Name: transplantation of chemogenetically engineered cortical interneuron progenitors into early postnatal mouse brains
Uploaded: 2019-08-26T13:00:00
Duration: 6 s
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यह काम एक ईआरसी स्टार्टर अनुदान (282047), एक वेलकम ट्रस्ट अन्वेषक पुरस्कार (095589/$/11/]), एक FP7 ईसी DESIRE अनुदान, और जेबी के लिए एक लिस्टर संस्थान पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था। वी.पी. की प्रयोगशाला में काम BBSRC (BB/L022974/1), ब्रिटेन चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एमआरसी), और फ्रांसिस क्रिक संस्थान (जो एमआरसी, कैंसर अनुसंधान ब्रिटेन, और वेलकम ट्रस्ट) से धन प्राप्त करता है द्वारा समर्थित है। एमडी प्रयोगशाला में अनुसंधान के लिए B.S.R.C. "Alexander फ्लेमिंग", ग्रीक अनुसंधान का समर्थन करने के लिए फाउंडेशन की पहल के भाग के रूप में Stavros Niarchos फाउंडेशन से अनुदान के माध्यम से संभव बनाया गया था.

<ol>
	<li>Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneuron+dysfunction+in+psychiatric+disorders.">Interneuron dysfunction in psychiatric disorders.</a> Nature Review Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).</li><li>Glausier, J. R., Lewis, D. 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लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

यहाँ हम सीआई परिपक्वता पर आंतरिक गतिविधि के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सीआई अग्रदूतों की गतिविधि आनुवंशिक रूप से संशोधित करने के लिए एक व्यापक रूप से सुलभ पद्धति का वर्णन, और / सर्किट.
अतीत में, हमारे सहित कई प्रयोगशालाओं, आनुवंशिक रूप से प्रक्षेपण न्यूरॉन्स6को संशोधित करने के क्रम में utero इलेक्ट्रोपोर्शन प्रयोगों में प्रदर्शन किया था। हालांकि, यूटेरो इलेक्ट्रोपोरोन में गुच्छिकाीय एमिनेंस में जिसमें सीआई संतति शामिल है, विद्युत चालन पथ समस्याओं के कारण बहुत मुश्किल है। आदेश में इस समस्या को हल करने के लिए, प्रयोगशालाओं की एक छोटी संख्या अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद प्रदर्शन कर रहे हैं, जो एक मांग तकनीक है कि महंगा उपकरण की आवश्यकता है. इस प्रोटोकॉल इन तरीकों जो वैज्ञानिक समुदाय के बहुमत के लिए सुलभ है के लिए एक विकल्प प्रदान करता है.
इस प्रोटोकॉल का सबसे चुनौतीपूर्ण पहलू में से एक कोशिकाओं है कि मेजबान प्रांतस्था में जीवित रहने के लिए चरणों परिपक्व करने के लिए की संख्या को अधिकतम करने के लिए है, जब phenotypic विश्लेषण आमतौर पर किया जाता है (बहुत प्रयोग डिजाइन पर निर्भर है, लेकिन आम तौर पर P17 से पुराने). वहाँ तीन महत्वपूर्ण कदम है कि अन्वेषक ध्यान देना चाहिए रहे हैं: (1) विद्युत पोर्शन की दक्षता. यह डीएनए प्लाज्मिड की शुद्धता सुनिश्चित करके अधिकतम किया जा सकता है। केवल उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए प्लाज्मिड (एकA 260/A280 अनुपात 1.9-2.0) इस प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. हम सीजियम क्लोराइड डीएनए शुद्धि को रोजगार द्वारा इस तरह के उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए तैयारी प्राप्त करते हैं। एक अन्य महत्वपूर्ण कारक प्रमोटर है कि ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति ड्राइव है. हमने पाया है कि pCAGGs वेक्टर, जो चिकन बी-actin प्रमोटर के होते हैं, अत्यंत शक्तिशाली है और नाटकीय रूप से विद्युत उत्पादन दक्षता में वृद्धि कर सकते हैं. (2) शुरू दाता भ्रूण की संख्या. यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि एक ही चरण के भ्रूणों की एक बड़ी संख्या (12-16) विद्युतीकृत हो। इस संख्या को बढ़ाया जा सकता है, यदि अधिक प्रयोगकर्ता भ्रूण विच्छेदन और एक साथ अनुभागकर प्रदर्शन कर रहे हैं, क्योंकि यह महत्वपूर्ण है कि भ्रूण cortical स्लाइस प्राप्त कर रहे हैं, electroporated और जितनी जल्दी हो सके इनक्यूबेटर को स्थानांतरित. (3) यह सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या परिपक्व चरणों तक प्रतिरोपित सेल अस्तित्व के एक उच्च मौका सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक पिल्ला में इंजेक्शन रहे हैं बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, यह नाटकीय रूप से सफल प्रत्यारोपण की संभावना में सुधार होगा के बाद से कम घनत्व सेल की तैयारी मध्यम के साथ कोशिकाओं के असमान मिश्रण में परिणाम होगा, जो प्रत्यारोपित दिमाग में महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता का उत्पादन होगा15 .
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल एक सेल-स्वायत्त तरीके से सीआई अस्तित्व को विनियमित करने में गतिविधि की भूमिका की जांच के लिए तैयार किया गया था। CNO इंजेक्शन प्रदर्शन के लिए P14-P17 समय खिड़की विशेष रूप से प्रकाशित डेटा के अनुसार चुना गया था, जो बताते हैं कि प्रतिरोपित सीआई संतति 'सेल मौत की चोटी इस अवधि के दौरान होता है16. इसलिए, इस समय सीमा या CNO इंजेक्शन की आवृत्ति अन्य सेल प्रकार या मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए सच नहीं पकड़ सकता है, और अन्वेषक विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रयोजनों के अनुसार इन मापदंडों को समायोजित करना चाहिए. अंत में, CIs के इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन के लिए यहाँ वर्णित पद्धति केवल P0-P5 पिल्ले के लिए संभव है (माउस लाइन पृष्ठभूमि पर भी निर्भर करता है)। सिद्धांत रूप में, P5 पर किसी भी इंजेक्शन thinning या खोपड़ी15को हटाने की आवश्यकता होगी.
इस प्रोटोकॉल के प्रमुख लाभों में से एक वे एक विकासशील नेटवर्क में एकीकृत के रूप में भेदभाव के विभिन्न चरणों के दौरान CIs की गतिविधि कल्पना या हेरफेर करने के लिए नए आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग उपकरण का उपयोग करने की क्षमता है. नई आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग वोल्टेज और कैल्शियम सेंसर की खोज की गति के साथ, साथ ही नए chemogenetic और optogenetic उपकरण, इस प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं उन्हें प्लाज्मिड खजाने में रिलीज के सप्ताह के भीतर उपयोग करने की अनुमति देता है, जैसे Addgene.

न्यूरॉन नेटवर्क के समारोह उत्तेजक प्रक्षेपण न्यूरॉन्स और निरोधात्मक interneurons के एक संतुलित पूरक के अस्तित्व में निर्भर करता है. हालांकि cortical interneurons (सीसी) केवल स्तनधारी cortices में सभी न्यूरॉन्स के 20% का प्रतिनिधित्व करते हैं, उनकी संख्या या समारोह में घाटे neurodevelopmental विकारों के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए सोचा जाता है1,2. सीआई विकास का अध्ययन चुनौतीपूर्ण है क्योंकि सीआई क्षणिक भ्रूण संरचनाओं कि उपयोग करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं में उत्पन्न कर रहे हैं, और वे एक लंबे स्पर्शरेखीय प्रवास का पालन करने से पहले वे pallium तक पहुँचने और उनके परिपक्व शारीरिक और शारीरिक विकास गुण3| दोनों आनुवंशिक और पर्यावरण तंत्र ज्ञात हैं कि सीआई विकास4को विनियमित, लेकिन यह कई कारकों के रिश्तेदार योगदान का अध्ययन करने के लिए मुश्किल साबित हो गया है.
सीआई विकास में कई अंतर्दृष्टि प्राप्त की गई थी , जो गंडकीय एमिनेंस5,6से संतानों के अलगाव के बाद इन विट्रो कल्चर सिस्टम का उपयोग करके प्राप्त की गई थीं . इन तरीकों के महान लाभ में से एक लेबल और आनुवंशिक रूप से अलग संतानों को संशोधित करने और विस्तार से उनके भेदभाव का पालन करने की क्षमता है, सेल-स्वायत्त परिवर्तन का पता लगाने के लिए. हालांकि, इन तरीकों interneurons और एक सक्रिय नेटवर्क के विकास के बीच बातचीत के बारे में जानकारी की पेशकश करने में असमर्थ हैं. हम इन प्रोटोकॉल अनुकूलित किया है, जल्दी प्रसव के बाद प्रांतस्था में संशोधित अग्रदूतों के प्रत्यारोपण द्वारा. भ्रूणीय गुच्छिका eminences से अलग Interneuron संतति जीवित रहने के लिए, फैलाने और प्रांतस्था7में प्रत्यारोपण पर मेजबान नेटवर्क में एकीकृत करने में सक्षम हैं,8. इस विधि का उपयोग आनुवंशिक माउस मॉडलों में मिरगी के दौरे की गंभीरता को कम करने के लिए किया गया है और विभिन्न न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों9,10के लिए एक संभावित नई चिकित्सा के रूप में प्रस्तावित किया गया है . पिछले प्रोटोकॉल में प्रत्यारोपण11से पहले वायरल सदिशों के साथ इन अग्रदूतों को ट्रांसड्यूस करने की प्रक्रिया का वर्णन किया गया है. प्रोटोकॉल हम यहाँ का वर्णन भी interneurons के आनुवंशिक संशोधन की अनुमति देता है, लेकिन एक वायरल वेक्टर के निर्माण की आवश्यकता नहीं है, केवल प्लाज्मिड डीएनए की आवश्यकता होती है, जो बहुत इसके लचीलेपन बढ़ जाती है. कुछ अध्ययनों से आनुवंशिक रूप से काडडल गुच्छिका eminences में interneuron संतति को संशोधित करने के लिए utero electroporation में उपयोग करने में सफलता की सूचना दी (CGE)12, लेकिन इस विधि को पुन: पेश करने के लिए बहुत मुश्किल साबित हो गया है.
प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में, हम डिजाइनर रिसेप्टर्स विशेष रूप से डिजाइनर दवाओं द्वारा सक्रिय व्यक्त करने के लिए इस विधि के उपयोग को वर्णन (DREADDs13) प्रतिरोपित CIs में, एक विधि हम हाल ही में एक प्रकाशन14में इस्तेमाल किया. हम HM3D (जीक्यू), मानव कोलीनर्जिक रिसेप्टर CHRM3 पर आधारित एक इंजीनियर रिसेप्टर व्यक्त किया, जो न्यूरॉन समारोह को प्रभावित नहीं करता है जब तक कि यह अपने विशिष्ट लिगन्ड clozapine-एन-ऑक्साइड (CNO) बांधता है. CNO प्रशासन चुनिंदा hM3D (GQ) कोशिकाओं को व्यक्त करने के सक्रियण से चलाता है. हमने इस विधि का उपयोग यह दिखाने के लिए किया कि सेल स्वायत्त और क्षणिक विध्रुवण विकास14के दौरान CIs के apoptosis को रोकने के लिए पर्याप्त है . विभिन्न आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग उपकरणों के साथ संयुक्त, इस प्रोटोकॉल अप करने की क्षमता है या नीचे जीन अभिव्यक्ति को विनियमित, और कल्पना या interneuron भेदभाव के विभिन्न चरणों के दौरान सेल गतिविधि में हेरफेर.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:953px;" width="952">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Medium/Supplements</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:351px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">B-27</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td style="width:351px;">175040-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">DMEM/F12&#160;</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td style="width:351px;">21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">DNAse</td>
			<td style="width:195px;">SIGMA</td>
			<td style="width:351px;">DN15-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">FBS</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td style="width:351px;">10270-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">100x Glutamine</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td style="width:351px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">L15</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td style="width:351px;">11415-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">MEM alpha, GlutaMAX</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td style="width:351px;">32561-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td style="width:351px;">21103-049</td>
			<td>Neuron basic medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">100x P/S</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td style="width:351px;">15140-122</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Equipment</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:351px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Electroporator</td>
			<td style="width:195px;">BTX</td>
			<td style="width:351px;">ECM 830 generator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Injector for acute slice electroporation&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:351px;">FemtoJet Microinjector</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Injector for cell transplantation (I)</td>
			<td style="width:195px;">Visual Sonics</td>
			<td style="width:351px;">Vevo Injector System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Injector for cell transplantation (II)</td>
			<td style="width:195px;">WPI</td>
			<td style="width:351px;">NANOLITER2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Magnetic Stand</td>
			<td style="width:195px;">WPI</td>
			<td style="width:351px;">M10L Magnetic Stand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Kite Manual Micromanipulator</td>
			<td style="width:195px;">WPI</td>
			<td style="width:351px;">KITE-M3-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Platinum Elecrode (I)</td>
			<td style="width:195px;">Protech International Inc.</td>
			<td style="width:351px;">CUY-700-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Platinum Elecrode (II)</td>
			<td style="width:195px;">Protech International Inc.</td>
			<td style="width:351px;">CUY-700-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Steel Base Plate</td>
			<td style="width:195px;">WPI</td>
			<td style="width:351px;">5479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Vibratome</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:351px;">VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Other Material</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:351px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass capillaries for electroporation</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass capillaries for cell transplantation</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>provided by&#160; Visual Sonics</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclepore 8 &#181;m whatman membrane</td>
			<td>SLS</td>
			<td>110414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Organ tissue culture dishes</td>
			<td>BD Biosciences (Falcon)</td>
			<td>353037</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transplantation of chemogenetically engineered cortical interneuron progenitors into early postnatal mouse brains

तंत्रिका विकास पर्यावरण और आनुवंशिक कारकों का एक जटिल संयोजन द्वारा विनियमित है. प्रत्येक घटक के सापेक्ष योगदान का आकलन एक जटिल कार्य है, जो विशेष रूप से मुश्किल है के विकास के संबंध में है $-aminobutyric एसिड (GABA) ergic cortical interneurons (CIs). CIs सेरेब्रल प्रांतस्था में मुख्य निरोधात्मक न्यूरॉन्स हैं, और वे न्यूरॉन नेटवर्क में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, व्यक्तिगत पिरामिड न्यूरॉन्स की दोनों गतिविधि को विनियमित करके, साथ ही न्यूरॉन पहनावा के दोलनात्मक व्यवहार. वे क्षणिक भ्रूण संरचनाओं में उत्पन्न कर रहे हैं (मध्य और पुच्छ गुच्छिक eminences - MGE और CGE) कि बहुत मुश्किल कुशलता से utero electroporation दृष्टिकोण में उपयोग कर लक्ष्य कर रहे हैं. Interneuron संतति सामान्य भ्रूण विकास के दौरान लंबी दूरी की दूरी विस्थापित, इससे पहले कि वे cortical सर्किट में एकीकृत. यह उल्लेखनीय करने के लिए फैलाने और एक विकासशील नेटवर्क में एकीकृत करने की क्षमता भ्रूण interneuron अग्रदूतों जल्दी प्रसव के बाद मेजबान cortices में प्रत्यारोपण द्वारा अपहरण कर लिया जा सकता है. यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि भ्रूण interneuron संतति के आनुवंशिक संशोधन फोकल पूर्व vivo electroporation का उपयोग कर की अनुमति देता है प्रस्तुत करते हैं. ये इंजीनियर interneuron अग्रदूतों तो जल्दी प्रसव के बाद मेजबान cortices में प्रत्यारोपित कर रहे हैं, जहां वे आसानी से पहचाने जाने योग्य CIs में परिपक्व हो जाएगा. इस प्रोटोकॉल कई आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग उपकरण के उपयोग की अनुमति देता है, या interneuron संतति में विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति को विनियमित करने की क्षमता, क्रम में परिपक्वता पर या तो आनुवंशिक या पर्यावरणचर के प्रभाव की जांच करने के लिए और CIs का एकीकरण.

यहाँ प्रस्तुत प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, हम परीक्षण किया है कि क्या प्रारंभिक प्रसव के बाद चरणों के दौरान cortical interneurons के अस्तित्व एक सेल स्वायत्त तरीके से गतिविधि द्वारा विनियमित है. हम 3 मस्तिष्क टुकड़ा electroporation प्रयोगों प्रदर्शन किया (12-16 भ्रूण [E14.5 भ्रूण] प्रति प्रयोग) pCAGGs-IRES-GFP (नियंत्रण) और pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP अभिव्यक्ति वेक्टर, प्रत्येक निर्माण के लिए एक एकाग्रता पर 1g/ हमारे इलेक्ट्रोपोट्रेशन प्रयोगों में, केवल एक अंश (लगभग 50%; चित्र 3) GFP+ न्यूरॉन्स सह expressed hM3D (जीक्यू) (RFP+) और इसलिए GFP+आरएफपी- जनसंख्या DREADD ligands के प्रभाव के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में सेवा की. पारंक्रमित वल्कुट भ्रूणीय अंतर-न्यूरॉन्स यंत्रवत् अलग हो गए थे और परिणामस्वरूप कोशिका निलंबन (8 x 105 कोशिकाओं/ हम मस्तिष्क प्रति 6 इंजेक्शन प्रदर्शन किया था. प्रत्येक प्रयोग में, कम से कम 6 नवजात पिल्ले इंजेक्ट किए गए थे। CNO के प्रशासन चुनिंदा transfected आरएफपी+ कोशिकाओं की गतिविधि में वृद्धि हुई, के रूप में गतिविधि पर निर्भर प्रोटीन cFos की अभिव्यक्ति द्वारा प्रदर्शन (चित्र 4). CNO उपचार वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार (प्रशासन दो बार दैनिक P14-P17) GFP के अनुपात में वृद्धि हुई+आरएफपी+ GFP के सापेक्ष+आरएफपी- कोशिकाओं, वाहन की तुलना में (0.5% dmSO नमकीन में) प्रशासित कूड़े -- (चित्र 5)।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59568/59568fig1.jpg"> चित्र 1: प्रतिनिधि टेलीनेसेफेलिक स्लाइस तीव्र विद्युत-संकरण प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है। (ए-सी) टेलीनसेफेलिक स्लाइस तीन अलग-अलग अनुक्रमिक रोस्ट्रो-कॉडल स्तर पर प्राप्त किए गए, जो 4$,6-डायमिडिनो-2-फेनिलिनोल (डीएपीआई) के साथ दागित हैं। एलजीई: पार्श्व गुच्छिका eminence; MGE: मध्य गुच्छिका eminence; CGE: पुच्छ गुच्छिका eminence. स्केल बार्स $ 200 डिग्री मी. पीला तारांकन प्रत्येक स्लाइस में इलेक्ट्रोपोरेशन साइट को इंगित करता है। सफेद रेखा गुच्छिका के किनारे को चिह्नित करता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59568/59568fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59568/59568fig2.jpg"> चित्र 2: प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. (ए) माउस मस्तिष्क स्लाइस उपयुक्त constructs के साथ electroporated हैं, और (बी) 12 ज संशोधित cortical interneuron के बाद (सीआई) अग्रदूतों अलग कर रहे हैं और (सी) नवजात माउस पिल्ले के पैलियम में प्रतिरोपित (P0 $P2 ). अपरिपक्व CIs की गतिविधि को संशोधित करने के लिए, P14 पिल्ले कि सेल प्रत्यारोपण प्राप्त किया था प्रस्तुत प्रोटोकॉल के अनुसार चार गठन दिनों के लिए CNO या वाहन के साथ इंजेक्शन थे. (ए') तीव्र माउस मस्तिष्क टुकड़ा इलेक्ट्रोपोरेशन सेट-अप की तस्वीर। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59568/59568fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59568/59568fig3.jpg"> चित्र 3: प्रतिनिधि सफल तीव्र टुकड़ा विद्युत पोचेशन प्रयोग. (ए) एक E14.5 भ्रूण मस्तिष्क से प्रतिनिधि कोरोनल अनुभाग दोनों pCAGGs-IRES-GFP (GFP) और pCAGGs-hM3D (GQ) -IRES-RFP (RFP) प्लाज्मिड और 12 एच के लिए सुसंस्कृत के साथ CGE में transfected. अनुभाग GFP (ए, बी, सी) और आरएफपी (ए, बी, डी) के लिए प्रतिरक्षा किया गया है। पैनल ए में बॉक्स्ड क्षेत्र को फ्लोरोसेंट पत्रकारों (बी), जीएफपी (सी) और आरएफपी केवल ( डी ) दोनों की अभिव्यक्ति दिखाने के लिए बढ़ाया गयाहै. सफेद रेखा गुच्छिका के किनारे को चिह्नित करता है। बी-डी: एक ही तस्वीर, विभिन्न चैनलों या दो अलग अलग चैनलों के संयोजन। स्केल बार्स ] 200 डिग्री मी (ए), 100 डिग्री मीटर (बी-डी)। यह आंकड़ा Denaxa एट अल14से संशोधित किया गया है. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59568/59568fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59568/59568fig4.jpg"> चित्र 4: सेल स्वायत्त वृद्धि M3D (GQ) की गतिविधि में वृद्धि-Expressing CNO प्रशासन पर प्रतिरोपित CIs. (ए-डी) एक P17 माउस के एक कोरोनल अनुभाग के प्रतिनिधि confocal छवियों CI अग्रदूतों दोनों pCAGGs-IRES-GFP (GFP) और pCAGGs-hM3D (जीक्यू)-IRES-RFP (RFP) प्लाज्मिड के साथ transfected और CNO के साथ इलाज के साथ transfected. इस खंड को जीएफपी (ए), आरएफपी (बी) और सीएफओ ( सी ) के लिए प्रतिरक्षण किया गयाहै. (घ) ए, बी और सी इम्यूनोफ्लोरेसेंस (कंबो) की संयुक्त छवि। ध्यान दें कि केवल CIs सह दोनों प्लाज्मिड (ए-डी में सफेद तीर) भी cFos+ केवल नियंत्रण GFP प्लाज्मिड व्यक्त करने के लिए की तुलना में cFos हैं (पीले तीर ए-डी में). (ई) सीएफओका का परिमाणीकरण+आरएफपी+ पी 17 चूहों के पैलियम में पाई जाने वाली कोशिकाओं को पी 1 (कुल आरएफपी+ जनसंख्या के लिए सामान्यीकृत) में प्रत्यारोपित किया गया और वाहन या सीएनओ (एन जेड 2) के साथ इलाज किया गया। A-D: एक ही फ़ोटो, विभिन्न चैनल या तीन अलग-अलग चैनलों का संयोजन. स्केल बार्स ] 50 $m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59568/59568fig4large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59568/59568fig5.jpg"> चित्र 5: सीआईए की गतिविधि में सेल स्वायत्त वृद्धि अस्तित्व को बढ़ाता है . (ए-डी) P17 चूहों के somatosensory प्रांतस्था कोरोनल स्लाइस के प्रतिनिधि confocal छवियों सीआई अग्रदूतों के साथ P0-P2 में प्रत्यारोपित दोनों pCAGGs-IRES-GFP (GFP) और pCAGGs-hM3D (जीक्यू)-IRES-RFP (RFP) plasmids और वाहन के साथ इलाज किया(ए-बी)या वाहन के साथ इलाज किया (सी-डी)। (ई) पी0-पी2 (कुल जीएफपी+ जनसंख्या के लिए सामान्यीकृत) पी0पी2 में प्रतिरोपित पी017 चूहों के फोरब्रेन में पाई जाने वाली आरएफपी+ कोशिकाओं का परिमाणीकरण। RFP+(वाहन) - 47% - 3%, CNO - 61% $ 3%, p $ 0.01, छात्र के युग्मित नमूना टी परीक्षण, n - 3 वाहन और 3 CNO, मस्तिष्क के अनुसार गिना 150 कोशिकाओं की एक न्यूनतम. ए और बी: एक ही तस्वीर, विभिन्न चैनलों. सी और डी: एक ही तस्वीर, विभिन्न चैनलों. स्केल बार $ 50 डिग्री मी. यह आंकड़ा Denaxa एट अल14से संशोधित किया गया है. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59568/59568fig5large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59568/59568table1.jpg"> तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए मीडिया से संबंधित अतिरिक्त जानकारी.

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Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

यहाँ हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत, cortical interneuron संतति की गतिविधि में हेरफेर करने के लिए chemogenetic उपकरण का उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया जल्दी प्रसव के बाद चूहों के प्रांतस्था में प्रत्यारोपित.

प्रारंभिक प्रसवोत्तर माउस दिमाग में रसायनजन्य रूप से इंजीनियर कॉर्टिकल इंटरन्यूरॉन संततिकाका का प्रत्यारोपण

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

इस विधि के साथ, हम कॉर्टिकल इंटरन्यूरॉन अग्रदूतों की परिपक्वता पर आंतरिक गतिविधि के प्रभावों का अध्ययन कर सकते हैं। यह तकनीक कॉर्टिकल इंटरन्यूरॉन जनकों के सेलुलर गुणों को लक्षित करने और हेरफेर करने के लिए एक कुशल तरीका प्रदान करती है जो अधिकांश वैज्ञानिक समुदाय के लिए सुलभ है। इस प्रोटोकॉल में नमूनों और उपकरणों की सावधानीपूर्वक हैंडलिंग शामिल है, और दृश्य प्रदर्शन द्वारा इसकी सबसे अच्छी सराहना की जा सकती है।वाटरप्रूफ पेन का उपयोग करके, छह 35 मिलीमीटर पेट्री व्यंजनों की निचली सतह के निचले हिस्से के बीच में एक सीधी रेखा बनाएं। 35 मिलीमीटर पेट्री व्यंजनों में से दो में पीबीएस में तरल 4% कम गेलिंग एग्राज में 10 मिलीलीटर जोड़ें और सीधी रेखा के पार प्रति डिश के नीचे का सामना कर रहे घ्राण बल्बों के साथ एग्राम में तीन से चार विच्छेदित दिमाग एम्बेड करें, जिससे प्रत्येक नमूने के बीच तीन से पांच मिलीमीटर जगह जा सके। जब दिमाग के सभी एंबेडेड किया गया है, चार डिग्री सेल्सियस पर व्यंजन जगह के लिए agarose के एक ब्लॉक में जमना और तीन दिमाग उत्कीर्ण करने की अनुमति है, नमूनों के किनारों के आसपास जेल के लगभग तीन मिलीमीटर छोड़ ।एक माइक्रोटॉम बेस की सतह पर ब्लॉक गोंद और तीन स्वतंत्र ब्लॉक प्राप्त करने के लिए प्रत्येक ऊतक नमूने के बीच ब्लॉक के नीचे के माध्यम से सभी तरह से कटौती करने के लिए एक शल्य ब्लेड का उपयोग करें । इसके बाद, आइस कोल्ड क्रेब्स समाधान में ब्लॉक को 250-माइक्रोमीटर मोटी स्लाइस में अनुभाग करने के लिए एक कंपन ब्लेड माइक्रोटॉम का उपयोग करें, एक तुला फ्लैट माइक्रोस्पाटुला का उपयोग करके केवल मध्य या कौडल गैंगलियोनिक एमिनेंस युक्त स्लाइस एकत्र करने के लिए। फिर, प्रत्येक खंड को व्यक्तिगत 13-माइक्रोमीटर व्यास पर रखें, आठ माइक्रोमीटर पोर आकार फिल्टर झिल्ली व्यक्तिगत पॉलीस्टीरिन केंद्र में न्यूनतम आवश्यक माध्यम पर तैरते हुए अच्छी तरह से अंग संस्कृति व्यंजन।जब सभी खंडों को प्राप्त कर लिया गया है, तो व्यंजनों को एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कार्बन डाइऑक्साइड ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में रखें। फोकल डीएनए इंजेक्शन से पहले, बर्फ ठंडे क्रेब्स समाधान में एक मिलीमीटर व्यास, 10 मिलीमीटर लंबी एगरजिंग कॉलम को ग्लास 225 मिलीमीटर लंबे, दो मिलीलीटर क्षमता ग्लास पिपेट के साथ मुक्का मारा। एक शल्य ब्लेड का उपयोग करना, agarose के एक छोटे टुकड़े को काटने के लिए इलेक्ट्रोपाउरेशन इलेक्ट्रोड की सतह पर फिट और एक बड़ा टुकड़ा फोकल डीएनए इंजेक्शन के लिए एक आधार के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा ।फिर, एगर उठे ब्लॉक को बर्फ के ठंडे क्रेब्स समाधान में रखें। इंजेक्शन के लिए, प्रत्येक वेक्टर के लिए एक माइक्रोग्राम प्रति माइक्रोलीटर एकाग्रता पर अभिव्यक्ति और नियंत्रण वेक्टर डीएनए मिलाएं और एक से 10 वें कमजोर पड़ने पर तेजी से हरे रंग का स्टॉक समाधान जोड़ें। डीएनए मिश्रण के 10 माइक्रोलीटर के साथ एक खींचा ०.५ मिलीमीटर आंतरिक व्यास, एक मिलीलीटर बाहरी व्यास ग्लास माइक्रोपिपेट भरें और माइक्रोपिपेट को वायवीय पिकोपंप इंजेक्टर में लोड करें ।एग्रास के बड़े ब्लॉक को स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और स्लाइस को एगरेड के टुकड़े पर इंजेक्ट करने के लिए रखें। फिर, स्लाइस के चयनित मध्यीय गैंगलियोनिक या कौडल गैंगलियोनिक एमिनेंस क्षेत्र में 25 से 50-नैनोलिटर वॉल्यूम इंजेक्ट करें। इंजेक्शन के तुरंत बाद, पेट्री डिश इलेक्ट्रोड पर छोटे एग्राजैंड ब्लॉक रखें और मोबाइल कवर इलेक्ट्रोड में एगर उठे कॉलम को संलग्न करने के लिए एक फ्लैट एंडेड माइक्रोस्पाटुला का उपयोग करें।एग्र उठे ब्लॉक पर अपनी सहायक झिल्ली के साथ इंजेक्शन स्लाइस स्थानांतरित करें और स्लाइस के चयनित क्षेत्र के शीर्ष पर एगर उठे कॉलम के साथ शीर्ष इलेक्ट्रोड रखें। फिर, 125 वोल्ट, 500 मिलीसेकंड के अलावा दो पांच मिलीसेकंड दालों के साथ क्षेत्र को इलेक्ट्रोपोरेट करें। इलेक्ट्रोपाउशन के बाद, स्लाइस को अपने सहायक झिल्ली के साथ वापस अपने होल्डिंग डिश में रखें और डिश को टिश्यू कल्चर इनक्यूबेटर में वापस करें।एक घंटे के बाद, न्यूनतम आवश्यक माध्यम को प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृतियों के लिए उपयुक्त बुनियादी माध्यम से बदलें और रातोंरात इनक्यूबेटर में स्लाइस वापस करें। इन इलेक्ट्रोपाउशन प्रयोगों में, जीएफपी पॉजिटिव न्यूरॉन्स के लगभग 50% ने आरएफपी सकारात्मक इंजेक्शन प्रोटीन को सह-व्यक्त किया और इसलिए, जीएफपी सकारात्मक आरएफपी नकारात्मक आबादी इंजेक्शन डीएनए लिगामेंट्स के प्रभाव के लिए आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्य करती है। क्लोज़पाइन और ऑक्साइड प्रशासन इन नवजात कोरोनल ऊतक वर्गों में गतिविधि-निर्भर प्रोटीन, सी-फोस की अभिव्यक्ति द्वारा प्रदर्शित संक्रमित आरएफपी सकारात्मक कोशिकाओं की गतिविधि को चुनिंदा रूप से बढ़ाता है।क्लोज़पाइन और ऑक्साइड उपचार के परिणामस्वरूप वाहन प्रशासित लिटरमेट्स की तुलना में जीएफपी-पॉजिटिव आरएफपी-नकारात्मक कोशिकाओं की संख्या के सापेक्ष जीएफपी-पॉजिटिव आरएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं के अनुपात में भी वृद्धि होती है। इस प्रक्रिया का उपयोग मेजबान की संचार प्लास्टिसिटी और मस्तिष्क समारोह पर गतिविधि-संग्राहक ग्राफ्टेड इंटरन्यूरॉन के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection और भ्रूण माउस hippocampal और cortical न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृति

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

प्रसवोत्तर माउस मस्तिष्क के विकास में जीन फंक्शन के वायरस आधारित Cre पुनर्संयोजन का उपयोग करके मोज़ेक विश्लेषण

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Neurotropic माउस हेपेटाइटिस वायरस से संक्रमित चूहों की रीढ़ की हड्डी डोरियों में माउस तंत्रिका स्टेम सेल के प्रत्यारोपण शल्य चिकित्सा

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

अलगाव और माउस Cortical Astrocytes की संस्कृति

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

पूर्व utero electroporation और पूरे गोलार्ध explants: प्रारंभिक Cortical विकास के अध्ययन के लिए एक सरल प्रयोगात्मक विधि

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Confocal लाइट शीट माइक्रोस्कोपी के साथ पूरे माउस दिमाग की माइक्रोन पैमाने संकल्प ऑप्टिकल टोमोग्राफी

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

मॉडलिंग तारिकाकोशिकार्बुद रोगजनन<em&gt; इन विट्रो</em&gt; और<em&gt; इन विवो</em&gt; Cortical Astrocytes या सशर्त, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का उपयोग

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

Cortical न्यूरॉन पुरोगामी में माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का भेदभाव

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

नवजात माउस दिमाग के Striatal कोशिकाओं में आनुवंशिक हेरफेर के लिए Stereotaxic सर्जरी

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

जल्दी जन्मोत्तर माउस दिमाग में न्यूरॉन अग्रदूतों के Homochronic ट्रांसप्लांटेशन

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...