Name: transplantation of chemogenetically engineered cortical interneuron progenitors into early postnatal mouse brains
Uploaded: 2019-08-26T13:00:00
Duration: 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains at JoVE.com

Эта работа была поддержана ERC Starter Грант (282047), Wellcome Trust Investigator Award (095589 / q/11 /) грант FP7 EC DESIRE, и Листер институт премии JB. Работа в лаборатории В.П. поддерживается BBSRC (BB/L022974/1), Британским советом медицинских исследований (MRC) и Институтом Фрэнсиса Крика (который получает финансирование от MRC, Cancer Research UK и Wellcome Trust). Исследование в лаборатории m.D. стало по возможности через дар от учредительства Stavros Niarchos к B.S.R.C. Александр Fleming, как часть инициативы учредительства для того чтобы поддержать греческие исследования.

<ol>
	<li>Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneuron+dysfunction+in+psychiatric+disorders.">Interneuron dysfunction in psychiatric disorders.</a> Nature Review Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).</li><li>Glausier, J. R., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+and+schizophrenia:+Where+we+stand+and+where+we+need+to+go.">GABA and schizophrenia: Where we stand and where we need to go.</a> Schizophrenia Research. 181, 2-3 (2017).</li><li>Fishell, G., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+inhibition+within+the+telencephalon:+"where+the+wild+things+are".">Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are".</a> Annual Review Neuroscience. 34, 535-567 (2011).</li><li>Wamsley, B., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+activity-dependent+mechanisms+underlying+interneuron+diversity.">Genetic and activity-dependent mechanisms underlying interneuron diversity.</a> Nature Review Neuroscience. 18 (5), 299-309 (2017).</li><li>Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+cortical+interneuron+subtypes.">Origins of cortical interneuron subtypes.</a> Journal of Neuroscience. 24 (11), 2612-2622 (2004).</li><li>Denaxa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation-promoting+activity+of+SATB1+in+MGE-derived+cortical+interneurons.">Maturation-promoting activity of SATB1 in MGE-derived cortical interneurons.</a> Cell Reports. 2 (5), 1351-1362 (2012).</li><li>Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+neurons+from+medial+ganglionic+eminence+disperse+in+adult+and+embryonic+brain.">Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain.</a> Nature Neuroscience. 2 (5), 461-466 (1999).</li><li>Alvarez-Dolado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+inhibition+modified+by+embryonic+neural+precursors+grafted+into+the+postnatal+brain.">Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain.</a> Journal of Neuroscience. 26 (28), 7380-7389 (2006).</li><li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+seizures+by+transplantation+of+cortical+GABAergic+interneuron+precursors+into+Kv1.1+mutant+mice.">Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice.</a> Proccedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15472-15477 (2009).</li><li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneurons+from+embryonic+development+to+cell-based+therapy.">Interneurons from embryonic development to cell-based therapy.</a> Science. 344 (6180), 1240622 (2014).</li><li>Vogt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral-mediated+Labeling+and+Transplantation+of+Medial+Ganglionic+Eminence+(MGE)+Cells+for+In+Vivo+Studies.">Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52740 (2015).</li><li>De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+is+required+for+the+development+of+specific+cortical+interneuron+subtypes.">Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes.</a> Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).</li><li>Urban, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+(designer+receptors+exclusively+activated+by+designer+drugs):+chemogenetic+tools+with+therapeutic+utility.">DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).</li><li>Denaxa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Apoptosis+Controls+Inhibitory+Interneuron+Number+in+the+Cortex.">Modulation of Apoptosis Controls Inhibitory Interneuron Number in the Cortex.</a> Cell Reports. 22 (7), 1710-1721 (2018).</li><li>Quatrocolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homochronic+Transplatation+of+Interneuron+Precursors+into+Early+Postnatal+Mouse+Brains.">Homochronic Transplatation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57723 (2018).</li><li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+determined+cell+death+of+developning+cortical+interneurons.">Intrinsically determined cell death of developning cortical interneurons.</a> Nature. 491 (7422), 103-113 (2012).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Здесь мы описываем широко доступную методологию для генетический модификации активности прекурсоров КИ для изучения влияния внутренней активности на созревание КИ и/или влияния активности, модулированной CIs на сборку/функцию интегрированной корковой Цепи.
В прошлом, несколько лабораторий, в том числе наша, выполнили в утробе электропорации эксперименты для того, чтобы генетически модифицировать проекционные нейроны6. Тем не менее, в утробе электропорации в ганглияиных выдохов, которые включают CI прародителей очень трудно, из-за проблем электрической проводимости пути. Для того, чтобы решить эту проблему, небольшое количество лабораторий выполняют ультразвуковые управляемые инъекции с последующим электропорированием, что является требовательной техникой, требующей дорогостоящего оборудования. Этот протокол является альтернативой этим методологиям, которая доступна для большинства научных кругов.
Одним из наиболее сложных аспектов этого протокола является максимизация количества клеток, которые выживают в коре хозяина до зрелых стадий, когда фенотипический анализ обычно выполняется (очень зависит от дизайна эксперимента, но обычно старше P17). Есть три ключевых шага, на которые следователь должен обратить внимание: (1) Эффективность электропорации. Это может быть максимально путем обеспечения чистоты плазмидов ДНК. Для этой процедуры следует использовать только высококачественные плазмиды ДНК (коэффициент A260/A280 1,9-2.0). Мы получаем такие высококачественные препараты ДНК, используя очистку ДНК хлорида цезия. Другим важным фактором является промоутер, который управляет выражением гена интереса. Мы обнаружили, что вектор pCAGGs, который состоит из куриного b-актина промотор, является чрезвычайно мощным и может значительно увеличить эффективность электропорации. (2) Количество стартовых эмбрионов донора. Важно убедиться, что большое количество (12-16) эмбрионов той же стадии электропоративаются. Это число может быть увеличено, если больше экспериментаторов выполняют вскрытие эмбрионов и секции вместе, так как важно, чтобы эмбриональные корковые ломтики получены, электропоразаить и передать в инкубатор как можно скорее. (3) Важно, чтобы убедиться, что большое количество клеток вводят в каждого щенка, чтобы обеспечить высокий шанс пересаженной клетки выживания до зрелых стадий. Кроме того, это значительно повысит вероятность успешной трансплантации, так как препараты клеток низкой плотности приведут к неравномерному смешиванию клеток со средой, что приведет к значительной изменчивости пересаженных мозгов15 .
Описанный здесь протокол был разработан для изучения роли деятельности в регулировании выживания КИ в автономном порядке. P14-P17 время окна для выполнения инъекций CNO был специально выбран в соответствии с опубликованными данными, которые показывают, что пик трансплантации CI смерти клеток происходит в течение этого периода16. Таким образом, этот срок или частота инъекций CNO не может иметь право на другие типы клеток или области мозга, и исследователь должен настроить эти параметры в соответствии с конкретными экспериментальными целями. Наконец, методология, описанная здесь для внутричерепных инъекций CIs, осуществима только для p0-P5 pups (в зависимости также от фона линии мыши). В принципе, любые инъекции более P5 потребует истончения или удаления черепа15.
Одним из ключевых преимуществ этого протокола является возможность использования новых генетически закодированных инструментов для визуализации или манипулирования активностью CIs на различных стадиях дифференциации по мере их интеграции в развивающуюся сеть. С темпами открытия новых генетически закодированных датчиков напряжения и кальция, а также новых хемогенетических и оптогенетических инструментов, этот протокол позволяет исследователям использовать их в течение нескольких недель после выпуска в плазмидных репозиториях, таких как Addgene.

Функция нейронных сетей зависит от наличия сбалансированного дополнения возбуждающих проекционных нейронов и ингибирующих интернейронов. Хотя корковые интернейроны (CIs) составляют только 20% всех нейронов в кортики млекопитающих, дефицит их числа или функции, как полагают, играют ключевую роль в патогенеза нейроразвития расстройств1,2. Изучение развития CI является сложной задачей, поскольку CIs генерируются в переходных эмбриональных структурах, которые труднодоступны, и они следуют за длительной тангенциальной миграцией, прежде чем они достигнут паллия и развивают свои зрелые анатомические и физиологические свойства3. Как генетические, так и экологические механизмы известны, которые регулируют развитие CI4, но оказалось трудно изучить относительный вклад нескольких факторов.
Много идей в развитии CI были получены с помощью систем культуры in vitro после изоляции прародителей от ганглионных вывесок5,6. Одним из больших преимуществ этих методов является возможность маркировать и генетически модифицировать изолированных прародителей и детально следить за их дифференциацией, чтобы обнаружить изменения, автономные клетки. Однако эти методы не могут предоставить информацию о взаимодействии между развивающимися интернейронами и активной сетью. Мы адаптировали эти протоколы, путем трансплантации модифицированных прекурсоров в раннюю послеродовую кору. Интернероновые прародители, изолированные от эмбриональных ганглионных возвышенностей, способны выжить, разогнаться и интегрироваться в сеть хозяина при трансплантации в кору7,8. Этот метод был использован для уменьшения тяжести эпилептических припадков в генетических моделях мыши, и был предложен в качестве возможной новой терапии для различных нейроразвития расстройств9,10. Предыдущий протокол описывает процедуру, чтобы преобразовать эти прекурсоры с вирусными переносчиками до трансплантации11. Протокол, который мы описываем здесь, также допускает генетическую модификацию интернейронов, но не требует создания вирусного вектора, требующего только плазмидной ДНК, что значительно повышает ее гибкость. Некоторые исследования сообщили об успехе в использовании в утробе электропорации генетически модифицировать интернерон прародителей в caudal ганглионных вывешнов (CGE)12, но этот метод оказался очень трудно размножаться.
В разделе репрезентативных результатов, мы иллюстрируем использование этого метода, чтобы выразить дизайнер рецепторов исключительно активируется дизайнер наркотиков (DREADDs13) в пересаженных CIs, метод, который мы использовали в недавней публикации14. Мы выразили hM3D (Gq), инженерии рецептора на основе человеческого холинергического рецептора CHRM3, который не влияет на функцию нейронов, если он связывает его конкретные лиганд ызапин-N-оксид (CNO). Администрация CNO выборочно запускает активацию hM3D (Gq), выражающих клетки. Мы использовали этот метод, чтобы показать, что точечная автономная и преходящая деполяризация достаточна для предотвращения апоптоза CIs во время разработки14. В сочетании с различными генетически закодированными инструментами, этот протокол имеет потенциал для вверх или вниз-регулировать экспрессию генов, и визуализировать или манипулировать активностью клеток на различных стадиях дифференциации интернеров.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:953px;" width="952">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Medium/Supplements</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:351px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">B-27</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td style="width:351px;">175040-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">DMEM/F12&#160;</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td style="width:351px;">21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">DNAse</td>
			<td style="width:195px;">SIGMA</td>
			<td style="width:351px;">DN15-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">FBS</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td style="width:351px;">10270-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">100x Glutamine</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td style="width:351px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">L15</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td style="width:351px;">11415-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">MEM alpha, GlutaMAX</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td style="width:351px;">32561-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td style="width:351px;">21103-049</td>
			<td>Neuron basic medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">100x P/S</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td style="width:351px;">15140-122</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Equipment</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:351px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Electroporator</td>
			<td style="width:195px;">BTX</td>
			<td style="width:351px;">ECM 830 generator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Injector for acute slice electroporation&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:351px;">FemtoJet Microinjector</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Injector for cell transplantation (I)</td>
			<td style="width:195px;">Visual Sonics</td>
			<td style="width:351px;">Vevo Injector System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Injector for cell transplantation (II)</td>
			<td style="width:195px;">WPI</td>
			<td style="width:351px;">NANOLITER2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Magnetic Stand</td>
			<td style="width:195px;">WPI</td>
			<td style="width:351px;">M10L Magnetic Stand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Kite Manual Micromanipulator</td>
			<td style="width:195px;">WPI</td>
			<td style="width:351px;">KITE-M3-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Platinum Elecrode (I)</td>
			<td style="width:195px;">Protech International Inc.</td>
			<td style="width:351px;">CUY-700-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Platinum Elecrode (II)</td>
			<td style="width:195px;">Protech International Inc.</td>
			<td style="width:351px;">CUY-700-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Steel Base Plate</td>
			<td style="width:195px;">WPI</td>
			<td style="width:351px;">5479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Vibratome</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:351px;">VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:241px;">Other Material</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:351px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass capillaries for electroporation</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass capillaries for cell transplantation</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>provided by&#160; Visual Sonics</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclepore 8 &#181;m whatman membrane</td>
			<td>SLS</td>
			<td>110414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Organ tissue culture dishes</td>
			<td>BD Biosciences (Falcon)</td>
			<td>353037</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transplantation of chemogenetically engineered cortical interneuron progenitors into early postnatal mouse brains

Развитие нейронов регулируется сложным сочетанием экологических и генетических факторов. Оценка относительного вклада каждого компонента является сложной задачей, что особенно трудно в том, что касается развития аманиномасляной кислоты (ГАМК) эргических интернейронов (КИ). CIs являются основными ингибирующими нейронами в коре головного мозга, и они играют ключевую роль в нейронных сетях, регулируя как активность отдельных пирамидальных нейронов, а также колеблющееся поведение нейронных ансамблей. Они генерируются в переходных эмбриональных структурах (медианных и каудальных ганглионных вывешней - MGE и CGE), которые очень трудно эффективно ориентировать с использованием в подходах к электропорации матки. Интернероновые прародители мигрируют на большие расстояния во время нормального эмбрионального развития, прежде чем они интегрируются в корковую цепь. Эта замечательная способность рассеиваться и интегрироваться в развивающуюся сеть может быть захвачена путем пересадки эмбриональных прекурсоров интернеровва в ранние послеродовые кортики хозяина. Здесь мы представляем протокол, который позволяет генетическую модификацию эмбриональных интернеровосных прародителей с помощью фокусной электропорации ex vivo. Эти инженерные предшественники интернеровона затем пересаживаются в ранние послеродовые кортики хозяина, где они созреют в легко идентифицируемые CIs. Этот протокол позволяет использовать несколько генетически закодированных инструментов, или способность регулировать экспрессию конкретных генов у поротелей интернереутона, для того, чтобы исследовать влияние генетических или экологических переменных на созревание и интеграции CIs.

Используя представленную здесь процедуру, мы проверили, регулируется ли выживаемость корковых интернейронов на ранних послеродовых стадиях активностью в клеточной автономной манере. Мы провели 3 эксперименты по электропорации семков мозга (12-16 эмбрионов (E14.5 эмбрионов) за эксперимент) с pCAGGs-IRES-GFP (контроль) и pCAGGs-hM3D (Gq)-IRES-RFP-физторы выражения, при концентрации 1 мкг/мл для каждой конструкции. В наших экспериментах по электропорации, только часть (приблизительно 50%; Рисунок 3) из GFP- нейронов, совместно выраженных hM3D (Gq) (RFP)и, следовательно, GFPиRFP- население служило внутренним контролем за эффектом лигандов DREADD. Трансинфицированные корычные эмбриональные интернейроны были механически разобщены, а полученная клеточная подвеска (8 х 105 клеток/Л) привиталась в коре мышей дикого типа P0-P1. Мы провели 6 инъекций на мозг. В каждом эксперименте вводилось как минимум 6 новорожденных щенков. Администрация CNO выборочно увеличила активность транс-инфицированных клеток RFP, о чем свидетельствует экспрессия зависимого от активности белка cFos (рисунок4). Лечение CNO в соответствии с описанным протоколом (администрирование дважды в день P14-P17) привело к увеличению доли GFPиRFPпо отношению к GFPиRFP- клеткам, по сравнению с транспортным средством (0,5% DMSO в сольном) вводимых littermates(Рисунок 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59568/59568fig1.jpg"> Рисунок 1: Репрезенцефалические ломтики, используемые для острых экспериментов электропорации. (A-C) Теленцефалические ломтики, полученные на трех различных последовательных ростро-каудадальных уровнях, окрашенных 4 ",6-диамидино-2-фенилинол (DAPI). LGE: боковое ганглионическое превосходство; MGE: медиальное ганглионическое превосходство; CGE: каудальный ганглионный выдавчивость. Шкала баров 200 мкм. Желтые звездочки указывают на место электропорации в каждом ломтике. Белая линия знаменует край ганглионного выдавства. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59568/59568fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59568/59568fig2.jpg"> Рисунок 2: Схематическое представление экспериментального рабочего процесса. (A) Мышь мозг ломтики электропорангаются с соответствующими конструкциями, и (B) после 12 ч модифицированных корковых интернеров (CI) прекурсоры изолированы и (C) пересаживаются в паллии новорожденных щенков мыши (P0'P2). Для того, чтобы изменить активность незрелых CIs, P14 щенки, которые получили пересадки клеток были введены с CNO или транспортного средства в течение четырех constitutive дней в соответствии с представленным протоколом. (A') Фотография острой мыши мозга ломтик электропорации настройки. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59568/59568fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59568/59568fig3.jpg"> Рисунок 3: Представитель успешного эксперимента по электропорации острых ломтиков. (A) Представитель коронального раздела из E14.5 эмбриона мозга транссексуалов в КГЭ с обеих pCAGGs-IRES-GFP (GFP) и pCAGGs-hM3D (Gq)-IRES-RFP (RFP) плазмиды и культивируется в течение 12 ч. Раздел был иммунозапятнан для GFP (A, B, C) и RFP (A, B, D). Коробочная область в панели А увеличена, чтобы показать выражение обоихфлуоресцентных репортеров (B), GFP (C) и RFP только (D ). Белая линия знаменует край ганглионного выдавства. B-D: одно и то же фото, разные каналы или сочетание двух различных каналов. Шкала баров 200 мкм (A), 100 мкм (B-D). Эта цифра была изменена от Denaxa и др.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59568/59568fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59568/59568fig4.jpg"> Рисунок 4: Автономное увеличение активности M3D (Gq)-выражение пересаженных CIs на администрации CNO. (A-D) Представитель confocal изображения корональной части мыши P17 пересажены на P1 с прекурсорами CI трансфицируется как pCAGGs-IRES-GFP (GFP) и pCAGGs-hM3D (Gq)-IRES-RFP (RFP) plasmids и лечение CNO. Раздел был иммунозапятнаны для GFP (A), RFP (B), и cFos (C). (D) Комбинированное изображение иммунофлуоресценции A, B и C (комбо). Обратите внимание, что только CIs, выражающие обе плазмиды (белые стрелки в A-D), также являются cFos- по сравнению с CIs, выражающими только плазмид управления GFP (желтые стрелки в A-D). (E) Количественная оценка cFosиRFP- клеток, найденных в паллиуме мышей P17, пересаженных в P1 (нормализованных для общейпопуляции RfP) и обработанных с помощью транспортного средства или CNO (N No 2). A-D: одно и то же фото, различные каналы или комбинация трех различных каналов. Шкала баров 50 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59568/59568fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59568/59568fig5.jpg"> Рисунок 5: Автономное увеличение активности CIs повышает выживаемость . (A-D) Представитель confocal изображения соматосенсорной коры корональных ломтиков P17 мышей пересажены на P0-P2 с прекурсорами CI трансфицируется как pCAGGs-IRES-GFP (GFP) и pCAGGs-hM3D (Gq)-IRES-RFP (RFP) plasmids и лечение с помощью транспортного средства (A-B) (C-D). (E) Количественная оценка RFP- клеток, найденных в предмозгне мышей P17, пересаженных на P0-P2 (нормализованы для общей популяции GFP). RfP(транспортное средство) - 47% - 3%, CNO - 61% - 3%, р- 0,01, Парный образец студента t тест, n - 3 транспортного средства и 3 CNO, минимум 150 клеток, насчитанных на мозг. A и B: одно и то же фото, разные каналы. C и D: одно и то же фото, разные каналы. Шкала баров 50 мкм. Эта цифра была изменена от Denaxa и др.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59568/59568fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59568/59568table1.jpg"> Таблица 1: Дополнительная информация о носителях, используемых в этом протоколе.

Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains at JoVE.com

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Здесь мы представляем протокол, предназначенный для использования хемогенетических инструментов для манипулирования активностью корковых интернереронных прародителей, пересаженных в кору ранних послеродовых мышей.

Трансплантация хемогенетически инженерии Кортикальный интернерерон прародителей в начале послеродовой мозг мыши

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

С помощью этого метода мы можем изучить влияние внутренней активности на созревание корковых интернейроновых прекурсоров. Этот метод обеспечивает эффективный способ таргетинга и манипулирования клеточными свойствами кортикального интернейрона прародителей, который доступен для большинства научного сообщества. Этот протокол включает в себя тщательное обращение с образцами и оборудованием, и его лучше всего оценить с помощью визуальной демонстрации.Используя водонепроницаемую ручку, нарисуйте прямую линию посередине нижней части нижней поверхности из шести 35-миллиметровых чашек Петри. Добавьте 10 миллилитров жидкой 4%низкой гелеобразной агарозы в PBS в две из 35-миллиметровых чашек Петри и встраивайте от трех до четырех расчлененных мозгов в агарозу с обонятельными луковицами, обращенными вниз на тарелку по прямой линии, оставляя от трех до пяти миллиметров пространства между каждым образцом. Когда все мозги были встроены, поместите посуду на четыре градуса по Цельсию, чтобы агароза затвердеть и вырезать три мозга в один блок агарозы, оставляя около трех миллиметров геля по краям образцов.Клей блок на поверхности основания микротомы и использовать хирургическое лезвие, чтобы сократить весь путь через дно блока между каждым образцом ткани, чтобы получить три независимых блоков. Далее, используйте вибрирующий микротом лезвия, чтобы разделить блоки в ледяном растворе Кребса на 250-микрометровые ломтики, используя изогнутые плоские микроспатулы, чтобы собрать только ломтики, содержащие медиальные или хвостовые ганглионные выемки. Затем поместите каждый раздел на отдельные 13-микрометровый диаметр, восемь микрометров пор размер фильтр мембраны плавающей на минимальной необходимой среде в отдельных полистирол центр хорошо орган культуры блюд.Когда все разделы были получены, поместите посуду в инкубатор культуры двуокиси углерода на 37 градусов по Цельсию в течение одного часа. Перед фокусной инъекцией ДНК поместите одномиллиметровый диаметр, 10-миллиметровые агарозные колонны, пробитое стеклом длиной 225 миллиметров, стеклом емкостью два миллилитров в ледяной раствор Кребса. Используя хирургическое лезвие, вырезать один меньший кусок агарозы, чтобы поместиться на поверхности электрода электропорации и один большой кусок, который будет использоваться в качестве основы для фокусных инъекций ДНК.Затем поместите блоки агарозы в ледяной раствор Кребса. Для инъекции смешайте экспрессию и контроль векторной ДНК при концентрации одного микрограмма на микролитер для каждого вектора и добавьте быстрый зеленый раствор при разбавлении от одного до 10. Заполните вытащил 0,5-миллиметровый внутренний диаметр, один миллилитр наружного диаметра стеклянный микропипет с 10 микролитров смеси ДНК и загрузить микропайпет в пневматический picoPump инжектор.Поместите большой блок агарозы под стерео микроскопом и поместите ломтик, который будет введен на кусок агарозы. Затем ввимите от 25 до 50-нанолитровых томов в выбранную медиальной ганглионной или каудальной ганглия в области эмуляции ломтика. Сразу же после инъекции поместите небольшой блок агарозы на электрод чашки Петри и используйте плоский конец микроспатула, чтобы прикрепить колонку агарозы к мобильному электроду крышки.Перенесите вводимый ломтик с поддерживающей мембраной на блок агарозы и поместите верхний электрод с колонкой агарозы поверх выбранной области ломтика. Затем, электропорат области с двумя пять миллисекундных импульсов 125 вольт, 500 миллисекунд друг от друга. После электропорации поместите ломтик с поддерживающей мембраной обратно в его удерживающую тарелку и верните блюдо в инкубатор культуры тканей.Через час замените минимальную необходимую среду базовой средой, подходящей для первичных нейронных культур, и верните ломтики в инкубатор на ночь. В этих экспериментах электропорации, приблизительно 50% из GFP положительных нейронов co-expressed положительный впрыскиваемый протеин RFP и поэтому, GFP положительное отрицательное население RFP служило как внутренний контроль для влияния впрыснутых лигандов дна. Администрация Клозапина и оксида избирательно повышает активность трансфицированных положительных клеток RFP, о чем свидетельствует экспрессия зависимого от активности белка c-Fos в этих новорожденных короналовых тканях.Клозапин и оксид лечения также приводит к увеличению доли GFP-положительных RFP-положительных клеток по сравнению с числом GFP-положительных RFP-отрицательных клеток по сравнению с транспортным средством вводят littermates. Эта процедура может быть использована для изучения влияния активности модулированных привитых интернейронов на пластичность кровообращения и функцию мозга хозяина.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection и первичной культуры эмбриональных Мышь гиппокампа и корковых нейронов

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Мозаика Анализ функции генов в постнатальном развитии мозга мыши с помощью вирусов основан Cre Рекомбинация

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Хирургическое трансплантации Мышь нейронных стволовых клеток в спинной мозг мышей, инфицированных Нейротропные вируса гепатита мышь

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Выделение и культуры мышь кортикальной астроциты

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Экс внутриутробно электропорации и всего Экспланты полушарии: Простой экспериментальный метод исследования раннего развития коры

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Микронного масштаба Разрешение оптической томографии целых мозг мышей с конфокальной Light Sheet микроскопии

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Моделирование Астроцитома Патогенез<em&gt; In Vitro</em&gt; И<em&gt; В Vivo</em&gt; Использование кортикальной астроциты или нервные стволовые клетки из условного, генной инженерии мышей

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

Дифференциация мышиных эмбриональных стволовых клеток в корковых межнейронного прекурсоров

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Стереотаксической хирургии для генетических манипуляций в полосатой клеток мозга новорожденных мыши

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Homochronic трансплантация межнейронного прекурсоров в раннем постнатальном мыши мозги

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...