Name: high-throughput dna plasmid multiplexing and transfection using acoustic nanodispensing technology
Uploaded: 2019-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology at JoVE.com

كشف المؤلفون عن تلقي الدعم المالي التالي للبحث و/أو التأليف و/أو نشر هذه المقالة: Inserm, Lille University, Lille Pasteur Institute, Council Régional du Nord, and PRIM-HCV1 and 2 (Pôle de Recherche Interdisciplinaire sur le Médicament), Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-EQPX-04-01), the Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) and the European Community (ERC-STG INTRACELLTB n° 260901). ويود المؤلفان أن يشكرا الدكتور س. موريو، والدكتور ب. فيلماغني، والدكتور ر. فيرو - كليمنت، والدكتور ه. غرولت على استعراضهم النقدي للمخطوطة وتصحيحاتهم لها.

1 - الأعمال التحضيرية المسبقة
<ol><li>إعداد برامج معالج السائل التمعجي ملاحظة: للحصول على خطوات الاستغناء عن الخلية والخلية من البروتوكول، يجب إعداد برنامج مخصص، مع الأخذ في الاعتبار ارتفاع رأس الاستغناء إلى اللوحة المستخدمة والقصد الخطوة.<ol>
<li>بالنسبة لخطوة الاستغناء عن الاستغن...

<ol>
	<li>Colin, B., Deprez, B., Couturier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+DNA+Plasmid+Transfection+Using+Acoustic+Droplet+Ejection+Technology.">High-Throughput DNA Plasmid Transfection Using Acoustic Droplet Ejection Technology.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R &#38; D. , 2472555218803064 (2018).</li><li>Mirus Bio. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optimising Transfection Performance. , (2019).</li><li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Factors Influencing Transfection Efficiency | Thermo Fisher Scientific - FR. , (2019).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).</li><li>Figueroa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanistic+investigation+exploring+the+differential+transfection+efficiencies+between+the+easy-to-transfect+SK-BR3+and+difficult-to-transfect+CT26+cell+lines.">A mechanistic investigation exploring the differential transfection efficiencies between the easy-to-transfect SK-BR3 and difficult-to-transfect CT26 cell lines.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 36 (2017).</li><li>Kirchenbuechler, I., Kirchenbuechler, D., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+cationic+lipid-based+transfection+and+cell+division.">Correlation between cationic lipid-based transfection and cell division.</a> Experimental Cell Research. 345 (1), 1-5 (2016).</li><li>Zhang, Z., Qiu, S., Zhang, X., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+DNA+electroporation+for+primary+human+T+cell+engineering.">Optimized DNA electroporation for primary human T cell engineering.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), 4 (2018).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+activity+and+the+mechanism+of+pDNA-complexes+based+on+the+hybrid+of+low-generation+PAMAM+and+branched+PEI-1.8k.">Transfection activity and the mechanism of pDNA-complexes based on the hybrid of low-generation PAMAM and branched PEI-1.8k.</a> Molecular bioSystems. 9 (12), 3175-3186 (2013).</li><li>Bos, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+semi-automated+high+throughput+transient+transfection+system.">Development of a semi-automated high throughput transient transfection system.</a> Journal of Biotechnology. 180, 10-16 (2014).</li><li>Colosimo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+and+expression+of+foreign+genes+in+mammalian+cells.">Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells.</a> BioTechniques. 29 (2), 314-318 (2000).</li><li>Villa-Diaz, L. G., Garcia-Perez, J. L., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+transfection+efficiency+of+human+embryonic+stem+cells+by+the+incorporation+of+DNA+liposomes+in+extracellular+matrix.">Enhanced transfection efficiency of human embryonic stem cells by the incorporation of DNA liposomes in extracellular matrix.</a> Stem Cells and Development. 19 (12), 1949-1957 (2010).</li><li>Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Reverse transfection method. , WO2001020015A1 (2001).</li><li>Raymond, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+polyethylenimine-mediated+transfection+process+for+large-scale+and+high-throughput+applications.">A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications.</a> Methods (San Diego, CA). 55 (1), 44-51 (2011).</li><li>Junquera, E., Aicart, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+gene+therapy+to+deliver+nucleic+acids+with+multivalent+cationic+vectors.">Recent progress in gene therapy to deliver nucleic acids with multivalent cationic vectors.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 233, 161-175 (2016).</li><li>Woodruff, K., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Microfluidic+Platform+for+Mammalian+Cell+Transfection+and+Culturing.">A High-Throughput Microfluidic Platform for Mammalian Cell Transfection and Culturing.</a> Scientific Reports. 6, 23937 (2016).</li><li>Vasileiou, T., Foresti, D., Bayram, A., Poulikakos, D., Ferrari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+Contactless+Biology:+Acoustophoretic+DNA+Transfection.">Toward Contactless Biology: Acoustophoretic DNA Transfection.</a> Scientific Reports. 6, 20023 (2016).</li><li>Hadimioglu, B., Stearns, R., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+Liquids+with+Sound:+The+Physics+of+Acoustic+Droplet+Ejection+for+Robust+Laboratory+Automation+in+Life+Sciences.">Moving Liquids with Sound: The Physics of Acoustic Droplet Ejection for Robust Laboratory Automation in Life Sciences.</a> Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 4-18 (2016).</li><li>Grant, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+accurate+compound+concentration+in+cell-based+screening:+validation+of+acoustic+droplet+ejection+technology.">Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology.</a> Journal of Biomolecular Screening. 14 (5), 452-459 (2009).</li><li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+That+Enable+Accurate+and+Precise+Nano-+to+Milliliter-Scale+Liquid+Dispensing+of+Aqueous+Reagents+Using+Acoustic+Droplet+Ejection.">Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection.</a> Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 166-177 (2016).</li><li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+protein+palette:+tools+for+cellular+imaging.">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chemical Society Reviews. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li><li>Zielinski, D., Gordon, A., Zaks, B. L., Erlich, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPipet:+sample+handling+using+a+tablet.">iPipet: sample handling using a tablet.</a> Nature Methods. 11 (8), 784-785 (2014).</li><li>Brunner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+dependence+of+gene+transfer+by+lipoplex,+polyplex+and+recombinant+adenovirus.">Cell cycle dependence of gene transfer by lipoplex, polyplex and recombinant adenovirus.</a> Gene Therapy. 7 (5), 401-407 (2000).</li><li>Nii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell-State+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Increases+Transfection+Efficiency.">Single-Cell-State Culture of Human Pluripotent Stem Cells Increases Transfection Efficiency.</a> BioResearch Open Access. 5 (1), 127-136 (2016).</li><li>Noonan, D. J., Henry, K., Twaroski, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Mammalian+Cell-Based+Transient+Transfection+Assay.">A High-Throughput Mammalian Cell-Based Transient Transfection Assay.</a> Signal Transduction Protocols. 284, 051-066 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transfection | TransIT Transfection Reagents | Mirus Bio. , (2015).</li><li>American Type Culture Collection. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> General protocol for transfection of stem cells, primary cells, and continuous cell lines with ATCC TransfeX Transfection Reagent. , (2017).</li><li>American Type Culture Collection. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transfection Reagents for Nucleic Acid Transfer into ATCC Cells. , (2017).</li><li>de Los Milagros Bassani Molinas, M., Beer, C., Hesse, F., Wirth, M., Wagner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+transient+transfection+process+of+HEK-293+suspension+cells+for+protein+production+by+nucleotide+ratio+monitoring.">Optimizing the transient transfection process of HEK-293 suspension cells for protein production by nucleotide ratio monitoring.</a> Cytotechnology. 66 (3), 493-514 (2014).</li><li>Promega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> FuGENE&#174; 6 Transfection Reagent. , (2019).</li><li>Olden, B. R., Cheng, Y., Yu, J. L., Pun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+polymers+for+non-viral+gene+delivery+to+human+T+cells.">Cationic polymers for non-viral gene delivery to human T cells.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 282, 140-147 (2018).</li><li>Park, E., Cho, H. B., Takimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+gene+delivery+into+adipose-derived+stem+cells:+transfection+of+cells+in+suspension+with+the+use+of+a+nuclear+localization+signal+peptide-conjugated+polyethylenimine.">Effective gene delivery into adipose-derived stem cells: transfection of cells in suspension with the use of a nuclear localization signal peptide-conjugated polyethylenimine.</a> Cytotherapy. 17 (5), 536-542 (2015).</li><li>Wood, R. W., Loomis, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+and+biological+effects+of+high-frequency+sound-waves+of+great+intensity.">The physical and biological effects of high-frequency sound-waves of great intensity.</a> The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 4 (22), 417-436 (1927).</li><li>Mamat, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eliminating+Endotoxin+at+the+Source+-+A+Novel+Competent+Cell+Line+with+Modified+Lipopolysaccharide+for+Low-Endotoxin+Plasmid+Production.">Eliminating Endotoxin at the Source - A Novel Competent Cell Line with Modified Lipopolysaccharide for Low-Endotoxin Plasmid Production.</a> , (2014).</li><li>Ivanova, N. V., Kuzmina, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+dry+DNA+storage+and+shipment+at+room+temperature.">Protocols for dry DNA storage and shipment at room temperature.</a> Molecular Ecology Resources. 13 (5), 890-898 (2013).</li><li>Lesnick, J., Lejeune-Dodge, A., Ruppert, N., Jarman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High-Precision Cell Dispensing with the Labcyte Echo&#174; Liquid Handler. , (2017).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+public+genome-scale+lentiviral+expression+library+of+human+ORFs.">A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs.</a> Nature Methods. 8 (8), 659-661 (2011).</li><li>Peng, J., Zhou, Y., Zhu, S., Wei, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screens+in+mammalian+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">High-throughput screens in mammalian cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> The FEBS journal. 282 (11), 2089-2096 (2015).</li></ol>

يتطلب إنشاء وتحسين طريقة نقل عالية الإنتاجية دقيقة لخط خلية معين من العلماء اتباع بعض المعلمات الرئيسية الموضحة في هذا القسم. ونحن نشجع بقوة بدءا من القيم الموصى بها في جميع أنحاء البروتوكول كما أثبتت هذه الإعدادات الأمثل لخلايا HeLa أيضا أن تكون فعالة لخلايا HEK. ومع ذلك، كما أن أفضل المعلما...

تصف الطريقة المعروضة هنا بالتفصيل كيفية إجراء تعدد الإرسال والتركيب الحمض النووي في خلايا الثدييات ذات الإنتاجية العالية باستخدام موزع نانوي سائل صوتي في لوحة تبلغ مساحتها 384 بئرًا، حتى لغير المتخصصين في هذا المجال. يسمح هذا الأسلوب1 نشرت مؤخرا أداء ما يصل إلى 384 حالة متعددة الحمض النووي بلازميد مستقلة وأجهزة التغوط في تجربة واحدة، في أقل من 1 ح. كانت التجارب واحدة أو cotransfection ناجحة، لتصل إلى ما يقرب من 100٪ التكفين داخل السكان الخلايا المنقولة. يجعل هذا البروتوكول التغوط أسهل لأن معظم الخطوات المملة والمستهلكة للوقت والمعرضة للأخطاء هي الآن مدفوعة بالبرامج (راجع الشكل 1 للحصول على نظرة عامة). وقد بُذلت جهود أخرى لوضع أدوات مكرسة لتعزيز سهولة الاستخدام مع تجنب الأخطاء البشرية خلال العملية ككل وتشجيع التغوط الناجح حتى لغير المتخصصين في الميدان. يتضمن البروتوكول الموصوف جدول بيانات ماكرو "سهل الاستخدام" قمنا بتطويره من أجل إدارة 384 حالة تحويل مستقلة مع إمكانيات تعدد المضاعفات تصل إلى أربعة بلازميدات في كل بئر. يقوم الماكرو تلقائياً بإنشاء قوالب لوحة (لوحات) المصدر لتحميل وحدة تخزين بلازميد الحمض النووي المتوقعة من بدء حلول المخزون والملفات المطلوبة لدفع برنامج nanodispenser على التصميم التجريبي الذي تم إدخاله. كما الاستغناء اليدوي للحمض النووي في لوحة مصدر 384 جيدا مملة وعرضة للخطأ، كما قمنا بتطوير تطبيق مخصص المستندة إلى قرص لتوجيه المستخدم في حين الاستغناء عن محلول الحمض النووي وفقا للقالب.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59570/59570fig1v3.jpg"> الشكل 1: سير العمل التجريبي. التمثيل التخطيطي لبروتوكول الانعطاف العكسي الآلي الأمثل (من التصميم التجريبي إلى الاستخدام البيولوجي المخصص). تتم الإشارة إلى الخطوات اليدوية بواسطة رمز اليد ويتم كتابة الوقت التقريبي لكل خطوة في مربع أحمر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59570/59570fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
العديد من التجارب القائمة على الخلايا تبدأ مع نقل الحمض النووي بلازميد، وحتى لو كان العديد من الكواشف المخصصة ولا تزال قيد التطوير لتعزيز كفاءة التغوط و / أو تخفيف الإجراء، لا يزال هناك الكثير الذي يتعين القيام به2،3 , 4.الحمض النووي بلازميد خلية التغوط ينطوي على عدة خطوات للوصول إلى كفاءة عالية، مثل التناول الأولي المعقد، والهروب الانزودوم، ونقل السيتوبلازمية إلى النواة 5،6. بالإضافة إلى هطول الكالسيوم أو التقنيات الفيزيائية مثلالكهربائي أو الحقن الدقيق باستخدام أجهزة مخصصة 7، ركزت الأساليب الكيميائية الحديثة على تعزيز تسليم خلايا الحمض النووي مع خفض السمية الخلوية الخلية8، 9. استخدام الدهون أو البوليمرات الموجبة تشكيل المجمعات مثل liposome، ومؤخرا، نظم الكيمياء البوليمرية nonliposomal جعلت التغوط أسهل وأكثر كفاءة10. وعلى الرغم من هذه التطورات، لا يزال نقل الخلايا يتطلب مهارات محددة ليتم تنفيذها بدقة لأن معظم هذه البروتوكولات الفيزيائية الفيزيائية أو الكيميائية تتطلب من العلماء إعداد كل حالة تفاعل عبر الحمض النووي يدوياً، وبالتالي إضعاف الإنتاجية. وللتحايل على هذه المشكلة، تم تطوير بروتوكولات التغوط العكسي باستخدام كواشف الانفال الكيميائي11و12و13، مما يمكّن المستخدم من اختبار أو الجمع بين العديد من البلازميدات بطريقة أسرع. في هذه البروتوكولات ، يتم تشكيل مجمعات الأحماض النووية مع الكواشف عبر التغوط قبل بذر الخلايا على المجمعات. ومع ذلك، لا تزال هذه البروتوكولات العكسية محدودة بالمعالجة اليدوية لحلول الحمض النووي والجمع بين كل من الشروط المستقلة. على الرغم من أنه من الممكن تنفيذها في شكل لوحة 96 جيدا، وإعداد الحمض النووي والاستغناء ستكون مملة، ومن المرجح أن تكون هناك أخطاء. عندما تكون هناك حاجة إلى كميات مختلفة من بلازميدات الحمض النووي عدة وتعدد مع بعضها البعض، وتبديل الخلايا يصبح أكثر صعوبة لتحقيق وأكثر استهلاكا للوقت، والأخطاء البشرية تصبح حتمية جدا. يصبح الارتقاء إلى شكل لوحة 384 بئر في نهج التغوط العكسي، على الرغم من عدد قليل من ظروف الانف من الحمض النووي المتعدد، تحديا مستحيلا بسبب الأسباب التالية. '1' كميات الحمض النووي، أو كاشف التغوط، أو أحجام خليط التفاعل التي يجب إدارتها أقل من 1 ميكرولتر لكل بئر. '2' يصبح تعدد الإرسالات لـ 384 حالة مستقلة معقداً للغاية. التسليم في كل من الآبار 384 هو أيضا 3) تستغرق وقتا طويلا للغاية و '4' عرضة للخطأ. والواقع أن الاستغناء عن الحل الصحيح في الآبار المتوقعة من الصعب إدارته لأن الأحجام المنخفضة التي تم صرفها بالفعل لا تسمح بالمراقبة البصرية بين الآبار الفارغة والمملوءة بالفعل. v) وأخيرا، هناك خطر كبير من تجفيف الخليط عن طريق التبخر قبل إضافة الخلايا بسبب الوقت اللازم لتنفيذ الخطوات اللازمة الاستغناء. وباختصار، يبدو أن العامل المقيد لإعداد اختبارات الاستئصال بلازميد الحمض النووي عالية الإنتاجية هو تصغير الاختبار، مما يعني تعدد الإرسال والإدارة بكميات منخفضة والتي لا يمكن معالجتها يدوياً بعد الآن ولكن هاهي أيضاً بالكاد يمكن تحقيقها في طريقة موثوق بها من قبل معالجات السائل حول الاستاتيكيه الكلاسيكية.
وكدليل على صعوبة أتمتة مثل هذه الاختبارات والحصول على الإنتاجية العالية، لم يتم نشر سوى عدد قليل من المحاولات لأتمتة التغوط: شكل لوحة 96 بئر باستخدام جهاز مناولة السائل التجاري وهطول الأمطار فوسفات الكالسيوم14 ومؤخرا، كاشف lipoplex، ورقاقة microfluidic تمكين 280 transfections مستقلة15 ولكن تتطلب مهارات متخصصة في هذا المجال. طريقة أخرى، acoustophoresis، مما يسمح رفع السائل ويؤدي إلى التلاعب السائل وخلط، واستخدمت لأداء التغوط الحمض النووي في 24- إلى 96 جيدا أشكال لوحة16. وعلى الرغم من أن هذا النهج ممكن، إلا أنه يعاني من انخفاض شديد في الإنتاجية لأن اختلاط الخلايا بخليط الانفعالات الحمض النووي يتطلب حضانة 60 درجة لكل نقطة قبل البذر. وهذا يعني مدة لا تقل عن 96 دقيقة للوحة كاملة 96 جيدا. وعلاوة على ذلك، فإن هذا البروتوكول بعيد كل البعد عن أن يكون قابلاً لجمهور علماء الأحياء عموماً لأن هذا العمل قد أنجز باستخدام جهاز داخلي مصمم ومصنع غير متوفر حالياً في السوق. على العكس من ذلك، في السنوات القليلة الماضية، ظهرت تكنولوجيا صرف سهلة الاستخدام تستند إلى البرمجيات والصوتية مع أجهزة موزع نانوحجم. باستخدام الطاقة الصوتية المركزة، تسمح هذه الأجهزة بالطرد بإحكام للأحجام السائلة الصغيرة من 2.5 نل إلى 500 نل من لوحة المصدر إلى وجهة واحدة17. هذه التكنولوجيا، وتسمى طرد قطرات الصوتية (ADE)، لديها العديد من المزايا: أنها مؤتمتة بالكامل، لا تلامس، tipless، دقيقة، ودقيقة، واستنساخ للغاية، ولها نسبة عالية من الإنتاجية18. أول مكرسة لتقديم حلول كبريتيد ثنائي الميثيل (DMSO)، وقد تم تعزيز إعدادات لتوزيع المخازن المؤقتة المائية19. ثم، تبدو موزعات النانو الصوتية مناسبة لبروتوكولات نقل الخلايا العكسية ويمكن أن تتحايل على معظم القيود اليدوية المذكورة أعلاه. وبما أنه لم يتم وصف أي محاولات للمُخِّل البلازميد باستخدام هذه التكنولوجيا، فقد قمنا مؤخرًا بتقييم مدى ملاءمة نظام الاستغناء الصوتي لأداء عمليات نقل الخلايا العكسية.
الاستفادة من الإنتاجية nanodispenser وسهولة الاستخدام، ونحن الأمثل بروتوكول التغوط العكسي لخلايا HeLa عن طريق عبر اختبار العديد من المعلمات التي يمكن أن تؤثر على الحمض النووي transfection على 384 جيدا، لوحة واحدة، وهي كمية الحمض النووي الإجمالي و مصدر تركيز الحمض النووي بداية، حجم مخفف، كاشف التغوط، وعدد من الخلايا انتشار. يتحايل البروتوكول المطور على القيود اليدوية الموصوفة أعلاه لسلك الخلايا ويعرض العديد من المزايا على محاولات الانسياق الآلي الأخرى. أولا، هو مصغرة، مما يسمح لكاشف الانفعال من حيث التكلفة عن طريق حفظ الاستعدادات بلازميد الحمض النووي وكاشف التغوط. ثانيا، هو أكثر من ذلك بكثير عالية الإنتاجية واستنساخها من البروتوكول اليدوي (حتى للمبتدئين)، كما يمكن تحقيق التغوط من لوحة 384 جيدا كامل في أقل من 1 ساعة. وأخيرا، هو البرمجيات يحركها، مما يسمح للسيطرة على كمية الحمض النووي الاستغناء عنها ومضاعفات من العديد من بلازميدات. في الواقع، وذلك بفضلبرنامج nanodispenser (جدول المواد)، يمكن للمستخدم وضع خطة دراسية للسيطرة على وحدات التخزين التي سيتم الاستغناء عنها من مصدر محدد لوحة جيدا إلى وجهة واحدة.
البروتوكول المعروض هنا مخصص بشكل رئيسي لأولئك الذين لديهم إمكانية الوصول إلى موزع نانوويرغبون في إعداد تجارب التغوط بالإنتاجية العالية، ولكن أيضًا لأولئك الذين يرغبون في تحسين معلمات الانفبنسبة بسرعة لنوع خلية معين من خلال تطبيق هذا البروتوكول لاختبار عدة معلمات في الإنتاجية العالية. وفي الواقع، أظهرنا أن البارامترات المحسنة المحددة بهذا البروتوكول على نطاق نانوي يمكن نقلها إلى تجارب عمليات الانعترا بالكامل وعلى نطاق أوسع. وأخيراً، بما أن كاشف الانفة المستخدمة في هذا البروتوكول يسمح بالحمض النووي أو الكسر في الحمض النووي وفقاً للشركة المصنعة، فإن البروتوكول يهم أيضاً أولئك الذين يهدفون إلى تنفيذ نُهُج الصفيف للإفراط في التعبير الجيني أو الضربة القاضية. لوحات الوجهة المليئة مسبقا مع الحمض النووي يمكن الحفاظ عليها تصل إلى 7 أيام قبل استخدامها في اختبار التغوط دون فقدان الفعالية، والتي هي ميزة أخرى من البروتوكول التالي لهذا النوع من التطبيق.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1226px;" width="1224">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">384LDV Microplate</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;">LP-0200</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">384-well Microplate &#956;Clear Black</td>
			<td style="width:363px;">Greiner</td>
			<td style="width:202px;">781906</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:363px;">Sigma</td>
			<td style="width:202px;">A9393-5G</td>
			<td style="width:291px;">Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Android Tablet</td>
			<td style="width:363px;">Samsung</td>
			<td style="width:202px;">Galaxy Note 8</td>
			<td style="width:291px;">used to guide the user while the source plate manual dispense</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Aniospray Surf 29</td>
			<td style="width:363px;">Anios</td>
			<td style="width:202px;">2421073</td>
			<td style="width:291px;">disinfectant to clean the MicroFlo head</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Columbus software</td>
			<td style="width:363px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">image analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">10566032</td>
			<td style="width:291px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:371px;">Echo Cherry Pick 1.5.3 software</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Echo550</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">ADE-based dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">16000044</td>
			<td style="width:291px;">to add in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:363px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:202px;">HT501128-4L</td>
			<td style="width:291px;">to fix cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:363px;">ATCC</td>
			<td style="width:202px;">HeLa (ATCC&#174; CCL-2&#8482;)</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">H3570</td>
			<td style="width:291px;">10 mg/mL Solution in Water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">INCell Analyzer 6000</td>
			<td style="width:363px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:202px;">29043323</td>
			<td style="width:291px;">automated laser-based confocal imaging platform</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:371px;">LB medium</td>
			<td style="width:363px;">Thermoischer Scientific 
			LB Broth Base (Lennox L Broth Base)&#174;, powder</td>
			<td style="width:202px;">12780052</td>
			<td style="width:291px;">culture medium for bacteria growth</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Lysis Buffer (A2)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740912.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">MicroFlo 10&#181;L cassette</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7170013</td>
			<td style="width:291px;">to use with the Microflo Dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">MicroFlo 1&#956;L cassette</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7170012</td>
			<td style="width:291px;">to use with the Microflo Dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">MicroFlo Dispenser</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7171000</td>
			<td style="width:291px;">peristaltic pump-based liquid handler device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Microvolume spectrophotometer</td>
			<td style="width:363px;">Denovix</td>
			<td style="width:202px;">DS-11 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:291px;">Measure the DNA concentration of samples</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:371px;">mVenus plasmid</td>
			<td style="width:363px;">mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Neutralization Buffer (A3)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740913.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">NucleoSpin Plasmid kit</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740588.50</td>
			<td style="width:291px;">used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">31985070</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">optional Wash bufferWash Buffer (A4)</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740914.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;">orbital shaker&#160;</td>
			<td style="width:363px;">incubated large capacity shaker</td>
			<td style="width:202px;">444-7084</td>
			<td style="width:291px;">Used to grow bacteria under gentle agitation and 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">15140122</td>
			<td style="width:291px;">10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">10010001</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Plasmid mini-columns</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740499.250</td>
			<td style="width:291px;">Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Resuspension Buffer (A1)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740911.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">RNAse A</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740505</td>
			<td style="width:291px;">Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">tdTomato-N1 plasmid</td>
			<td style="width:363px;">Addgene</td>
			<td style="width:202px;">Plasmid #54642</td>
			<td style="width:291px;">Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">TransIT-X2 Dynamic Delivery System</td>
			<td style="width:363px;">Mirus Bio</td>
			<td style="width:202px;">MIR 6000</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Wash Buffer (AW)</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740916.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">3D printer</td>
			<td style="width:363px;">Creality</td>
			<td style="width:202px;">CR10S</td>
			<td style="width:291px;">used to print the plate adapter</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:371px;">Blender Software&#160;</td>
			<td style="width:363px;">&#160;https://www.blender.org/ 
			Free software under GNU General Public License (GPL).</td>
			<td style="width:202px;">version 2.79b</td>
			<td style="width:291px;">used to design the plate adapter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput dna plasmid multiplexing and transfection using acoustic nanodispensing technology

نقل الخلايا، لا غنى عنه للعديد من الدراسات البيولوجية، يتطلب السيطرة على العديد من المعلمات لتحقيق إنجاز دقيق وناجح. في معظم الأحيان يؤديها في الإنتاجية المنخفضة، وعلاوة على ذلك تستغرق وقتا طويلا وعرضة للخطأ، حتى أكثر من ذلك عند تعدد البلازميدات. قمنا بتطوير طريقة سهلة وسريعة ودقيقة لتنفيذ نقل الخلايا في تخطيط لوحة 384-well باستخدام تقنية طرد قطرات الصوتية (ADE). ويستند جهاز nanodispenser المستخدمة في هذه الدراسة على هذه التكنولوجيا ويسمح تسليم نانوحجم دقيق بسرعة عالية من لوحة مصدر جيدا إلى وجهة واحدة. فإنه يمكن الاستغناء ومتعددة الحمض النووي وكاشف الانف وفقا لجدول بيانات مصممة مسبقا. هنا نقدم بروتوكول الأمثل لإجراء ADE القائم على عالية الإنتاجية البلازمية التغوط الذي يجعل من الممكن للوصول إلى كفاءة تصل إلى 90٪ وcotransfection ما يقرب من 100٪ في تجارب cotransfection. نقوم بتوسيع نطاق العمل الأولي من خلال اقتراح ماكرو يستند إلى جداول البيانات سهلالاستخدام، وقادر على إدارة ما يصل إلى أربعة بلازميدات/آبار من مكتبة تحتوي على ما يصل إلى 1536 بلازميدات مختلفة، وتطبيق دليل الأنابيب المستندة إلى الكمبيوتر اللوحي. يقوم الماكرو بتصميم القالب (القوالب) الضرورية للوحة (لوحات) المصدر ويقوم بإنشاء الملفات الجاهزة للاستخدام للتطبيق المستند إلى nanodispenser والكمبيوتر اللوحي. بروتوكول الانتقطاع أربع خطوات ينطوي على ط) الاستغناء عن مخفف مع معالج السائل الكلاسيكية، '2' توزيع بلازميد ومتعددة، '3' كاشف الانعتراب الاستغناء عن موزع النانو، و 4) طلاء الخلايا على الآبار المملوءة مسبقا. تسمح السيطرة الموصوفة المستندة إلى البرامج من تعدد الإرسال والتغوط بلازميد ADE حتى غير المتخصصين في الميدان بإجراء عملية نقل خلايا موثوق بها بطريقة سريعة وآمنة. تتيح هذه الطريقة التعرف السريع على الإعدادات المثلى لنوع خلية معين ويمكن نقلها إلى نهج أعلى مقياسوية ويدوية. ويخفف البروتوكول من التطبيقات، مثل بروتين ORFeome البشري (مجموعة من إطارات القراءة المفتوحة في الجينوم) أو التحقق من صحة وظيفة الجينات المستندة إلى CRISPR-Cas9، في استراتيجيات الفحص غير المجمعة.

fIn لتحديد ما إذا كان يمكن استخدام تكنولوجيا ADE لبروتوكول الانقباة العكسية الآلي، رصدنا كفاءة الانفذيب الخلوي عن طريق الفحص المجهري الفلوري، وذلك باستخدام tdTomato الفلورسنت الأحمر التعبير عن بلازميد. تهدف أولاً إلى تحديد أفضل معلمات التغوط، وأحجام مخففة مختلفة وكميات إجما?...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology at JoVE.com

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

عالية الإنتاجية الحمض النووي بلازميد تعدد الإرسال والتحويل باستخدام تكنولوجيا نانوالاستغناء الصوتية

يصف هذا البروتوكول نقل الخلايا البلازمية عالي الإنتاجية في لوحة تبلغ 384 بئرًا باستخدام تقنية طرد قطرات القطرة الصوتية. وتستغرق وقتا طويلا، وعرضة للخطأ صرف الحمض النووي ومتعددة، ولكن أيضا الاستغناء عن الكاشف transfection، هي البرمجيات التي يحركها جهاز nanodispenser. ثم يتم زرع الخلايا في هذه الآبار المملوءة مسبقا.

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

بروتوكول NanoDispenser المستندة إلى وضع وصف في هذا الفيديو يمثل أول طريقة سهلة الاستخدام، عالية الإنتاجية transfection السماح حتى للمبتدئين في هذا المجال لتكون ناجحة. هذا هو سهل على تقنية عالية الإنتاجية يسمح transfection الخلية مع شرط مستقل 384. اعتبارا من الآن، فإن الأسلوب هو انخفاض التكلفة نظرا لحجم نانو من الكاشف اللازمة.لتحديد أفضل معلمات نقل لجميع أنواع الخلايا، نقترح الحفاظ على تركيز الحمض النووي المصدر ثابت، واستخدام كميات مختلفة من الحمض النووي المصاب، كاشف العدوى، وعدد الخلايا. للاستغناء عن 40 microliter تعليق الخلية ، تحميل 10 ميكرولتر كاسيت على جهاز معالج السائل المتعامد ، وإعداد برنامج مناسب. أولاً، ضبط معلمة معدل التدفق إلى مستوى منخفض للاستغناء عن الخلايا ذات السرعة المنخفضة لتجنب تعزيز الضرر المحتمل للخلايا بسبب الإجهاد الهائل والتأثير العالي على قاع الآبار.ثم، ضبط ارتفاع الاستغناء إلى 11.43 ملليمتر. يجب أن يكون الارتفاع مرتفعًا بما يكفي لخفض تأثير الخلية على الجزء السفلي من الآبار أثناء عملية الاستغناء ، ولكنه منخفض بما يكفي لتجنب الاحتفاظ بالقطيرات على رأس الاستغناء. بعد ذلك، ضبط ارتفاع لوحة واضحة إلى 16 ملليمتر للسماح التشريد الحرة من رئيس الاستغناء على لوحة بعد الاستغناء عن كل صف.التحكم بصريا في الإعدادات المناسبة لارتفاع الرأس معالج السائل ال peristaltic. تأكد من عدم وجود قطرات يتم الاحتفاظ بها على نصائح الاستغناء أثناء الاستغناء. أيضا التحقق من أن الرأس مرتفع بما يكفي للسماح بتشريد الرأس بعد الاستغناء عن كل صف.لتوليد قوائم اختيار لدفع ADE الاستغناء، تم تطوير ماكرو جدول بيانات سهل الاستخدام لإدارة كميات الحمض النووي وخلط ما يصل إلى أربعة plasmids في شكل لوحة 384 جيدا. يتم ملء وحدات التخزين المثلى مسبقًا في بعض خلايا جدول البيانات، ولكن يمكن تغييرها. في الحقول الوردية، يتم تعيين كاشف transfection، أو قيمة خليط TR، إلى 500 نانولترات.يتم تعيين الحد الأدنى من قيمة حجم في آبار لوحة المصدر إلى أربعة ميكروليتر، وحجم الحد الأقصى في آبار لوحة المصدر إلى 11.25 ميكرولترات. أدخل 100 نانوغرام لكل dna microliter بدء التركيزات في الحقول الزرقاء المقابلة للحمض النووي الكامنة. ثم أدخل كمية الحمض النووي المطلوبة في الحقول الرمادية والأخضر المقابلة ل384 بئرا من لوحة.أدخل المبالغ وأسماء البلازميد وتأكد من استخدام نفس الهجاء إذا كان يجب أن يتم نقل نفس البلازميد في عدة آبار. انقر فوق إنشاء قوائم اختيار للتحقق من القيم المدخلة، وإذا طلب ذلك، قم بتصحيح الخلايا المليئة باللون البرتقالي والتي تشير إلى أخطاء أو وحدات تخزين لا يمكن معالجتها بواسطة NanoDispenser. إذا لم يتم الكشف عن أي، فإن الماكرو توليد 384 جيدا الاستغناء الدليل، وملف اختيار الحمض النووي، وملف قائمة اختيار TR من البيانات التي تم جمعها على الأوراق المقابلة.اطبع القالب من ورقة اللوحة المصدر لتصور الآبار التي سيتم ملؤها قبل الاستغناء. يتم الإشارة إلى أسماء plasmid وأحجام التعبئة الدنيا. يشار إلى وحدات تخزين الخليط المُكْشف المُنْتَرَض الذي سيتم ملؤه في الآبار التالية، على أنها تُرَجَّز باللون الأخضر.لإعداد لوحة مصدر الحمض النووي، تمييع بلازميد الحمض النووي المخزن إلى 100 نانوغرام لكل ميكرولتر باستخدام الماء المقطر. الآن، معايرة شبكة 384 جيدا لأبعاد لوحة. افتح تطبيق دليل Well Pipetting 384 على جهاز لوحي.ضع موضع المصدر على الشبكة على الشاشة السفلية. في قائمة المعايرة العلوية اليسرى، انقر فوق زائد أو ناقص لتحسين أو تقليل حجم الشبكة والآبار من أجل ضبط الآبار الخضراء إلى آبار الزاوية الأربعة للصفيح. باستخدام الشريط المزدوج من جانب، جبل 3D محول لوحة مطبوعة على الشاشة لتجنب حركات لوحة المصدر في حين الاستغناء.إذا لزم الأمر، قم بتحريك الشبكة معايرة باستخدام الأسهم التدوير ولأعلى، أسفل، اليمين، اليسار لضبط الشبكة إلى موقف لوحة. بمجرد معايرة الشبكة وأحجام البئر وتحديد موقعها بشكل صحيح ، ضع علامة على مربع معايرة القفل. انقر على الملف وفتح 384 ويلز - Pipetting الدليل.CSV ملف. اتبع تعليمات الشاشة لصرف يدويا حجم يشار إليه من plasmid في تركيز محدد في الأبيض جيدا تمييز يتوافق مع الوجهة المستهدفة المناسبة من لوحة المتوقعة. استخدام الأسهم ناقص أو زائد للعودة أو أبعد في عملية صرف الحمض النووي.توقف عن الاستغناء عند الوصول إلى أول محلول كاشف نقل الحمل لتحميل. بمجرد الانتهاء من الاستغناءات الحمض النووي، وإزالة لوحة المصدر من المحول. إذا كان العديد من لوحات المصدر هي لملء، وضع لوحة مصدر جديد على المحول واتبع الإرشادات الاستغناء.أجهزة الطرد المركزي الحمض النووي شغل لوحات المصدر لضمان التسوية السائلة السليمة وإزالة فقاعات مما يؤدي إلى عدم الدقة في نقل قاعدة ADE. الآن، قم بتشغيل استطلاع للتحكم في وحدات التخزين التي تم توزيعها يدويًا. على الكمبيوتر NanoDispenser ، تشغيل برنامج NanoDispenser.انتقل إلى علامة التبويب التشخيص، ووضع علامة على مصدر لوحة علبة الصادر، تحميل لوحة المصدر على حامل لوحة ووضع علامة في لإدخال لوحة. عند المطالبة، حدد 384LDV_AQ_B2 لتعيين NanoDispenser إلى وضع توزيع المخزن المؤقت مائي ثم اضغط موافق. حدد الاستطلاع في القائمة المتنوعة. وانقر على الاطلاق.حدد الآبار المعبأة مسبقا لتحليل وانقر على زر الذهاب. تحقق من أن وحدات التخزين المقاسة تتطابق مع الكميات المتوقعة، وتأكد من عدم تحميل آبار بأحجام تزيد عن 12 ميكرولتر. رئيس الأنابيب مع مصل المتوسطة الحرة عن طريق ملء وعاء معقمة جديدة مع 10 ملليلتر من مصل ما قبل الدافئة المتوسطة الحرة وغمر منظم أنبوب في ذلك.اضغط على الزر الرئيسي لمعالج السائل الرادستي لمدة 10 ثوانٍ. تأكد من عدم انسداد طرف عن طريق فحص بصريا تدفق من رئيس الاستغناء. وضع معقمة 384 جيدا لوحة الثقافة على الناقل السائل معالج السائل، وإزالة غطاء لها.تشغيل برنامج معايرة مسبقاً للاستغناء عن ميكرولتر واحد في كل بئر من لوحة 384 جيدا. الوقت الاستغناء حوالي ثماني ثوان. ثم استبدال غطاء من لوحة 384 جيدا.لإعداد ADE مدفوعة صرف الحمض النووي، تشغيل برنامج قائمة الاختيار. تعيين 384 آبار مصدرها 384LDV. تعيين الجهاز إلى وضع توزيع المخزن المؤقت مائي عن طريق تحديد 384LDV_AQ_B2.وأنواع لوحة الوجهة إلى Greiner_384PS_781096. نقل غير محسّن. حدد علامة تبويب قائمة الانتقاء.انقر على الاستيراد. وحدد ملف DNA_Picklist_CSV. ثم، انقر فوق تشغيل وحفظ البروتوكول.انقر على محاكاة لأداء محاكاة من الاستغناءات البرنامج للتأكد من أن قائمة الاختيار يطابق التصميم التجريبي المتوقع. انقر على زر التشغيل وبدء برنامج الاستغناء. عند سؤالك، قم بإدراج لوحة المصدر المطلوبة.ثم لوحة الوجهة في NanoDispenser. لإعداد الاستغناء عن كاشف transfection، والعمل في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية لتخفيف مبيد الدهون transfection في مصل الدم الحرة إلى واحد x التركيز النهائي ودوامة الأنبوب. الاستغناء فورا المزيج TR وفقا للوحة مصدر محددة مسبقا deigned بواسطة الماكرو واستخدام ما قبل معايرة 384 جيدا تطبيق دليل الأنابيب.بعد الاستغناء TR، إجراء مسح للسيطرة على وحدات التخزين المحملة TR كما فعلت من قبل للحمض النووي تحميل. حدد مزيج التفاعل transfection تعبئة مسبقة الآبار لتحليل. وانقر على زر الذهاب.تحقق من أن وحدات التخزين المقاسة تطابق تلك المتوقعة. وضمان عدم تحميل أي آبار بأحجام تزيد عن 12 ميكرولتر. الآن قم بإعادة تعيين قائمة اختيار الحمض النووي في برنامج قائمة الاختيار.تحقق من أن معلمات الجهاز لا تزال تعيينها إلى المخازن المؤقتة مائي. أدخل أنواع لوحات المصدر والوجهة الصحيحة. في علامة التبويب قائمة الانتقاء، انقر فوق إعادة تعيين لمسح قائمة العينات.ثم انقر على الاستيراد واختيار TR_Picklist. CSV ملف. انقر على اللعب.حفظ البروتوكول إذا طلب إجراء محاكاة للبرنامج transfection الاستغناءات الخليط لضمان التصميم السليم من خلال النقر على زر محاكاة. كما فعلت سابقا، بعد النقر على زر تشغيل وبدء برنامج الاستغناء مكان لوحة المصدر ومن ثم لوحة الوجهة في NanoDipsenser كما هو مطلوب. للاستغناء عن الخلايا، وملء وعاء معقمة جديدة مع تعليق الخلية المعدة وتحريكه لتجنب الترسبات مما يؤدي إلى عدم الدقة وكثافة الخلية.أدخل منظم الأنبوب في الحل. ثم، اضغط على زر رئيس الوزراء حتى يبدأ تعليق الخلية في التدفق من رئيس الاستغناء. تأكد من أن الطرف غير مسدود عن طريق فحص بصريا تدفق من رئيس الاستغناء في حين التنظيف وضمان تحميل كل أنبوب مع تعليق الخلية.الآن، تحميل الحمض النووي و TR شغل 384 لوحة الوجهة جيدا على الناقل لوحة معالج السائل الم Peristaltic وإزالة غطاء لها. تشغيل برنامج معايرة مسبقا للاستغناء عن 40 ميكرولترات من تعليق الخلية على لوحة كاملة 384 جيدا. الوقت الاستغناء حوالي 45 ثانية.وأخيرا، استبدال غطاء لوحة 384 جيدا. نقل خلايا HeLa باستخدام كاشف الدهون كان ناجحا. وأظهرت كميات الحمض النووي تتراوح بين خمسة إلى 30 نانوغرام نفس الكفاءة وتصل إلى 90٪ من نقل الخلايا في حجم واحد من المراوحة الدقيقة.وعلى النقيض من ذلك، أدت الكميات الأعلى إلى انخفاض مفاجئ في النسبة المئوية للخلايا المصابة. واختُرِبَت أحجام مختلفة من المُزلَّم تتراوح بين 15 نانويمتراً وأربعة ميكروليتر، وحُدِّد ميكرولتر واحد على أنه أفضل حالة. لزيادة تعزيز إنتاجية هذا البروتوكول تم اختبار أساليب تخزين الحمض النووي الفعالة وهما تخزين الجافة لوحة أو التخزين المجمدة.لم تؤد طرق التخزين إلى نتائج مختلفة بشكل كبير عن محلول الحمض النووي المُوزع حديثًا المخزن لمدة تصل إلى سبعة أيام. كما تستخدم عادة البلازما transfection اثنين على الأقل من البلازميدات المختلفة، تم فحص الحمض النووي متعددة القدرة من هذا البروتوكول باستخدام أفضل الشروط التي تم تحديدها. تم تعديل tdTomato الحمراء المستخدمة سابقا البروتين الفلورسنت التعبير عن plasmid للتعبير عن mVenus مشرق البروتين الفلورسنت الأصفر وكلاهما ثم استخدمت في محاولات cotransfection.وأظهرت الأشعة الحمراء أو الخضراء تحليل الخلايا الإيجابية الفلورسنت كفاءة transfection أن تكون حوالي 80٪ ومع ذلك، ما يقرب من 100٪ من الخلايا الحمراء كانت أيضا cotransed مع mVenus التعبير عن plasmid كما يمكن أن ينظر إليه في تحليل الصور القائم على البرمجيات التمثيلية. مرة واحدة وقد تم الاستغناء DN أن في لوحة المصدر. إجراء مسح للتأكد من أن وحدات التخزين المتوقعة قد تم تحميلها ولا تتجاوز 12 ميكرولترات.في حين الاستغناء عن كاشف transfection في لوحة المصدر، في محاولة لتجنب فقاعات كما سوف يؤدي إلى اللوحات الفرعية الطرد المركزي في فقدان كامل لفعالية transfection. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على التجربة البيولوجية، والجرائم، وtransfection وهي مناسبة في الغالب التي يمكن أن يؤديها في شكل لوحة 384 جيدا. a transfection كامل مضادة يمهد الطريق لتطبيقات جديدة مثل plasmid مقرها المعروفة هش يلقي غير فحص النهج التي تمكن من رصد تأثير متقطعة حاليا غير قادر على أن يتم فرزها في استراتيجيات الفقراء.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

ومنصة الروبوتية لإنتاجية عالية البروتوبلازم عزل والتحول

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

اضطرابات في الدورة الدموية miRNAs في متلازمة القولون العصبي التي تم اكتشافها باستخدام تعدد الإنتاجية العالية منصة التعبير الجيني

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

تغذية حمية الدهون عالية وإنتاجية عالية بالانزيم ترياسيلجليسيريدي في Melanogaster المورفولوجية

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

جيل من الكروماتين الأصلية إيمونوبريسيبيتيشن تسلسل المكتبات لتحليل كثافة نوكليوسومي

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

عزل الحمض النووي قوية وبناء مكتبة التسلسل الفائق للعينات دار النباتات

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

تحديد تركيبات المخدرات التآزر بواسطة الأسلوب2 تداخل الفائق

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

طريقة تعيين النسخة متماثلة: نهج الفائق "قياس كمي" ايليجانس كاينورهابديتيس عمر

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

استخراج الحمض النووي الفائق والتنميط 3dpf الزرد يرقات بالقطع Fin

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

مؤشر تنافسي رقمي قائم على PCR لتحليل عالي الإنتاجية للياقة البدنية في السالمونيلا

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...