabilités ou autre chose (figure 1E).</li>
	<li>Choisissez le format de fichier de sortie désiré à partir de choisir exporter les paramètres d’image... dans la section exportation de prédiction (figure 1E). Exportez les résultats de l’étiquetage en cliquant sur Exporter tout (figure 1F). Les fichiers seront exportés dans le même dossier avec les images originales. Remarque: dans cette expérience, le format. H5 est utilisé.</li>
</ol>5. analyse de la zone avec les Fidji ImageJ
<ol><li>
Réglage de l’échelle
	<ol>
<li>Ouvrez l’image d’origine avec une barre d’échelle à Fidji ImageJ (figure 2a). Assurez-vous que l’image a la même taille et la même dimension que les images analysées. Utilisez l’outil Sélection de ligne pour tracer une ligne d’une longueur connue (figure 2B). Remarque: Ce protocole est exécuté à l’aide de Fidji ImageJ 1,51 (64-bit) et ilastik-1.3.2 RC.</li>
		<li>Cliquez sur analyser et définir l’échelle (figure 2C). Définissez la distance connue dans le champ distance connue et définissez l’unité appropriée et cliquez sur Global (figure 2D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Installation de la macro
	<ol>
<li>Si un plugin ilastik n’est pas installé, procédez comme suit: cliquez sur aide, mettre à jour.... Sur la fenêtre ouverte ImageJ Updater, cliquez sur gérer les sites de mise à jour. Dans la fenêtre ouvrir gérer les sites de mise à jour, cliquez sur suivant pour ilastik , puis cliquez sur Fermer. Cliquez ensuite sur appliquer les modifications dans la fenêtre ImageJ Updater. Ce processus peut prendre un certain temps. La fenêtre suivante sera l' information avec le texte mis à jour avec succès. Cliquez sur OK et redémarrez ImageJ.</li>
		<li>Cliquez sur plugins, macroset install (figure 3A). Ensuite, choisissez le fichier Counter. IJM (voir informations supplémentaires) et cliquez sur ouvrir. Remarque: La macro a été écrite spécialement pour la mesure de la zone. La macro doit être installée chaque fois que le logiciel est ouvert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analyse de zone
	<ol>
<li>Analysez les images lorsque tous les plugins sont installés. Cliquez sur plugins et faites défiler jusqu’à ilastik (figure 3C). Choisissez Import HDF5, choisissez le fichier avec le format. H5, cliquez sur ouvrir et chargez et appliquez lut (figure 3C, D).</li>
		<li>Appuyez sur la touche a du clavier (macro) et la zone apparaîtra dans la fenêtre récapitulative comme surface totale (figure 3E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spheroids+with+Enhanced+Aggressiveness+to+Mimic+Human+Liver+Cancer+In+vitro+and+In+Vivo.">Cell Spheroids with Enhanced Aggressiveness to Mimic Human Liver Cancer In vitro and In Vivo.</a> Scientific Reports. 7, 10499-10514 (2017).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29 (2012).</li><li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research:+Focus+on+tumor+spheroid+model.">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology and Therapeutics. , 94-108 (2016).</li><li>Albanese, A., Lam, A. K., Sykes, E. A., Rocheleau, J. V., Chan, W. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-on-a-chip+provides+an+optical+window+into+nanoparticle+tissue+transport.">Tumour-on-a-chip provides an optical window into nanoparticle tissue transport.</a> Nature Communications. 4, 2718 (2013).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. 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(99), e52686 (2015).</li><li>Salo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+leiomyoma+tissue+derived+matrix+for+cell+culture+studies.">A novel human leiomyoma tissue derived matrix for cell culture studies.</a> BMC Cancer. 15, 981 (2015).</li><li>Nurmenniemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+organotypic+model+mimics+the+tumor+microenvironment.">A novel organotypic model mimics the tumor microenvironment.</a> The American Journal of Pathology. 175, 1281-1291 (2009).</li><li>Salo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+three-dimensional+assays+based+on+human+leiomyoma-derived+matrices.">Organotypic three-dimensional assays based on human leiomyoma-derived matrices.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160482 (2018).</li><li>Overall, C. M., Blobel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+search+of+partners:+linking+extracellular+proteases+to+substrates.">In search of partners: linking extracellular proteases to substrates.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 245-257 (2007).</li><li>Ahmed, T. A. E., Dare, E. V., Hincke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin:+a+versatile+scaffold+for+tissue+engineering+applications.">Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 14 (2), 199-215 (2008).</li><li>Hoornstra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fermented+Lingonberry+Juice+Inhibits+Oral+Tongue+Squamous+Cell+Carcinoma+Invasion+In+vitro+Similarly+to+Curcumin.">Fermented Lingonberry Juice Inhibits Oral Tongue Squamous Cell Carcinoma Invasion In vitro Similarly to Curcumin.</a> In Vivo. 32, 1089-1095 (2018).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthode présentée fournit une analyse 3D basée sur la tumeur humaine pour évaluer l’invasivité des cellules cancéreuses au sein de la matrice de imitant de microenvironnement de tumeur humaine. L’invasion de cellules cancéreuses peut être facilement mesurée par imagerie quotidienne avec un microscope standard et en utilisant le logiciel d’analyse d’image. La méthode démontre l’invasion cellulaire plutôt que la simple prolifération.
Contrairement à MSDM, la matrice HMDM/fibrine ne nécessite aucun contrôle de température. Cette méthode est facile à réaliser, en particulier sans qu’il soit nécessaire de transférer les sphéroïdes d’une plaque à une autre. Il n’a qu’une seule étape techniquement sensible, l’addition de fibrinogène à la matrice. Comme le fibrinogène commence à se gel après quelques minutes, l’ajout de fibrinogène nécessite un pipetage et un traitement robustes de seulement quelques puits à la fois. Il y a également un risque de déranger le sphéroïde et de le déplacer de sa position centrale dans le puits en forme de U si le pipetage est fait de manière haute pression. La dislocation du sphéroïde peut compliquer l’imagerie et éventuellement l’analyse.
Le dosage peut être modifié en altérant la concentration de HMDM ou de fibrinogène. Les cellules peuvent également être fixées et colorées pour les études moléculaires ultérieures. Même si cette méthode peut être modifiée à une forme entièrement automatisée, elle peut également être réalisée avec un microscope normal et deux logiciels open source, sans besoin d’équipement coûteux.
Comparé aux tests 3D traditionnels basés sur MSDM, ce test pourrait afficher mieux les propriétés d’invasion de cellules. Les sphéroïdes cultivés dans une matrice de sous-sol contenant une membrane riche en laminine, comme la MSDM, pourraient avoir plus de prolifération des cellules cancéreuses que l’invasion réelle, ce qui le rend impropre aux essais d’invasion dans plusieurs lignées cellulaires cancéreuses en raison de leur faible capacité d’invasion. Une autre matrice fréquemment utilisée, le collagène de type I, tend à rétrécir à partir des bords pendant la culture 3D, ce qui affecte la localisation sphéroïde et l’imagerie des puits. En outre, on a démontré les différences entre les propriétés invasives intrinsèques des lignées cellulaires de carcinome de langue agressive (HSC-3) et moins (SCC-25), en utilisant des modèles de microenvironnement tumoral humain imitant le modèle (disques de myome et sa forme soluble Matrix)10,13.
Le dosage est également plus éthique que l’utilisation de MSDM puisque HMDM est extraite du matériel restant de la tumeur de leiomyoma humain. Actuellement, le hmdm est le seul produit d’ECM dérivé de tumeur humaine disponible qui semble convenir à de nombreux essais in vitro liés au cancer,8,10. À l’avenir, les matrices dérivées de tissus animaux pourraient être remplacées par des matrices humaines à base de tumeurs pour réduire le besoin de sacrifier les animaux pour la production matricielle.
Le remplacement des tests de culture de cellules 2D par des méthodes 3D fournit des informations plus précises sur le comportement des cellules cancéreuses. Actuellement, il existe plusieurs modèles 3D et des matrices commerciales, mais, malheureusement, aucun ne convient à toutes les lignées cellulaires cancéreuses. Les chercheurs devraient choisir la matrice la plus appropriée pour leur dosage particulier. L’appariement optimal du dosage et de la matrice peut être difficile, mais il pourrait considérablement augmenter la fiabilité des résultats.

Les études de culture cellulaire bidimensionnelle (2D) conventionnelles ont considérablement contribué à la recherche sur le cancer. Actuellement, les chercheurs se déplacent davantage vers des essais de culture cellulaire en trois dimensions (3D) pour mieux imiter les conditions in vivo1. La culture de cellules cancéreuses 3D reflète plus fidèlement le microenvironnement tumoral complexe en termes d’interactions cellule-cellule et cellule-matrice, profils d’expression génique, sensibilité médicamenteuse, et activité de signalisation de la voie2,3.
Plusieurs modèles de culture de cellules 3D sont utilisés dans la recherche sur le cancer comme explant de tissu tumoral, tumeur sur une puce, et les sphéroïdes de tumeur multicellulaires3,4. Les sphéroïdes de tumeurs multicellulaires sont maintenant largement utilisés, car ils imitent plusieurs caractéristiques des conditions in vivo dans les tumeurs humaines1,5. Lorsque le diamètre du sphéroïde est supérieur à 500 μm, il a même des régions hypoxiques et un centre nécrotique, ce qui représente donc la situation tumorale in vivo2.
De nombreuses matrices synthétiques (p. ex., polydiméthylsiloxane) et dérivées d’animaux (p. ex., le collagène de type I de queue de rat et la matrice dérivée de sarcome de souris, Matrigel, appelée msdm) ont été développées pour les essais de culture cellulaire 3D3,6, 7,8. Jusqu’à présent, aucune des matrices disponibles dans le commerce n’est originaire du tissu tumoral humain. Par conséquent, ils manquent les caractéristiques du microenvironnement tumoral humain, qui a des effets significatifs sur les processus d’invasion des cellules cancéreuses8.
Myogel (matrice dérivée de myome humain, appelée HMDM) est extraite du tissu tumoral de l’utérus humain leiomyoma9. Il a été démontré que la teneur en protéines du HMDM diffère significativement de celle de la MSDM. En fait, 66% des protéines HMDM sont différentes des protéines MSDM. D’autre part, certaines protéines, telles que la laminine, le collagène de type IV, les protéoglycanes de sulfate d’héparan, le nidogène et le facteur de croissance épidermique, sont présentes dans les deux matrices10. En outre, la souris diffère de l’humain dans le contenu enzymatique, avec des humains ayant 78 moins de protéases que les souris11.
La fibrine a été largement utilisée seule ou en combinaison avec d’autres matériaux comme matériau d’échafaudage12. Dans les essais de culture cellulaire 3D, le fibrinogène humain disponible dans le commerce et la thrombine sont combinés pour former un hydrogel de fibrine12.
Ce protocole décrit une amélioration du test d’invasion de sphéroïdes de tumeur 3D précédemment introduit7. Ce nouveau protocole applique la matrice dérivée de tumeur humaine au lieu de la matrice de tumeur dérivée de souris. Il implique également des techniques d’imagerie et d’analyse en utilisant ilastik et Fiji ImageJ logiciel. Ce protocole pourrait être utilisé pour le dosage sphéroïde de plusieurs lignées cellulaires cancéreuses solides différentes. Il offre un outil biologiquement pertinent pour développer de nouvelles thérapies anticancéreuses et pour étudier les effets de molécules spécifiques sur l’invasion de cellules cancéreuses.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:791px;" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:256px;">Amphotericin B solution</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">A2942</td>
			<td style="width:323px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Aprotinin from bovine lung</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">A6279</td>
			<td>Measure the protein concentration before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:93px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A1052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">BioLite Cell Culture Treated Flasks</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">130190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:93px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">31330-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">DS-Fi2 Digital Camera</td>
			<td style="width:93px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">DS-U3 Digital Camera Controller</td>
			<td style="width:93px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Eclipse TS100 Inverted Microscope</td>
			<td style="width:93px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:93px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10270106</td>
			<td>Heat inactivate for 30 min at 56&#176;C in waterbath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">341578</td>
			<td>Solubility: 25 mg/ml in H&#8322;O. Warm the H&#8322;O and the fibrinogen to 37&#176;C prior to dissolution. Do not disturb until the fibrinogen is completely solubilized. Stock solutions stored at -70&#176;C should be thawed in a water bath maintained at 37&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Fiji ImageJ 1.51 image processing program</td>
			<td style="width:93px;">Freeware, NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Ilastik software for image classification and segmentation</td>
			<td style="width:93px;">Freeware</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System</td>
			<td style="width:93px;">Essen BioScience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Myogel</td>
			<td style="width:93px;">Lab made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:93px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:93px;">Lab made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Scepter 2.0 Cell Counter</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">PHCC20040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Scepter Cell Counter Sensors, 60 &#181;m</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">PHCC60050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Thrombin from human plasma</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">T6884-100UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Trypsin-EDTA (0.5%) 10X, no phenol red</td>
			<td style="width:93px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Ultra-Low Attachment 96-Well Plate</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">UT-SCC-42A and UT-SCC-42-B cell lines</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The cell lines were established at the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Turku University Hospital (Turku, Finland).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully human tumor-based matrix in three-dimensional spheroid invasion assay

Les essais à base de culture cellulaire en deux dimensions sont couramment utilisés dans la recherche sur le cancer in vitro. Cependant, ils manquent de plusieurs éléments de base qui forment le microenvironnement tumoral. Pour obtenir des résultats in vitro plus fiables, plusieurs essais de culture cellulaire en trois dimensions (3D) ont été introduits. Ces dosages permettent aux cellules cancéreuses d’interagir avec la matrice extracellulaire. Cette interaction affecte le comportement des cellules, tels que la prolifération et l’invasion, ainsi que la morphologie des cellules. En outre, cette interaction pourrait induire ou supprimer l’expression de plusieurs molécules Pro-et anti-tumorigènes. Le test d’invasion sphéroïde a été développé pour fournir une méthode in vitro 3D appropriée pour étudier l’invasion de cellules cancéreuses. Actuellement, les matrices dérivées d’animaux, telles que la matrice dérivée du sarcome de souris (MSDM) et le collagène de type I de queue de rat, sont principalement utilisées dans les essais d’invasion de sphéroïdes. Prenant en considération les différences entre le microenvironnement tumoral humain et les matrices dérivées d’animaux, une matrice dérivée de myome humain (HMDM) a été développée à partir du tissu de leiomyoma de l’utérus Bénin. Il a été démontré que HMDM induit la migration et l’invasion des cellules de carcinome mieux que MSDM. Ce protocole a fourni un test d’invasion de sphéroïdes à base de tumeurs humaines 3D simple, reproductible et fiable à l’aide de la matrice HMDM/fibrine. Il contient également des instructions détaillées sur l’imagerie et l’analyse. Les sphéroïdes poussent dans une plaque de fixation ultra-faible en forme de U dans la matrice HMDM/fibrine et l’envahissent. L’invasion est imagée quotidiennement, mesurée et analysée à l’aide du logiciel ilastik et Fiji ImageJ. La plate-forme de dosage a été démontrée à l’aide de lignées cellulaires de carcinome épidermes cellulaires primaires et métastatiques du larynx humain. Cependant, le protocole est également approprié pour d’autres lignées cellulaires cancéreuses solides.

Quatre jours après l’ensemencement de cellules de l’UT-SCC-42B (métastatique laryngée de la lignée cellulaire SCC), la matrice (HMDM/fibrine, MSDM ou collagène) a été ajoutée sur les sphéroïdes formés (jour 0) et l’invasion a été surveillée pendant trois jours. Les images ici ont été obtenues quotidiennement à l’aide d’un microscope inversé (figure 4).
Une fois incorporées, les cellules de la matrice HMDM/fibrine ont commencé à envahir rapidement après une journée et étendues dans la matrice (figure 4A). Les cellules du MSDM n’ont pas envahi la matrice environnante, formant plutôt une structure asymétrique (figure 4B). D’autre part, les cellules du collagène envahissent légèrement, mais en raison du rétrécissement de la matrice, l’analyse est difficile (figure 4C). Dans certains puits de collagène, les sphéroïdes ont même disparu après trois jours (figure 4C).
La figure 5 illustre la quantification de l’invasion cellulaire en hmdm/fibrine de la lignée de cellules du larynx primaire du SCC ut-SCC-42A et de la lignée de cellules métastatiques ut-SCC-42B correspondante. La vidéo (film 1) prise à l’aide d’un système d’analyse de cellules vivantes du sphéroïde hmdm/fibrine montre le mouvement des cellules du SCC dans la matrice où elles forment des brins suivis par les autres cellules.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig1v2.jpg"> Figure 1 : Segmentation d’image. Étapes sélectionnées de segmentation d’image en utilisant ilastik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig1v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig2.jpg"> La figure 2 : Réglage de l’échelle. Étapes sélectionnées de la mise à l’échelle à l’aide de Fiji ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig3.jpg"> Figure 3 : Analyse d’invasion avec ImageJ. Étapes sélectionnées de l’analyse d’image à l’aide de Fiji ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig4.jpg"> Figure 4 : Invasion de cellules ut-SCC-42B dans trois matrices différentes. Images représentatives de l’invasion de cellules SCC dans les sphéroïdes 3D. L’invasion a été suivie pendant trois jours et des images ont été prises quotidiennement à l’aide d’un microscope inversé. (A) hmdm/fibrine, (B) msdm, (C) collagène. La dernière colonne représente la clarification de l’invasion du jour 3. Barre d’échelle = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig5.jpg"> Figure 5 : Quantification de l’invasion des cellules du SCC en HMDM/fibrine. Le larynx primaire UT-SCC-42A et l’invasion de la lignée cellulaire du larynx métastatique UT-SCC-42B du SCC ont été analysés à l’aide du logiciel ImageJ d’ilastik et de Fiji. Les résultats représentent une moyenne ± écart-type de trois expériences indépendantes, chacune en triplicate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59567/59567video1.jpg"> Vidéo 1: Mouvement SCC Cell au sein du HMDM/fibrine pendant trois jours. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/Video_1.wmv" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Cliquez avec le bouton droit de la souris pour télécharger.)</a>

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Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Le microenvironnement tumoral est une partie essentielle de la croissance du cancer et de l’invasion. Pour imiter la progression du carcinome, une matrice humaine biologiquement pertinente est nécessaire. Ce protocole introduit une amélioration pour le test in vitro d’invasion de sphéroïdes en trois dimensions en appliquant une matrice humaine à base de leiomyoma. Le protocole introduit également une analyse d’invasion cellulaire basée sur ordinateur.

Matrice entièrement humaine basée sur la tumeur dans l’essai d’invasion de sphéroïdes en trois dimensions

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Comme nous le savons déjà, le microenvironnement tumoral est une partie essentielle de la croissance et de l’invasion du cancer. Pour imiter la progression du carcinome, nous avons besoin d’une matrice de tumeur humaine biologiquement pertinente. C’est la seule matrice de tumeur humaine basée sur l’essai in vitro d’invasion.Par rapport à l’analyse sphéroïde classique, cette méthode n’est pas aussi sensible à la température et ne nécessite pas de transfert sphéroïde. Cette technique convient aux échantillons solides de cancer patients-dérivés tels que le carcinome de tête et de cou et peut s’étendre à la médecine personnalisée comprenant des thérapies de chemoradiation. Cette matrice basée sur la tumeur humaine a déjà été employée pour plusieurs applications comprenant le essai de drogue à haut débit, l’analyse de cellules vivantes, la guérison de blessure, et les essais de transfert.L’étape la plus techniquement sensible est la manipulation de la méthode du fibrinogen est ajouté de sorte que vous voudrez peut-être d’abord pratiquer cette étape avec des puits vides. Il est important de montrer la bonne manipulation de la matrice et il est facile à analyser en montrant la méthode visuellement. Pour la génération sphéroïde multicellulaire de tumeur, distribuez une fois 10 aux cellules tierces de la ligne cellulaire d’intérêt dans 50 microlitres du milieu complet dans chaque puits d’une plaque ronde-bas d’attachement ultra-basse de 96 puits.Ensuite, placez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire de 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant quatre jours avant de confirmer visuellement la formation sphéroïde tumorale au microscope inversé. Pour mettre en place un test tridimensionnel d’invasion sphéroïde, décongelez la matrice humaine dérivée du myoma sur la glace et décongelez la solution de stock de fibrinogen dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. Lorsque les rééconts se sont réchauffés, mélanger les volumes appropriés de matrice moyenne complète dérivée du myome humain, de thrombine, d’aprotinine et de fibrinogen, en ajoutant le fibrinogène juste avant de distribuer le mélange matriciel dans les cellules.Ajoutez immédiatement 50 microlitres du gel résultant dans chaque puits de la plaque de culture sphéroïde, en dirigeant la pointe vers la paroi intérieure de chaque puits et en ralentissant sans déplacer le sphéroïde du centre du puits. Puisque le fibrinogène commence à geler après quelques minutes, il exige un pipetting inverse robuste mais précis et le traitement de seulement quelques puits à la fois. Remettre la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pendant 30 minutes pour permettre au gel fibrine matriciel dérivé du myoma humain de se solidifier avant d’ajouter doucement 100 microlitres de milieu complet au sommet de chaque gel.Puis l’image de l’invasion sphéroïde tous les jours. Pour la segmentation d’images avec ilastik, ouvrez le logiciel open-source de classification et de segmentation d’image et sélectionnez le flux de travail Pixel Classification. Enregistrez le projet ilastik sur l’ordinateur.Les pixels seront classés en fonction des annotations faites par l’utilisateur. Cliquez sur Les données d’entrée et ajoutez-en de nouvelles pour sélectionner des images pour l’analyse. Pour la sélection des fonctionnalités, cliquez sur Sélection de fonctionnalités et Sélectionnez les fonctionnalités.Cliquez sur les cases appropriées pour sélectionner les fonctionnalités d’intérêt. Les boîtes sélectionnées passeront au vert. Pour une formation, cliquez sur Formation.Dans la section Formation, il devrait y avoir deux étiquettes, l’étiquette 1 et l’étiquette 2. Marquez l’arrière-plan avec l’une des étiquettes et marquez les cellules avec l’autre étiquette. Lorsque toutes les cellules et l’arrière-plan de la première image ont été étiquetés, sélectionnez l’image suivante à partir de la vue actuelle pour continuer à marquer les cellules et l’arrière-plan jusqu’à ce que 10% des images aient été marquées.Sélectionnez Ensuite Mise à jour en direct pour analyser toutes les images. Lorsque la formation est terminée et qu’ilastik a analysé toutes les images, cliquez sur Prédiction Export et sélectionnez Segmentation simple à partir de source. Sélectionnez ensuite le format de fichier de sortie souhaité parmi Choisissez les paramètres d’image d’exportation et cliquez sur Export All pour exporter les résultats de l’étiquetage.Les fichiers seront exportés vers le même dossier avec les images originales. Pour l’analyse de zone, ouvrez d’abord l’image originale avec une barre d’échelle dans Fiji ImageJ, en prenant soin que l’image a la même taille et la même dimension que les images analysées. Utilisez l’outil de sélection des lignes pour tracer une ligne d’une longueur connue et cliquez sur Analyser et définir l’échelle.Réglez ensuite la distance connue dans le champ de distance connu. Réglez l’unité appropriée et cliquez sur Global. Pour installer le plugin ilastik, cliquez sur Aide et Mise à jour et cliquez sur Gérer les sites de mise à jour dans la fenêtre mise à jour ImageJ.Cliquez à côté d’ilastik, Fermer et appliquer les modifications. Après plusieurs minutes, une fenêtre d’information apparaîtra disant mise à jour avec succès. Cliquez sur OK et redémarrez ImageJ.Ensuite, cliquez sur Plugins, Macros, et installer et sélectionner le compteur. fichier ijm. Cliquez ensuite sur Ouvrir.Pour compléter l’analyse de zone, cliquez sur Plugins et faites défiler pour sélectionner ilastik. Sélectionnez Import HDF5 et sélectionnez le fichier avec le format h5. Cliquez sur Ouvrir et charger et appliquer la table de recherchez.Cliquez ensuite sur le bouton A sur le clavier et la zone apparaîtra dans la fenêtre de résumé comme zone totale. Dans cette expérience représentative, quatre jours après l’ensemencement métastatique de cellules squameuses de cellules squamous de laryngeal, la matrice a été ajoutée sur les sphéroïdes formés comme démontré et l’invasion a été surveillée quotidiennement sur un microscope inversé. Une fois intégrées, les cellules de la matrice fibrine dérivée du myoma humain ont commencé à envahir rapidement après un jour et se sont étendues dans la matrice au cours des deux jours suivants.Les cellules de la matrice dérivée du sarcome de souris n’ont pas envahi la matrice environnante, formant plutôt une structure asymétrique. Les cellules dans le collagène ont envahi légèrement mais en raison du rétrécissement de matrice l’analyse est devenue difficile. Dans certains puits, les sphéroïdes ont même disparu au bout de trois jours.Ici, la quantification de l’invasion d’une carcinome squamous laryngeal primaire et métastatique de cellules squamous dans la matrice fibrine myoma-dérivée humaine est montrée. L’analyse à cellules vivantes de l’invasion sphéroïde de matrice fibrine dérivée du myoma humain révèle le mouvement cellulaire dans les brins dans toute la matrice qui est suivi par d’autres cellules au fil du temps. N’oubliez pas de faire attention de ne pas déplacer le sphéroïde de la position centrale lors de l’ajout de la matrice aux puits.Cette procédure peut être utilisée pour étudier comment l’irradiation et des molécules spécifiques telles que les médicaments contre le cancer affectent l’invasion. Les cellules peuvent être fixées et tachées pour des études ultérieures. Dans le modèle classique du sarcome de souris, les cellules prolifèrent principalement et l’aspect invasion est minime.Cette matrice tumorale humaine induit l’invasion, rendant les études d’inhibition plus efficaces.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Etude des vecteurs viraux dans un trois dimensions du foie Modèle repeuplée avec le Human Carcinome hépatocellulaire Cell Line HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Déplacement vers le haut : Un Simple et Flexible In Vitro Invasion en trois dimensions Assay protocole

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Analyser la Communication entre les Monocytes et les cellules cancéreuses du sein primitif dans une matrice extracellulaire extrait (ECME)-système tridimensionnel

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Génération des sphéroïdes High-Throughput tumeur en trois dimensions pour le dépistage des drogues

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Un essai de mise à mort de sphéroïde par les cellules de T de voiture

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Modèle de matrice extracellulaire OS en trois dimensions pour l’ostéosarcome

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Un modèle sphéroïde 3D comme un système plus physiologique pour les fibroblastes associés au cancer différenciation et l'invasion des études in vitro

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Caractérisation des effets des inhibiteurs migrastatiques sur l'invasion sphéroïde de tumeur 3D par microscopie confocale de haute résolution

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Évaluation de la mort cellulaire à l’aide d’un surnageant sans cellules de probiotiques dans des cultures sphéroïdes tridimensionnelles de cellules cancéreuses colorectales

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Modèle biomimétique in vitro tridimensionnel de neuroblastome à l’aide d’échafaudages à base de collagène

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...