Name: fully human tumor-based matrix in three-dimensional spheroid invasion assay
Uploaded: 2019-05-07T14:45:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay at JoVE.com

Forfatterne takker Oppdragsgivers av denne studien: Sigrid Jusélius Foundation, Cancer Society of Finland, og Helsinki University Central Hospital forskningsmidler. Forfatterne anerkjenner Biomedicum Imaging Unit ved Universitetet i Helsingfors for teknisk hjelp.

1. generering av flercellede tumor Spheroids
Merk: Protokollen er demonstrert her med UT-SCC-42A og-42B cellelinjer, men det kan også brukes ved hjelp av andre cellelinjer.
<ol><li>Vask UT-SCC-42A og-42B celler med 6 mL fosfat-bufret saltvann (PBS), tilsett 0,05% Trypsin-EDTA (3 mL for 75 cm2 kolbe), og plasser flasken i en cellekultur inkubator (37 ° c, 5% co2, 95% fuktighet) for 2-5 min.</li>
	<li>Kontroller at cellene har løsnet under et mikroskop. Deretter legger komplett Dulbecco ' s modifiserte Eagle ' s medium (DMEM) Media (DMEM + 10% fosterets storfe serum, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL Streptomycin, 250 ng/mL amfotericin B, 0,4 μg/mL Hydrocortisone, og 50 μg/mL askorbinsyre) for å nøytralisere enzymet (6 mL for 75 cm 2 kolbe) og overføre celle suspensjonen til en 15 ml konisk rør. Merk: Velg cellekultur mediet som passer til cellene som blir studert.</li>
	<li>Sentrifuger celle fjæringen ved 200 x g i 5 min.</li>
	<li>Fjern supernatanten og suspendere celle pellet i 2-5 mL komplett DMEM.</li>
	<li>Telle cellene og fortynne celle suspensjonen med komplett DMEM til en endelig konsentrasjon av 20 000 celler/mL. Merk: Optimal celle telling må fastsettes for hver cellelinje.</li>
	<li>Dispensere 50 μL av celle fjæringen i hver ultra-lav feste 96-vel rund bunnplate godt for en endelig konsentrasjon av 1 000 celler per brønn.</li>
	<li>Overfør platen til cellekultur inkubator (37 ° c, 5% CO2, 95% fuktighet). Fire dager senere, visuelt bekrefte tumor spheroid formasjon med en invertert mikroskop og fortsette med analysen. Sørg for at det bare er én spheroid per brønn. Merk: Tiden det tar å danne en spheroid, varierer mellom ulike cellelinjer.</li>
</ol>2. tredimensjonal spheroid invasjon analysen
Merk: Forbered 2x løsning fordi gelen vil bli fortynnet 1:1 når den legges inn i brønnene.
<ol><li>Tin HMDM på is og fibrinogen lagerløsning i et vannbad opprettholdt ved 37 ° c. Ikke forstyrr fibrinogen før det er helt solubilized og ikke sette løsningen på isen; nedbør vil forekomme.</li>
	<li>Bland sammen riktig volum for hver reagens: 1 mg/mL HMDM (endelig konsentrasjon: 0,5 mg/mL), 0,6 U/mL trombin (endelig konsentrasjon: 0,3 U/mL), 66,6 mg/mL aprotinin (endelig konsentrasjon: 33,3 UG/mL), og 1 mg/mL fibrinogen (endelig konsentrasjon: 0,5 mg/mL ). Merk: Tilsett fibrinogen like før blandingen inn i brønnene og arbeid raskt; det vil danne en gel i noen minutter. Behandle bare noen få brønner om gangen.</li>
	<li>Tilsett 50 μL av gelen i hver brønn. Direkte spissen mot innsiden veggen av brønnen og Pipet langsomt. Unngå luftbobler (ved hjelp av omvendt pipettering teknikk) og prøv å ikke flytte spheroid fra midten av brønnen.</li>
	<li>Returner platen tilbake til cellen kultur inkubator og la HMDM/fibrin matrise å stivne i 30 min, og forsiktig legge til 100 μL av komplette DMEM i hver brønn på toppen av gel.</li>
</ol>3. avbildning
<ol><li>Bilde spheroids daglig ved hjelp av en invertert lys mikroskop. Alternativt kan du bruke automatiske bilde systemer.</li>
</ol>4. bilde segmentering med Ilastik
<ol><li>Åpne ilastik og velg piksel klassifiserings arbeidsflyt (figur 1A). Den klassifiserer pikslene basert på merknader brukeren har gjort. Lagre ilastik prosjekt (. ILP) på datamaskinen.</li>
	<li>Legg til bilder for analyser. Klikk på inn data og Legg til ny , og velg deretter bilder (figur 1B).</li>
	<li>
For funksjonsvalg klikker du funksjonsvalg og utvalgte funksjoner (figur 1C, rødt rektangel). Merk: de valgte funksjonene bør grovt tilsvare de visuelle egenskapene som skiller objektene fra bakgrunnen, og de vil bli brukt til å trene klassifisereren.<ol>
<li>Velg funksjoner ved å klikke boksene. De valgte boksene vil bli grønne (figur 1C, blått rektangel). Merk: Her kan brukeren velge mellom flere forskjellige funksjonstyper og skalaer. Farge/intensitet bør velges for å skille objekter basert på farge eller lysstyrke. Kant bør velges for å skille objekter basert på lysstyrke eller fargegraderinger. Texture er en viktig funksjon hvis objektene i bildet har en spesiell textural utseende. For denne analysen brukes farge/intensitet (Sigma 0) og Edge (Sigma 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
For opplæring, klikk opplæring og i opplæring-delen er det to etiketter: etikett 1 og etikett 2 (figur 1D, rødt rektangel). Hvis det bare er én etikett, legger du til en ny etikett ved å trykke på Legg til etikett (figur 1D, blått rektangel).
	<ol>
<li>Merk bakgrunnen med en av etikettene (figur 1d, gul) og cellene med den andre etiketten (figur 1D, blå).</li>
		<li>Tren programvaren for de første 10% av bildene. Velg Neste bilde fra gjeldende visning.</li>
		<li>Når cellene og bakgrunnen er merket (i det første bildet), trykker du Live Update (figur 1D, lilla rektangel). Merk: med det neste bildet vil ilastik automatisk utføre analysen i henhold til tidligere bilder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Etter trening er gjort og ilastik har analysert alle bilder, klikk prediksjon Export. Velg enkel segmentering fra kilde; Ikke Velg sannsynligheter eller noe annet (figur 1E).</li>
	<li>Velg ønsket utdataformat fra Velg Eksporter bildeinnstillinger... i delen prediktiv eksport (figur 1E). Eksporter resultatene av merkingen ved å klikke på Eksporter alle (figur 1F). Filene vil bli eksportert til den samme mappen med de opprinnelige bildene. Merk: i dette eksperimentet brukes. H5-format.</li>
</ol>5. areal analyse med Fiji ImageJ
<ol><li>
Skaler innstilling
	<ol>
<li>Åpne det opprinnelige bildet med en skala bar i Fiji ImageJ (figur 2a). Kontroller at bildet har samme størrelse og dimensjon som de analyserte bildene. Bruk linje markeringsverktøyet til å tegne en linje med en kjent lengde (figur 2B). Merk: Denne protokollen er utført ved hjelp av Fiji ImageJ 1,51 (64-bit) og ilastik-1.3.2 RC.</li>
		<li>Klikk analyser og Angi skala (figur 2C). Angi den kjente avstanden i feltet kjent avstand , og angi riktig enhet og klikk på global (figur 2D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Installere makroen
	<ol>
<li>Hvis en plugin ilastik ikke er installert, følger du denne fremgangsmåten: Klikk Hjelp, oppdatering.... På det åpne vinduet ImageJ Updater, klikk på Administrer oppdaterings områder. I det åpne vinduet Behandle oppdaterings områder, klikk Neste for å Ilastik klikk deretter Lukk. Deretter klikker du på Bruk endringer i vinduet ImageJ Updater. Denne prosessen kan ta litt tid. Det neste vinduet vil være informasjon med teksten oppdatert vellykket. Falle i staver OK og hvile ImageJ.</li>
		<li>Klikk på plugins, makroerog Installer (Figur 3A). Velg deretter Counter. ijm-filen (se tilleggsinformasjon) og klikk på Åpne. Merk: Makroen ble skrevet spesielt for å måleområdet. Makroen bør installeres hver gang programvaren åpnes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Areal analyse
	<ol>
<li>Analyser bilder når alle plugins er installert. Klikk plugins og bla ned til ilastik (Figur 3C). Velg IMPORTER HDF5, velg filen med. H5-format, klikk Åpne og Last inn og påfør lut (Figur 3C, D).</li>
		<li>Trykk på a -knappen fra tastaturet (makro) og området vil vises i Oppsummerings vinduet som totalt areal (Figur 3E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spheroids+with+Enhanced+Aggressiveness+to+Mimic+Human+Liver+Cancer+In+vitro+and+In+Vivo.">Cell Spheroids with Enhanced Aggressiveness to Mimic Human Liver Cancer In vitro and In Vivo.</a> Scientific Reports. 7, 10499-10514 (2017).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29 (2012).</li><li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research:+Focus+on+tumor+spheroid+model.">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology and Therapeutics. , 94-108 (2016).</li><li>Albanese, A., Lam, A. K., Sykes, E. A., Rocheleau, J. V., Chan, W. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-on-a-chip+provides+an+optical+window+into+nanoparticle+tissue+transport.">Tumour-on-a-chip provides an optical window into nanoparticle tissue transport.</a> Nature Communications. 4, 2718 (2013).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nature Protocols. 4, 309-324 (2009).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cancer+Cell+Spheroid+Assay+to+Assess+Invasion+in+a+3D+Setting.">A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53409 (2015).</li><li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+(3D)+Tumor+Spheroid+Invasion+Assay.">Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52686 (2015).</li><li>Salo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+leiomyoma+tissue+derived+matrix+for+cell+culture+studies.">A novel human leiomyoma tissue derived matrix for cell culture studies.</a> BMC Cancer. 15, 981 (2015).</li><li>Nurmenniemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+organotypic+model+mimics+the+tumor+microenvironment.">A novel organotypic model mimics the tumor microenvironment.</a> The American Journal of Pathology. 175, 1281-1291 (2009).</li><li>Salo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+three-dimensional+assays+based+on+human+leiomyoma-derived+matrices.">Organotypic three-dimensional assays based on human leiomyoma-derived matrices.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160482 (2018).</li><li>Overall, C. M., Blobel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+search+of+partners:+linking+extracellular+proteases+to+substrates.">In search of partners: linking extracellular proteases to substrates.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 245-257 (2007).</li><li>Ahmed, T. A. E., Dare, E. V., Hincke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin:+a+versatile+scaffold+for+tissue+engineering+applications.">Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 14 (2), 199-215 (2008).</li><li>Hoornstra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fermented+Lingonberry+Juice+Inhibits+Oral+Tongue+Squamous+Cell+Carcinoma+Invasion+In+vitro+Similarly+to+Curcumin.">Fermented Lingonberry Juice Inhibits Oral Tongue Squamous Cell Carcinoma Invasion In vitro Similarly to Curcumin.</a> In Vivo. 32, 1089-1095 (2018).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Den presenterte metoden gir en 3D menneskelig tumor-basert analyse for å evaluere invasiveness av kreftceller i menneskets svulst mikromiljøet etterligne matrise. Kreftcelle invasjon kan lett måles ved daglig bildebehandling med en standard mikroskop og ved hjelp av bildeanalyse programvare. Metoden demonstrerer celle invasjon i stedet for bare spredning.
I motsetning MSDM, det HMDM/fibrin matrise er ikke forlange alle temperatur administrere. Denne metoden er enkel å utføre, spesielt uten behov for å overføre spheroids fra en plate til en annen. Den har bare en teknisk følsom skritt, tillegg av fibrinogen til matrisen. Siden fibrinogen begynner å gel etter noen minutter, legger fibrinogen krever robust pipettering og behandling av bare noen få brønner om gangen. Det er også en risiko for å forstyrre spheroid og flytte den fra sin sentrale posisjon i U-formet brønn hvis pipettering er gjort i et høyt trykk måte. Forvridning av spheroid kan komplisere bildebehandling og til slutt analysen.
Analysen kan endres ved å endre konsentrasjonen av HMDM eller fibrinogen. Cellene kan også være fast og beiset for påfølgende molekylær studier. Selv om denne metoden kan endres til en helautomatisk form, kan den også utføres med et vanlig mikroskop og to åpen kildekode-programvare, uten behov for kostbart utstyr.
Sammenlignet med den tradisjonelle MSDM-baserte 3D-Analyser, denne analysen kan vise bedre celle invasjonen egenskaper. Spheroids vokst i en kjeller membran-inneholdende laminin-rik matrise, som MSDM, kan ha mer spredning av kreftceller enn selve invasjonen, rendering det uegnet for invasjon analyser i flere kreftcelle linjer på grunn av deres lave invaderende kapasitet. En annen hyppig brukt matrise, type I kollagen, har en tendens til å krympe fra kantene under 3D dyrking, noe som påvirker spheroid lokalisering og bildebehandling av brønnene. I tillegg er forskjellene mellom den iboende invasive egenskaper av de mer (HSC-3) og mindre (SCC-25) aggressive tungen kreftcelle linjer har blitt demonstrert ved hjelp av menneskelig svulst mikromiljøet etterligne modeller (myoma plater og løselig form Matrix)10,13.
Analysen er også mer etisk enn å bruke MSDM siden HMDM er Hentet fra leftover materiale av menneskelig leiomyoma svulst. Foreløpig er HMDM den eneste tilgjengelige menneskelige tumor-avledet ECM produkt som synes å være egnet for mange kreft-relaterte in vitro analyser8,10. I fremtiden, animalsk vev-avledet matriser kunne erstattes av menneskelig tumor-baserte matriser for å redusere behovet for å ofre dyr for matrise produksjon.
Skifte 2D cellekultur analyser med 3D-metoder gir mer nøyaktig informasjon om kreftcelle atferd. Foreløpig er det flere 3D-modeller og kommersielle matriser, men dessverre ingen er egnet for alle kreftcelle linjer. Forskere bør velge den mest egnede matrise for deres spesielle analysen. Optimal Matching av analysen og matrise kan være utfordrende, men det kan betydelig øke påliteligheten av resultatene.

Konvensjonelle to-dimensjonale (2D) cellekultur studier har betydelig bidratt til kreftforskning. Foreløpig er forskere skiftende mer mot tredimensjonale (3D) cellekultur analyser for å bedre etterligne in vivo forhold1. Den 3D kreftcelle kulturen mer nøyaktig reflekterer komplekse tumor mikromiljøet i form av celle-celle og celle-matrise interaksjoner, Gene Expression profiler, narkotika følsomhet, og signalering Pathway aktivitet2,3.
Flere 3D cellekultur modeller brukes i kreftforskning som tumor vev explant, tumor på en chip, og flercellede tumor spheroids3,4. Flercellede tumor spheroids er nå mye brukt, som de etterligner flere funksjoner i in vivo forhold i Human svulster1,5. Når spheroid diameter er større enn 500 μm, har det til og med hypoxic regioner og et nekrotisk senter, som representerer således in vivo tumor situasjon2.
Mange syntetiske (f. eks, Polydimethylsiloxan) og animalske avledet (f. eks, Rat tail type I kollagen og mus sarkom-avledet matrise, Matrigel, referert til som MSDM) matriser er utviklet for 3D cellekultur analyser3,6, 7,8. Hittil har ingen av de kommersielt tilgjengelige matriser stammer fra menneskelig tumor vev. Derfor mangler de funksjonene til den menneskelige tumor mikromiljøet, som har betydelige virkninger på kreftcelle invasjon prosesser8.
Myogel (humant myoma-avledet matrise, referert til som HMDM) er Hentet fra menneskelig livmor leiomyoma tumor vev9. Det har vist seg at proteininnholdet i HMDM avviker vesentlig fra MSDM. 66% av HMDM proteiner er faktisk forskjellig fra MSDM proteiner. På den annen side, noen proteiner, som laminin, type IV kollagen, heparan sulfat proteoglycans, nidogen, og epidermal vekstfaktor, er til stede i begge matriser10. I tillegg musen skiller seg fra det menneskelige i enzymet innholdet, med mennesker som har 78 færre proteaser enn mus11.
Fibrin har blitt mye brukt alene eller i kombinasjon med andre materialer som et stillas materiale12. I 3D cellekultur analyser, kommersielt tilgjengelig menneskelig fibrinogen og trombin kombineres for å danne en fibrin hydrogel12.
Denne protokollen beskriver en forbedring av tidligere innført 3D svulst spheroid invasjon analysen7. Denne nye protokollen gjelder menneskelige tumor-avledet matrise i stedet for mus-avledet tumor matrise. Det innebærer også Imaging og analyse teknikker ved hjelp ilastik og Fiji ImageJ programvare. Denne protokollen kan brukes til spheroid analysen av flere forskjellige solide kreftcelle linjer. Det tilbyr et biologisk relevant verktøy for å utvikle romanen anti-kreft terapier og å studere effekten av spesifikke molekyler på kreftcelle invasjon.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:791px;" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:256px;">Amphotericin B solution</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">A2942</td>
			<td style="width:323px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Aprotinin from bovine lung</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">A6279</td>
			<td>Measure the protein concentration before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:93px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A1052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">BioLite Cell Culture Treated Flasks</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">130190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:93px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">31330-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">DS-Fi2 Digital Camera</td>
			<td style="width:93px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">DS-U3 Digital Camera Controller</td>
			<td style="width:93px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Eclipse TS100 Inverted Microscope</td>
			<td style="width:93px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:93px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10270106</td>
			<td>Heat inactivate for 30 min at 56&#176;C in waterbath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">341578</td>
			<td>Solubility: 25 mg/ml in H&#8322;O. Warm the H&#8322;O and the fibrinogen to 37&#176;C prior to dissolution. Do not disturb until the fibrinogen is completely solubilized. Stock solutions stored at -70&#176;C should be thawed in a water bath maintained at 37&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Fiji ImageJ 1.51 image processing program</td>
			<td style="width:93px;">Freeware, NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Ilastik software for image classification and segmentation</td>
			<td style="width:93px;">Freeware</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System</td>
			<td style="width:93px;">Essen BioScience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Myogel</td>
			<td style="width:93px;">Lab made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:93px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:93px;">Lab made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Scepter 2.0 Cell Counter</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">PHCC20040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Scepter Cell Counter Sensors, 60 &#181;m</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">PHCC60050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Thrombin from human plasma</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">T6884-100UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Trypsin-EDTA (0.5%) 10X, no phenol red</td>
			<td style="width:93px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Ultra-Low Attachment 96-Well Plate</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">UT-SCC-42A and UT-SCC-42-B cell lines</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The cell lines were established at the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Turku University Hospital (Turku, Finland).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully human tumor-based matrix in three-dimensional spheroid invasion assay

To-dimensjonal cellekultur-baserte analyser er ofte brukt i in vitro kreftforskning. Men de mangler flere grunnleggende elementer som danner tumor mikromiljøet. For å oppnå mer pålitelige resultater i vitro, har det blitt innført flere tredimensjonale (3D) cellekultur analyser. Disse analysene tillate kreftceller til å samhandle med ekstracellulære matrise. Denne samhandlingen påvirker celle virkemåten, for eksempel spredning og invasjon, i tillegg til celle morfologi. I tillegg kan denne samhandlingen indusere eller undertrykke uttrykk for flere Pro-og anti-tumorigene molekyler. Spheroid invasjon analysen ble utviklet for å gi en egnet 3D in vitro metode for å studere kreftcelle invasjon. Foreløpig dyr avledet matriser, for eksempel mus sarkom-avledet matrise (MSDM) og rotte hale type I kollagen, er i hovedsak brukt i spheroid invasjon analysene. Tatt i betraktning forskjellene mellom den menneskelige tumor mikromiljøet og dyr avledet matriser, en menneskelig myoma-avledet matrise (HMDM) ble utviklet fra godartet livmor leiomyoma vev. Det har vist seg at HMDM induserer migrasjon og invasjon av kreftceller bedre enn MSDM. Denne protokollen ga en enkel, reproduserbar og pålitelig 3D menneskelig tumor-baserte spheroid invasjon analysen ved hjelp av HMDM/fibrin matrise. Den inneholder også detaljerte instruksjoner om bildebehandling og analyse. Spheroids vokser i en U-formet ultra-lav festeplate i HMDM/fibrin matrise og invadere gjennom det. Invasjonen er daglig avbildet, målt, og analysert ved hjelp av ilastik og Fiji ImageJ programvare. Analysen plattformen ble demonstrert ved hjelp av humant laryngeal primære og metastatisk plateepitel celle kreftcelle linjer. Imidlertid er protokollen egnet også for andre solid kreftcelle linjer.

Fire dager etter UT-SCC-42B (metastatisk laryngeal SCC cellelinje) celle seeding, matrisen (HMDM/fibrin, MSDM, eller kollagen) ble lagt på dannet spheroids (dag 0) og invasjonen ble overvåket i tre dager. Bildene her ble innhentet daglig ved hjelp av en invertert mikroskop (Figur 4).
Når innebygd, celler i HMDM/fibrin matrise begynte å invadere raskt etter en dag og utvidet til matrisen (Figur 4A). Celler i MSDM ikke invadere i den omkringliggende matrise, i stedet danner en asymmetrisk struktur (Figur 4B). På den annen side har celler i kollagen invadert litt, men på grunn av matrisen krymping analysen var vanskelig (Figur 4C). I noen kollagen brønner, spheroids selv forsvant etter tre dager (Figur 4C).
Figur 5 illustrerer kvantifisering av celle INVASJONEN i HMDM/fibrin av den PRIMÆRE laryngeal SCC cellelinje ut-SCC-42a og tilsvarende metastatisk cellelinje ut-SCC-42B. Videoen (film 1) tatt ved hjelp av en live-celle analysesystem av HMDM/fibrin spheroid viser BEVEGELSEN av SCC cellene i matrisen der de danner tråder etterfulgt av de andre cellene.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig1v2.jpg"> Figur 1 : Bilde segmentering. Valgte trinn i bilde segmentering ved hjelp av ilastik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig1v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig2.jpg"> Figur 2 : Skaler innstilling. Valgte trinn i skaleringsinnstillingen ved hjelp av Fiji ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig3.jpg"> Figur 3 : Invasjonen analyse benytter ImageJ. Valgte trinn for bildeanalyse ved hjelp av Fiji ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig4.jpg"> Figur 4 : Ut-SCC-42B celle invasjon i tre forskjellige matriser. Representative bilder av SCC-celle invasjon i 3D-spheroids. Invasjonen ble fulgt i tre dager og bilder ble tatt daglig ved hjelp av en invertert mikroskop. (A) HMDM/fibrin, (B) MSDM, (C) kollagen. Den siste kolonnen representerer avklaring av dag 3 invasjon. Scale bar = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59567/59567fig5.jpg"> Figur 5 : Kvantifisering av SCC celle invasjon i HMDM/fibrin. Primær laryngeal UT-SCC-42A og tilsvarende metastatisk laryngeal UT-SCC-42B SCC cellelinje invasjon ble analysert ved hjelp av ilastik og Fiji ImageJ programvare. Resultatene representerer gjennomsnittlig ± standardavvik på tre uavhengige eksperimenter, hver i tre eksemplarer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/59567fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59567/59567video1.jpg"> Video 1: SCC Cell bevegelse innenfor HMDM/fibrin i tre dager. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59567/Video_1.wmv" target="_blank">Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay at JoVE.com

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Tumor mikromiljøet er en viktig del av kreft vekst og invasjon. Å etterligne kreft progresjon, en biologisk relevant menneskelig matrise er nødvendig. Denne protokollen introduserer en forbedring for in vitro tre-dimensjonal spheroid invasjon analysen ved å bruke en menneskelig leiomyoma matrise. Protokollen introduserer også en datamaskin-basert celle invasjon analyse.

Fullt Human tumor-baserte Matrix i tredimensjonale spheroid Invasion analysen

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Som vi allerede vet, er tumormikromiljøet en viktig del av kreftvekst og invasjon. For å etterligne karsinomprogresjon trenger vi en biologisk relevant menneskelig tumormatrise. Dette er den eneste menneskelige tumormatrisen basert in vitro invasjonsanalyse.Sammenlignet med den klassiske sfæroidanalysen, er denne metoden ikke så temperaturfølsom og krever ikke sfæroid overføring. Denne teknikken er egnet for pasientavledede solide kreftprøver som hode- og nakkekarsinom og kan strekke seg mot personlig medisin, inkludert kjemoradiasjonsbehandling. Denne menneskelige tumorbaserte matrisen har allerede blitt brukt til flere applikasjoner, inkludert høy gjennomstrømning narkotikatesting, live-celle analyse, sårheling, og overføre analyser.Det mest teknisk følsomme trinnet er metodens håndtering av fibrinogen er lagt til, slik at du kanskje først skal øve dette trinnet med tomme brønner. Det er viktig å vise riktig håndtering av matrisen, og det er enkelt å analysere ved å vise metoden visuelt. For flercellet tumor spheroid generasjon, dispensere en ganger 10 til de tredje cellene fra cellelinjen av interesse i 50 mikroliter av komplett medium inn i hver brønn av en 96-godt ultra-lav vedlegg rundbunnsplate.Plasser deretter platen i en 37 grader Celsius og 5% karbondioksidcellekulturinkubator i fire dager før visuelt bekrefter tumorsfæroiddannelse med et omvendt mikroskop. For å sette opp en tredimensjonal spheroid invasjon analyse, tine menneskelig myoma-avledet matrise på is og tine fibrinogen lager løsning i en 37 grader Celsius vannbad. Når reagensene har varmet, bland sammen de riktige volumene av komplett medium, human myoma-avledet matrise, trombin, aprotinin og fibrinogen, og tilsett fibrinogen like før dispensering av matriseblandingen inn i cellene.Tilsett umiddelbart 50 mikroliter av den resulterende gelen i hver brønn av spheroid kulturplaten, og diriger spissen mot innsiden av hver brønn og pipettering avtar uten å flytte sfæroiden fra midten av brønnen. Siden fibrinogen begynner å gele etter noen minutter, krever det en robust, men presis omvendt pipettering og behandling av bare noen få brønner om gangen. Returner platen til cellekulturinkubatoren i 30 minutter for å la den menneskelige myoma-avledede matrisefibringelen stivne før du forsiktig legger til 100 mikroliter med komplett medium til toppen av hver gel.Deretter bilde spheroid invasjonen daglig. For bildesegmentering med ilastik åpner du bildeklassifiserings- og segmenteringsprogramvaren med åpen kildekode og segmentering og velger Arbeidsflyt for pikselklassifisering. Lagre ilastik-prosjektet på datamaskinen.Pikslene vil bli klassifisert basert på merknader gjort av brukeren. Klikk Inndata og Legg til ny for å velge bilder for analysen. For funksjonsvalg klikker du Funksjonsvalg og Velg funksjoner.Klikk de aktuelle boksene for å velge funksjonene av interesse. De valgte boksene blir grønne. Klikk på Trening for en treningsøkt.I Opplæring-delen skal det være to etiketter, Etikett 1 og Etikett 2. Merk bakgrunnen med en av etikettene, og merk cellene med den andre etiketten. Når alle cellene og bakgrunnen i det første bildet er merket, velger du neste bilde fra gjeldende visning for å fortsette å merke cellene og bakgrunnen til 10 % av bildene er merket.Velg deretter Live Update for å analysere alle bildene. Når treningen er fullført og ilastik har analysert alle bildene, klikker du På forutsi eksport og velger Enkel segmentering fra kilde. Velg deretter ønsket utdatafilformat fra Velg Eksporter bildeinnstillinger og klikk Eksporter alle for å eksportere resultatene av merkingen.Filene eksporteres til samme mappe med de opprinnelige bildene. For områdeanalyse åpner du først det opprinnelige bildet med en skalalinje i Fiji ImageJ, og passer på at bildet har samme størrelse og dimensjon som de analyserte bildene. Bruk linjevalgverktøyet til å tegne en linje med kjent lengde og klikke Analyser og angi skala.Angi deretter den kjente avstanden i feltet Kjent avstand. Angi riktig enhet, og klikk global. Hvis du vil installere plugin-modulen ilastik, klikker du Hjelp og oppdater og klikker på Administrer oppdateringsområder i ImageJ updater-vinduet.Klikk ved siden av ilastik, Lukk og Bruk endringer. Etter flere minutter vises et informasjonsvindu som sier oppdatert. Klikk OK og start ImageJ på nytt.Deretter klikker du plugins, makroer og Installer og velger telleren. ijm-filen. Klikk deretter Åpne.For å fullføre områdeanalysen, klikk Plugins og bla for å velge ilastik. Velg Importer HDF5, og velg filen med h5-formatet. Klikk Åpne og last inn, og bruk oppslagstabell.Klikk deretter A-knappen på tastaturet, og området vises i sammendragsvinduet som totalområdet. I dette representative eksperimentet, fire dager etter metastatisk laryngeal plateepitelkarsinomcellelinjesåing, ble matrise lagt til de dannede sfæroidene som demonstrert og invasjonen ble overvåket daglig på et omvendt mikroskop. Når de var innebygd, begynte celler i den menneskelige myoma-avledede fibrinmatrisen å invadere raskt etter en dag og strakte seg inn i matrisen i løpet av de neste to dagene.Celler i musen sarkom-avledet matrise invaderte ikke inn i den omkringliggende matrisen, i stedet danner en asymmetrisk struktur. Celler i kollagen invaderte litt, men på grunn av matrisekrymping ble analysen vanskelig. I noen brønner forsvant spheroidene til og med etter tre dager.Her vises kvantifisering av invasjonen av en primær og en metastatisk laryngeal plateepitelkarsinomcelle i human myoma-avledet fibrinmatrise. Live-celle analyse av menneskelig myoma-avledet fibrin matrise sfæroid invasjon avslører cellebevegelse i tråder gjennom matrisen som etterfølges av andre celler over tid. Husk å være forsiktig så du ikke flytter spheroiden fra midtstilling når du legger matrisen til brønnene.Denne prosedyren kan brukes til å studere hvordan bestråling og spesifikke molekyler som kreftmedisiner påvirker invasjon. Cellene kan festes og farges for senere studier. I den klassiske mussarkommodellen sprer cellene hovedsakelig seg og invasjonsaspektet er minimalt.Denne menneskelige tumorbaserte matrisen induserer invasjon, noe som gjør hemmingsstudiene mer effektive.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Studier av virale vektorer i et tredimensjonalt Liver Modell repopulated med Human leverkreft cellelinje HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Flytte oppover: En enkel og fleksibel In Vitro tredimensjonale invasjonen analysen protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Analysere kommunikasjonen mellom monocytter og primære brystkreft celler i en ekstracellulær Matrix ekstrakt (ECME)-basert tredimensjonale System

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generering av høy gjennomstrømming tredimensjonale svulst Spheroids for narkotikarelaterte Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

En Spheroid drapet analysen av bilen T celler

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Tredimensjonale bein ekstracellulær Matrix modell for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

En 3D spheroid modell som en mer fysiologisk system for kreft-Associated fibroblaster differensiering og Invasion in vitro studier

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering av effekter av Migrastatic hemmere på 3D tumor spheroid Invasion av høy oppløsning Konfokalmikroskopi mikroskopi

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluering av celledød ved hjelp av cellefri supernatant av probiotika i tredimensjonale sfæroidkulturer av kolorektale kreftceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Tredimensjonal in vitro biomimetisk modell av neuroblastom ved bruk av kollagenbaserte stillas

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...