Name: high-throughput dna plasmid multiplexing and transfection using acoustic nanodispensing technology
Uploaded: 2019-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology at JoVE.com

De auteurs onthulde een ontvangst van de volgende financiële steun voor het onderzoek, het auteurschap en/of de publicatie van dit artikel: INSERM, Universiteit van Lille, Lille Pasteur Institute, Conseil Régional du Nord, PRIM-HCV1 en 2 (Pôle de recherche Interdisciplinaire sur le Médicament), Agence nationale de la recherche (ANR-10-EQPX-04-01), de Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) en de Europese Gemeenschap (ERC-STG INTRACELLTB n ° 260901). De auteurs willen Dr. S. Moureu, Dr. B. Villemagne, Dr. R. Ferru-Clément en Dr. H. Groult bedanken voor hun kritische beoordeling en correcties van het manuscript.

1. voorbereidingen
<ol><li>Bereiding van de peristaltische vloeistofhandler Programma's Opmerking: voor de stappen van het verdunningsmiddel en de celdosering van het protocol moet een speciaal programma worden opgesteld, rekening houdend met de hoogte van de doseer kop tot de gebruikte plaat en de stap intentie.<ol>
<li>Monteer voor de 1 μL verdunnings vloeistof doseerstap een 1 μL cassette en bereid een programma voor met de instellingen zoals beschreven in de stappen 1.1.1.1 en 1.1.1.2.<ol>
<li...

<ol>
	<li>Colin, B., Deprez, B., Couturier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+DNA+Plasmid+Transfection+Using+Acoustic+Droplet+Ejection+Technology.">High-Throughput DNA Plasmid Transfection Using Acoustic Droplet Ejection Technology.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R &#38; D. , 2472555218803064 (2018).</li><li>Mirus Bio. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optimising Transfection Performance. , (2019).</li><li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Factors Influencing Transfection Efficiency | Thermo Fisher Scientific - FR. , (2019).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).</li><li>Figueroa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanistic+investigation+exploring+the+differential+transfection+efficiencies+between+the+easy-to-transfect+SK-BR3+and+difficult-to-transfect+CT26+cell+lines.">A mechanistic investigation exploring the differential transfection efficiencies between the easy-to-transfect SK-BR3 and difficult-to-transfect CT26 cell lines.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 36 (2017).</li><li>Kirchenbuechler, I., Kirchenbuechler, D., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+cationic+lipid-based+transfection+and+cell+division.">Correlation between cationic lipid-based transfection and cell division.</a> Experimental Cell Research. 345 (1), 1-5 (2016).</li><li>Zhang, Z., Qiu, S., Zhang, X., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+DNA+electroporation+for+primary+human+T+cell+engineering.">Optimized DNA electroporation for primary human T cell engineering.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), 4 (2018).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+activity+and+the+mechanism+of+pDNA-complexes+based+on+the+hybrid+of+low-generation+PAMAM+and+branched+PEI-1.8k.">Transfection activity and the mechanism of pDNA-complexes based on the hybrid of low-generation PAMAM and branched PEI-1.8k.</a> Molecular bioSystems. 9 (12), 3175-3186 (2013).</li><li>Bos, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+semi-automated+high+throughput+transient+transfection+system.">Development of a semi-automated high throughput transient transfection system.</a> Journal of Biotechnology. 180, 10-16 (2014).</li><li>Colosimo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+and+expression+of+foreign+genes+in+mammalian+cells.">Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells.</a> BioTechniques. 29 (2), 314-318 (2000).</li><li>Villa-Diaz, L. G., Garcia-Perez, J. L., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+transfection+efficiency+of+human+embryonic+stem+cells+by+the+incorporation+of+DNA+liposomes+in+extracellular+matrix.">Enhanced transfection efficiency of human embryonic stem cells by the incorporation of DNA liposomes in extracellular matrix.</a> Stem Cells and Development. 19 (12), 1949-1957 (2010).</li><li>Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Reverse transfection method. , WO2001020015A1 (2001).</li><li>Raymond, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+polyethylenimine-mediated+transfection+process+for+large-scale+and+high-throughput+applications.">A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications.</a> Methods (San Diego, CA). 55 (1), 44-51 (2011).</li><li>Junquera, E., Aicart, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+gene+therapy+to+deliver+nucleic+acids+with+multivalent+cationic+vectors.">Recent progress in gene therapy to deliver nucleic acids with multivalent cationic vectors.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 233, 161-175 (2016).</li><li>Woodruff, K., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Microfluidic+Platform+for+Mammalian+Cell+Transfection+and+Culturing.">A High-Throughput Microfluidic Platform for Mammalian Cell Transfection and Culturing.</a> Scientific Reports. 6, 23937 (2016).</li><li>Vasileiou, T., Foresti, D., Bayram, A., Poulikakos, D., Ferrari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+Contactless+Biology:+Acoustophoretic+DNA+Transfection.">Toward Contactless Biology: Acoustophoretic DNA Transfection.</a> Scientific Reports. 6, 20023 (2016).</li><li>Hadimioglu, B., Stearns, R., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+Liquids+with+Sound:+The+Physics+of+Acoustic+Droplet+Ejection+for+Robust+Laboratory+Automation+in+Life+Sciences.">Moving Liquids with Sound: The Physics of Acoustic Droplet Ejection for Robust Laboratory Automation in Life Sciences.</a> Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 4-18 (2016).</li><li>Grant, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+accurate+compound+concentration+in+cell-based+screening:+validation+of+acoustic+droplet+ejection+technology.">Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology.</a> Journal of Biomolecular Screening. 14 (5), 452-459 (2009).</li><li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+That+Enable+Accurate+and+Precise+Nano-+to+Milliliter-Scale+Liquid+Dispensing+of+Aqueous+Reagents+Using+Acoustic+Droplet+Ejection.">Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection.</a> Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 166-177 (2016).</li><li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+protein+palette:+tools+for+cellular+imaging.">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chemical Society Reviews. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li><li>Zielinski, D., Gordon, A., Zaks, B. L., Erlich, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPipet:+sample+handling+using+a+tablet.">iPipet: sample handling using a tablet.</a> Nature Methods. 11 (8), 784-785 (2014).</li><li>Brunner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+dependence+of+gene+transfer+by+lipoplex,+polyplex+and+recombinant+adenovirus.">Cell cycle dependence of gene transfer by lipoplex, polyplex and recombinant adenovirus.</a> Gene Therapy. 7 (5), 401-407 (2000).</li><li>Nii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell-State+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Increases+Transfection+Efficiency.">Single-Cell-State Culture of Human Pluripotent Stem Cells Increases Transfection Efficiency.</a> BioResearch Open Access. 5 (1), 127-136 (2016).</li><li>Noonan, D. J., Henry, K., Twaroski, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Mammalian+Cell-Based+Transient+Transfection+Assay.">A High-Throughput Mammalian Cell-Based Transient Transfection Assay.</a> Signal Transduction Protocols. 284, 051-066 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transfection | TransIT Transfection Reagents | Mirus Bio. , (2015).</li><li>American Type Culture Collection. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> General protocol for transfection of stem cells, primary cells, and continuous cell lines with ATCC TransfeX Transfection Reagent. , (2017).</li><li>American Type Culture Collection. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transfection Reagents for Nucleic Acid Transfer into ATCC Cells. , (2017).</li><li>de Los Milagros Bassani Molinas, M., Beer, C., Hesse, F., Wirth, M., Wagner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+transient+transfection+process+of+HEK-293+suspension+cells+for+protein+production+by+nucleotide+ratio+monitoring.">Optimizing the transient transfection process of HEK-293 suspension cells for protein production by nucleotide ratio monitoring.</a> Cytotechnology. 66 (3), 493-514 (2014).</li><li>Promega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> FuGENE&#174; 6 Transfection Reagent. , (2019).</li><li>Olden, B. R., Cheng, Y., Yu, J. L., Pun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+polymers+for+non-viral+gene+delivery+to+human+T+cells.">Cationic polymers for non-viral gene delivery to human T cells.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 282, 140-147 (2018).</li><li>Park, E., Cho, H. B., Takimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+gene+delivery+into+adipose-derived+stem+cells:+transfection+of+cells+in+suspension+with+the+use+of+a+nuclear+localization+signal+peptide-conjugated+polyethylenimine.">Effective gene delivery into adipose-derived stem cells: transfection of cells in suspension with the use of a nuclear localization signal peptide-conjugated polyethylenimine.</a> Cytotherapy. 17 (5), 536-542 (2015).</li><li>Wood, R. W., Loomis, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+and+biological+effects+of+high-frequency+sound-waves+of+great+intensity.">The physical and biological effects of high-frequency sound-waves of great intensity.</a> The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 4 (22), 417-436 (1927).</li><li>Mamat, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eliminating+Endotoxin+at+the+Source+-+A+Novel+Competent+Cell+Line+with+Modified+Lipopolysaccharide+for+Low-Endotoxin+Plasmid+Production.">Eliminating Endotoxin at the Source - A Novel Competent Cell Line with Modified Lipopolysaccharide for Low-Endotoxin Plasmid Production.</a> , (2014).</li><li>Ivanova, N. V., Kuzmina, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+dry+DNA+storage+and+shipment+at+room+temperature.">Protocols for dry DNA storage and shipment at room temperature.</a> Molecular Ecology Resources. 13 (5), 890-898 (2013).</li><li>Lesnick, J., Lejeune-Dodge, A., Ruppert, N., Jarman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High-Precision Cell Dispensing with the Labcyte Echo&#174; Liquid Handler. , (2017).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+public+genome-scale+lentiviral+expression+library+of+human+ORFs.">A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs.</a> Nature Methods. 8 (8), 659-661 (2011).</li><li>Peng, J., Zhou, Y., Zhu, S., Wei, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screens+in+mammalian+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">High-throughput screens in mammalian cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> The FEBS journal. 282 (11), 2089-2096 (2015).</li></ol>

Het opzetten en optimaliseren van een nauwkeurige hoge doorvoer transfectie methode voor een bepaalde cellijn vereisen wetenschappers om een aantal belangrijke parameters beschreven in deze sectie te volgen. We moedigen ten zeerste aan om te beginnen met de aanbevolen waarden in het Protocol, omdat deze instellingen die zijn geoptimaliseerd voor HeLa-cellen ook efficiënt bleken te zijn voor HEK-cellen. Aangezien de beste parameters echter afhankelijk kunnen zijn van de cellijnen en transfectie reagentia, kunnen optimale...

De hier gepresenteerde methode beschrijft in detail hoe DNA-plasmide multiplexing en transfectie in zoogdiercellen bij hoge doorvoer te voeren met behulp van een akoestische vloeibare nano dispenser in een 384-well plaat, zelfs voor niet-specialisten in het veld. Deze onlangs gepubliceerde methode1 maakt het uitvoeren van zoveel 384 onafhankelijke plasmide DNA multiplexing en transfectie voorwaarden in één experiment, in minder dan 1 h. enkelvoudige of cotransfectie experimenten waren succesvol en bereikten een nabije 100% cotransfectie binnen de populatie van de getransfunteerde cellen. Dit protocol maakt transfectie gemakkelijker omdat de meeste vervelende, tijdrovende en foutgevoelige stappen nu software-gedreven zijn (Zie afbeelding 1 voor een algemeen overzicht). Er zijn verdere inspanningen geleverd om speciale instrumenten te ontwikkelen om het gebruiksgemak te verbeteren en tegelijkertijd menselijke fouten tijdens het algehele proces te voorkomen en om succesvolle Transfectie te bevorderen, zelfs voor niet-specialisten in het veld. Het beschreven protocol bevat een "gebruiksvriendelijk" macro-spreadsheet dat we hebben ontwikkeld om 384 onafhankelijke transfectie condities te beheren met multiplexing mogelijkheden van maximaal vier plasmiden in elke put. De macro genereert automatisch sjablonen van de bron plaat (en) om het verwachte DNA-plasmide volume te laden bij het starten van voorraadoplossingen en de bestanden die nodig zijn om de nanodispenser software te best Epen op het experimentele ontwerp dat is ingevoerd. Omdat het handmatig doseren van DNA in een 384-bron plaat vervelend en foutgevoelig is, ontwikkelden we ook een speciale Tablet-gebaseerde applicatie om de gebruiker te begeleiden tijdens het doseren van de DNA-oplossing volgens de sjabloon.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59570/59570fig1v3.jpg"> Figuur 1: experimentele workflow. Schematische weergave van het optimale geautomatiseerde omgekeerde transfectie protocol met hoge doorvoer (van experimenteel ontwerp tot aangepaste biologische assay). Handmatige stappen worden aangegeven door het hand symbool en de geschatte tijd voor elke stap wordt in een rood vak geschreven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59570/59570fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Veel op cellen gebaseerde experimenten beginnen met plasmide DNA-transfectie, en zelfs als veel speciale reagentia zijn en nog steeds worden ontwikkeld om de transfectie-efficiëntie te verbeteren en/of de procedure te verlichten, moet er nog veel worden gedaan2,3 , 4. DNA plasmide celtransfectie omvat verschillende stappen om een hoog rendement te bereiken, zoals een initiële complexe opname, endosomale ontsnapping en cytoplasmisch transport naar de Nucleus5,6. Naast calcium neerslag of fysische technieken zoals elektroporation of Microinjection met behulp van speciale apparaten7, moderne chemische methoden hebben gericht op het verbeteren van DNA-cel levering terwijl het verlagen van de cel cytoxiciteit8, 9. Het gebruik van lipiden of kationische polymeren die liposomen-achtige complexen vormen en, meer recentelijk, nonliposomale polymere chemie systemen heeft transfectie gemakkelijker en efficiënter gemaakt10. Ondanks deze ontwikkelingen vereist celtransfectie nog steeds dat specifieke vaardigheden nauwkeurig worden uitgevoerd, omdat de meeste van deze fysische of chemische transfectie protocollen wetenschappers verplichten om handmatig elke DNA-transfectie reactie voorwaarde voor te bereiden, dus de doorvoer aantasten. Om dit probleem te omzeilen, zijn reverse transfectie-protocollen ontwikkeld met behulp van chemische transfectie reagentia11,12,13, waardoor de gebruiker meerdere plasmiden op een snellere manier kon testen of combineren. In deze protocollen worden nucleïnezuur complexen met transfectie reagentia gevormd voordat de cellen op de complexen worden zaaien. Deze omgekeerde protocollen worden echter nog steeds beperkt door de manuele behandeling van DNA-oplossingen en door de combinatie van elk van de onafhankelijke voorwaarden. Hoewel het haalbaar is om ze uit te voeren in een 96-goed plaat formaat, zullen de DNA-voorbereiding en-bedeling vervelend zijn en zullen er waarschijnlijk fouten zijn. Wanneer verschillende hoeveelheden van verschillende DNA plasmiden nodig zijn en Multiplexed met elkaar, wordt celtransfectie nog moeilijker te bereiken en meer tijdrovende, en menselijke fouten worden heel onvermijdelijk. Opschalen naar de 384-well plate formaat in een omgekeerde transfectie aanpak, ondanks enkele Multiplexed DNA transfectie omstandigheden, wordt een onmogelijke uitdaging om de volgende redenen. i) de DNA-bedragen, het transfectiereagens of het reactiemengsel dat moet worden beheerd, zijn voor elke put lager dan 1 μL. II) de multiplexing van plasmiden voor 384 onafhankelijke omstandigheden wordt uiterst ingewikkeld. De levering in elk van de 384 Wells is ook III) zeer tijdrovend en IV) foutgevoelig. Inderdaad, het doseren van de juiste oplossing in de verwachte putten is moeilijk te beheren omdat de lage volumes die al zijn gedoseerd geen visuele controle tussen de lege en reeds gevulde putten toestaan. v) ten slotte is er een hoog risico op het drogen van het mengsel door verdamping voordat de cellen worden toegevoegd als gevolg van de tijd die nodig is om de nodige doseerstappen uit te voeren. Samengevat, de beperkende factor voor het instellen van een hoge doorvoer DNA plasmide transfectie-assays lijkt de miniaturisatie van de assay te zijn, wat een laag volume multiplexing en beheer inhoudt dat niet meer handmatig kan worden afgehandeld, maar ook nauwelijks haalbaar is in een betrouwbare manier door klassieke peristatische vloeistof behandellers.
Als een bewijs van moeilijkheden om dergelijke testen te automatiseren en hoge doorvoer te krijgen, zijn er tot nu toe slechts een paar pogingen om Transfectie te automatisering gepubliceerd: a 96-well plate Format met behulp van een commerciële vloeistof handling apparaat en calciumfosfaat neerslag14 en, meer recentelijk, een lipoplex-reagens en een microfluïdische chip die 280 onafhankelijke transfecties mogelijk maakt15 , maar die gespecialiseerde vaardigheden op dit gebied vereisen. Een andere methode, acoustophoresis, die vloeistof levitatie mogelijk maakt en leidt tot vloeiende manipulatie en menging, werd gebruikt om DNA-transfectie uit te voeren in 24-tot 96-well plate formaten16. Hoewel haalbaar, deze aanpak lijdt aan een extreem lage doorvoer als het mengen van cellen met DNA-transfectie mengsel vereist een 60 s incubatie voor elk afzonderlijk punt voor het zaaien. Dit impliceert een duur van minstens 96 min voor een complete 96-well plaat. Bovendien is dit protocol verre van vatbaar voor het publiek van de algemene biologen, omdat dit werk werd gedaan met een in-House ontworpen en gefabriceerd apparaat dat momenteel niet op de markt verkrijgbaar is. Integendeel, in de afgelopen jaren is een eenvoudig te gebruiken software-gestuurde, op akoestiek gebaseerde doseertechnologie ontstaan met nano volume dispenser apparaten. Met behulp van gerichte akoestische energie, kunnen deze apparaten de strak gecontroleerde ejectie van kleine vloeibare volumes van 2,5 nL naar 500 nL van een bron plaat naar een bestemming één17. Deze technologie, genaamd Acoustic druppel uitwerp (ADE), heeft tal van voordelen: het is volledig geautomatiseerd, contactloos, tipless, nauwkeurig, nauwkeurig en zeer reproduceerbaar, en heeft een hoge doorvoer18. Voor het eerst gewijd aan het leveren van Dimethylfumaraat sulfoxide (DMSO) oplossingen, zijn de instellingen verbeterd om water buffers te doseren19. Akoestische nano dispensers lijken dan geschikt voor Reverse Cell transfectie protocols en kunnen de meeste van bovengenoemde handmatige beperkingen omzeilen. Omdat er voorheen geen plasmide transfectie pogingen werden beschreven met behulp van deze technologie, evalueerden we onlangs de geschiktheid van een akoestisch-gebaseerd doseersysteem om omgekeerde celtransfectie uit te voeren.
Door de doorvoer en het gebruiksgemak van de nano dispenser te benutten, hebben we een reverse transfectie-protocol voor HeLa-cellen geoptimaliseerd door verschillende parameters te cross-testen die de DNA-trans fectie op een 384-put, één plaat kunnen beïnvloeden, namelijk de totale DNA-hoeveelheid en Bron-DNA start concentratie, verdunnings vloeistofvolume, transfectie reagens, en aantal verspreidings cellen. Het ontwikkelde protocol omzeilt de hierboven beschreven handmatige beperkingen van celtransfectie en presenteert verschillende voordelen ten opzichte van andere geautomatiseerde transfectie pogingen. Ten eerste wordt het geminiaturiseerd, waardoor kostenbesparend transfectie-reagens kan worden bespaard door DNA-plasmide preparaten en transfectie-reagens op te slaan. Ten tweede, het is veel meer hoge doorvoer en reproduceerbare dan de handmatige Protocol (zelfs voor beginners), als transfectie van een hele 384-goed plaat kan worden bereikt in minder dan 1 h. Tot slot, het is software-gedreven, waardoor de controle van de gedoseerde DNA-hoeveelheid en de multiplexing van verschillende plasmiden. Inderdaad, dankzij de nano dispenser software (tabel van de materialen), kan de gebruiker een studie plan uitwerken om de volumes te controleren die van een gedefinieerde bron goed plaat naar een bestemming worden gedoseerd.
Het protocol dat hier wordt gepresenteerd, is vooral bedoeld voor diegenen die toegang hebben tot een nano dispenser en die transfectie experimenten willen opzetten met een hoge doorvoer, maar ook voor diegenen die hun transfectie parameters voor een bepaald celtype snel willen optimaliseren door Dit protocol toepassen om verschillende parameters bij hoge doorvoer te cross-testen. Inderdaad, we hebben aangetoond dat geoptimaliseerde parameters geïdentificeerd met dit nanoschaal protocol kunnen worden omgezet in grotere schaal en handmatige transfectie experimenten. Ten slotte, aangezien het in dit Protocol gebruikte transfectie reagens DNA of siRNA transfectie toestaat volgens de fabrikant, is het protocol ook van belang voor diegenen die zich richten op het uitvoeren van array benaderingen voor genoverexpressie of knockdown. De bestemmings platen die met DNA zijn gevuld, kunnen tot 7 dagen voor gebruik in een transfectie test worden bewaard zonder verlies van werkzaamheid, wat een ander voordeel is van het volgende protocol voor dit soort toepassingen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1226px;" width="1224">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">384LDV Microplate</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;">LP-0200</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">384-well Microplate &#956;Clear Black</td>
			<td style="width:363px;">Greiner</td>
			<td style="width:202px;">781906</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:363px;">Sigma</td>
			<td style="width:202px;">A9393-5G</td>
			<td style="width:291px;">Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Android Tablet</td>
			<td style="width:363px;">Samsung</td>
			<td style="width:202px;">Galaxy Note 8</td>
			<td style="width:291px;">used to guide the user while the source plate manual dispense</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Aniospray Surf 29</td>
			<td style="width:363px;">Anios</td>
			<td style="width:202px;">2421073</td>
			<td style="width:291px;">disinfectant to clean the MicroFlo head</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Columbus software</td>
			<td style="width:363px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">image analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">10566032</td>
			<td style="width:291px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:371px;">Echo Cherry Pick 1.5.3 software</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Echo550</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">ADE-based dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">16000044</td>
			<td style="width:291px;">to add in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:363px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:202px;">HT501128-4L</td>
			<td style="width:291px;">to fix cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:363px;">ATCC</td>
			<td style="width:202px;">HeLa (ATCC&#174; CCL-2&#8482;)</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">H3570</td>
			<td style="width:291px;">10 mg/mL Solution in Water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">INCell Analyzer 6000</td>
			<td style="width:363px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:202px;">29043323</td>
			<td style="width:291px;">automated laser-based confocal imaging platform</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:371px;">LB medium</td>
			<td style="width:363px;">Thermoischer Scientific 
			LB Broth Base (Lennox L Broth Base)&#174;, powder</td>
			<td style="width:202px;">12780052</td>
			<td style="width:291px;">culture medium for bacteria growth</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Lysis Buffer (A2)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740912.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">MicroFlo 10&#181;L cassette</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7170013</td>
			<td style="width:291px;">to use with the Microflo Dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">MicroFlo 1&#956;L cassette</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7170012</td>
			<td style="width:291px;">to use with the Microflo Dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">MicroFlo Dispenser</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7171000</td>
			<td style="width:291px;">peristaltic pump-based liquid handler device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Microvolume spectrophotometer</td>
			<td style="width:363px;">Denovix</td>
			<td style="width:202px;">DS-11 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:291px;">Measure the DNA concentration of samples</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:371px;">mVenus plasmid</td>
			<td style="width:363px;">mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Neutralization Buffer (A3)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740913.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">NucleoSpin Plasmid kit</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740588.50</td>
			<td style="width:291px;">used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">31985070</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">optional Wash bufferWash Buffer (A4)</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740914.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;">orbital shaker&#160;</td>
			<td style="width:363px;">incubated large capacity shaker</td>
			<td style="width:202px;">444-7084</td>
			<td style="width:291px;">Used to grow bacteria under gentle agitation and 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">15140122</td>
			<td style="width:291px;">10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">10010001</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Plasmid mini-columns</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740499.250</td>
			<td style="width:291px;">Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Resuspension Buffer (A1)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740911.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">RNAse A</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740505</td>
			<td style="width:291px;">Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">tdTomato-N1 plasmid</td>
			<td style="width:363px;">Addgene</td>
			<td style="width:202px;">Plasmid #54642</td>
			<td style="width:291px;">Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">TransIT-X2 Dynamic Delivery System</td>
			<td style="width:363px;">Mirus Bio</td>
			<td style="width:202px;">MIR 6000</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Wash Buffer (AW)</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740916.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">3D printer</td>
			<td style="width:363px;">Creality</td>
			<td style="width:202px;">CR10S</td>
			<td style="width:291px;">used to print the plate adapter</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:371px;">Blender Software&#160;</td>
			<td style="width:363px;">&#160;https://www.blender.org/ 
			Free software under GNU General Public License (GPL).</td>
			<td style="width:202px;">version 2.79b</td>
			<td style="width:291px;">used to design the plate adapter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput dna plasmid multiplexing and transfection using acoustic nanodispensing technology

Celtransfectie, onmisbaar voor veel biologische studies, vereist het beheersen van vele parameters voor een nauwkeurige en succesvolle prestatie. Meestal uitgevoerd bij lage doorvoer, het is bovendien tijdrovend en foutgevoelig, nog meer als multiplexing verschillende plasmiden. We ontwikkelden een eenvoudige, snelle en nauwkeurige methode om celtransfectie uit te voeren in een 384-well plate layout met behulp van Acoustic druppel uitwerp (ADE) technologie. De nano dispenser apparaat gebruikt in deze studie is gebaseerd op deze technologie en maakt nauwkeurige nano volume levering op hoge snelheid van een bron goed plaat naar een bestemming een. Het kan DNA-en transfectie-reagens verdelen en multiplex volgens een vooraf ontworpen spreadsheet. Hier presenteren we een optimaal protocol om op ADE gebaseerde plasmide transfectie met hoge doorvoer uit te voeren, wat het mogelijk maakt om een efficiëntie van maximaal 90% en een bijna 100% cotransfectie in cotransfection experimenten te bereiken. We breiden het initiële werk uit door een gebruiksvriendelijke macro op spreadsheet voor te stellen, die maximaal vier plasmiden/putten kan beheren uit een bibliotheek met maximaal 1.536 verschillende plasmiden en een Tablet-gebaseerde Pipetteer hulplijn toepassing. De macro ontwerpt de noodzakelijke template (s) van de bron plaat (en) en genereert de kant-en-klare bestanden voor de nano dispenser en Tablet-based applicatie. Het transfectie-Protocol van vier stappen omvat i) een verdunningsmiddel dat met een klassieke vloeistofhandler, II) plasmide distributie en multiplexing, III) een transfectie-reagens van de nano dispenser, en IV) celplating op de voorgevulde putten. De beschreven software-gebaseerde controle van ADE plasmide multiplexing en transfectie maakt het zelfs niet-specialisten in het veld mogelijk om een betrouwbare celtransfectie op een snelle en veilige manier uit te voeren. Deze methode maakt snelle identificatie van optimale instellingen voor een bepaald celtype mogelijk en kan worden omgezet naar een hogere schaal en handmatige benaderingen. Het protocol vergemakkelijkt toepassingen, zoals humaan ORFeome eiwit (set van open Lees kaders [Orf's] in een genoom) expressie of CRISPR Cas9 gebaseerde genfunctie validatie, in niet-gepoolde screening strategieën.

fIn order om te bepalen of de ade-technologie kan worden gebruikt voor een geautomatiseerd reverse transfectie-protocol, bewaken we de efficiëntie van de celtransfectie door fluorescentiemicroscopie, met behulp van een rood fluorescerende tdtomato die plasmide uitdrukt. Eerst gericht op het bepalen van de beste transfectie parameters, verschillende verdunnings vloeistofvolumes en totale hoeveelheden DNA werden Kruis getest. Het volume van het verdunningsmiddel werd gebruikt om de DNA-dru...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology at JoVE.com

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

High-throughput DNA plasmide multiplexing en transfectie met behulp van akoestische nano doseertechnologie

Dit protocol beschrijft een hoge doorvoer plasmide transfectie van zoogdiercellen in een 384-goed plaat met behulp van akoestische druppel ejectie technologie. De tijdrovende, foutgevoelige DNA-afgifte en multiplexing, maar ook de transfectie-reagens afgifte, zijn softwaregestuurd en worden uitgevoerd door een nanodispenser apparaat. De cellen worden vervolgens in deze voorgevulde putten gesest.

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

De NanoDispenser gebaseerde transfectie protocol op ontwikkeld om te beschrijven in deze video vertegenwoordigt de eerste gebruiksvriendelijke, high-throughput transfection methode waardoor zelfs beginners in het veld om succesvol te zijn. Dit is gemakkelijk op high-throughput techniek maakt transfectie van de cel met 384 onafhankelijke conditie. Vanaf nu, de methode is lage kosten als gevolg van de nano volume van reagens nodig.Om de beste transfectieparameters voor het hele celtype te definiëren, raden we aan de bron-DNA-concentratie constant te houden en verschillende hoeveelheden transfected DNA, transfectiereagens en het aantal cellen te gebruiken. Voor het afgeven van de 40 microliter celsuspensie, monteer een 10 microliter cassette op de peristaltische vloeistof handler apparaat, en bereiden een geschikt programma. Ten eerste, pas de flow rate parameter aan laag om cellen af te zien met een lage snelheid om te voorkomen dat het bevorderen van potentiële schade aan de cellen door pure stress en hoge impact op de bodem van de putten.Stel vervolgens de dispensatiehoogte aan op 11,43 millimeter. De hoogte moet hoog genoeg zijn om de celimpact op de bodem van de putten tijdens het doseerproces te verlagen, maar laag genoeg om het vasthouden van de druppels op de doseerkop te voorkomen. Stel vervolgens de duidelijke hoogte van de plaat aan op 16 millimeter om vrije verplaatsing van de doseerkop over de plaat mogelijk te maken na het uitdelen van elke rij.Controleer visueel de juiste instellingen van de peristaltische vloeistofgeleider hoofdhoogte. Zorg ervoor dat er tijdens het uitdelen geen druppels op de doseerpunten worden bewaard. Controleer ook of het hoofd hoog genoeg is om verplaatsing van het hoofd na het uitdelen van elke rij mogelijk te maken.Om picklists te genereren om de ADE-dispensatie aan te drijven, werd een gebruiksvriendelijke spreadsheetmacro ontwikkeld om DNA-bedragen te beheren en tot vier plasmiden te mengen in een 384 putplaatformaat. Optimale volumes worden vooraf ingevuld in sommige cellen van de spreadsheet, maar kunnen worden gewijzigd. In de roze velden, de transfectie reagens, of TR mengsel waarde, is ingesteld op 500 nanoliter.De minimale volumewaarde in de bronplaatputten is ingesteld op vier microliters en het maximale volume in de bronplaatputten op 11,25 microliter. Voer 100 nanogram per microliter DNA-startconcentraties in de blauwe velden die overeenkomen met het onderliggende DNA. Voer vervolgens de gewenste DNA-hoeveelheid in de grijze en groene velden die overeenkomen met de 384 putten van de plaat.Voer de hoeveelheden en plasmidnamen in en zorg ervoor dat dezelfde spelling wordt gebruikt als dezelfde plasmide in verschillende putten moet worden doorgetransfecteerd. Klik op picklists genereren om de ingevoerde waarden te verifiëren en corrigeer de op oranje gevulde cellen desgevraagd fouten of volumes die niet door de NanoDispenser kunnen worden verwerkt. Als er geen wordt gedetecteerd, genereert de macro de 384 putdoserende handleiding, het DNA-picklistbestand en het TR-picklistbestand uit gegevens die op de bijbehorende bladen zijn verzameld.Druk de sjabloon af vanaf het bronplaatblad om de te vullen putten te visualiseren voordat u deze uitdeelt. Plasmid namen en minimale vulvolumes worden aangegeven. Transfectie reagens mengsel volumes die zullen worden gevuld in de volgende putten, worden aangegeven als TR en gemarkeerd in het groen.Om de DNA-bronplaat voor te bereiden, verdun de opgeslagen DNA-plasmid tot 100 nanogram per microliter met gedestilleerd water. Kalibreer nu het 384 putrooster naar de plaatafmetingen. Open de 384 Well Pipetting Guide Application op een tablet.Plaats de bronplaats op het raster op het onderste scherm. Klik in het kalibratiemenu linksboven op plus of min om de grootte van het raster en de putten te verbeteren of te verkleinen om de groene putten aan te passen aan de vier hoekputten van de plaat. Monteer met dubbelzijdige tape de 3D-geprinte plaatadapter op het scherm om bewegingen van de bronplaat te voorkomen tijdens het uitdelen.Verplaats indien nodig het gekalibreerde raster met behulp van de rotatiepijlen en omhoog, omlaag, rechts, linkerknoppen om het raster aan te passen aan de plaatpositie. Zodra het rooster en de putmaten goed zijn gekalibreerd en geplaatst, tikt u de vergrendelingskalibratiebox aan. Klik op het bestand en open de 384-Wells-Pipetting-Guide.csv-bestand. Volg de scherminstructies om het aangegeven volume plasmide bij de opgegeven concentratie handmatig af te geven in de wit die goed is gemarkeerd en die overeenkomt met de juiste doelbestemming van de verwachte plaat. Gebruik min of meer pijlen om terug te gaan of verder in het DNA-doseerproces.Stop met het afgeven bij het bereiken van de eerste transfection reagensoplossing om te laden. Zodra de DNA-dispensaties klaar zijn, verwijdert u de bronplaat van de adapter. Als er meerdere bronplaten moeten worden gevuld, plaatst u een nieuwe bronplaat op de adapter en volgt u de doseerinstructies.Centrifugeren de MET DNA gevulde bronplaten om een goede vloeistofniveleer te garanderen en bellen te verwijderen die leiden tot onnauwkeurigheid in de ADE-basisoverdrachten. Voer nu een enquête uit om de handmatig afgegeven volumes te beheren. Voer op de NanoDispenser PC het NanoDispenser-programma uit.Ga naar het diagnosetabblad, vink de bronplaat uitbox aan, laad de bronplaat op de plaathouder en vink aan om de plaat in te voeren. Selecteer desgevraagd 384LDV_AQ_B2 om de NanoDispenser in te stellen op de waterige bufferdisspensatiemodus en druk op OK. Selecteer enquête in het diverse menu. En klik op de lancering.Selecteer de vooraf gevulde putten om te analyseren en klik op de knop Gaan. Controleer of de gemeten volumes overeenkomen met de verwachte en zorg ervoor dat er geen putten zijn geladen met volumes van meer dan 12 microliter. Prime de slang met serum vrij medium door het vullen van een nieuw steriel vat met 10 milliliter voorverwarmd serum vrij medium en onderdompeling van de buis organisator in.Druk ongeveer 10 seconden op de priemknop van de peristaltische vloeistofgeleider. Zorg ervoor dat de tip niet verstopt is door de stroom van de doseerkop visueel te inspecteren. Plaats een steriele 384 put cultuur plaat op de peristaltische vloeistof handler plaat drager, en verwijder het deksel.Voer de pre-gekalibreerde programma om een microliter af te geven in elke put van de 384 put plaat. De doseertijd bedraagt ongeveer acht seconden. Vervang dan het deksel van de 384 putplaat.Voer de picklistsoftware uit om ADE-gedreven DNA-uitdelen in te stellen. Stel de 384 putten afkomstig naar 384LDV. Stel het apparaat in op de waterige bufferdoseringsmodus door 384LDV_AQ_B2 te selecteren.En de soorten bestemmingsplaat Greiner_384PS_781096. Geoptimaliseerde overdrachtdoorvoer ongedaan maken. Selecteer het tabblad Lijst selecteren.Klik op importeren. En selecteer het DNA_Picklist_CSV bestand. Klik vervolgens op afspelen en sla het protocol op.Klik op simuleren om een simulatie van de programmasedaties uit te voeren om ervoor te zorgen dat de picklist overeenkomt met het verwachte experimentele ontwerp. Klik op de run-knop en start het doseerprogramma. Voeg desgevraagd de gevraagde bronplaat in.En dan de bestemmingsplaat in de NanoDispenser. Voor het opzetten van de transfectie reagent dispensatie, werken in een biosafety kabinet te verdunnen lipopolyplex transfectie reagens in serum vrij medium tot een een x laatste concentratie en vortex de buis. Onmiddellijk afzien van de TR mix volgens de vooraf gedefinieerde bronplaat verwaardigd door de macro en met behulp van de pre-gekalibreerde 384 goed pipetting gids applicatie.Na de TR-afgifte voert u een enquête uit om de geladen TR-volumes te controleren zoals eerder gedaan voor het geladen DNA. Selecteer de voorgevulde putten voorgevulde putten om te analyseren. En klik op de go-knop.Controleer of de gemeten volumes overeenkomen met de verwachte volumes. En zorg ervoor dat er geen putten zijn geladen met volumes van meer dan 12 microliter. Voer nu een reset van de DNA picklist uit in de picklist software.Controleer of de apparaatparameters nog steeds zijn ingesteld op waterige buffers. Voer de juiste bron- en doelplaattypen in. Klik op het tabblad keuzelijst op opnieuw instellen om de voorbeeldlijst te wissen.Klik vervolgens op importeren en kies de TR_Picklist. CSV-bestand. Klik op spelen.Sla het protocol op als dit wordt gevraagd en voer een simulatie uit van de transfectiereageagemengselsdosaties van het programma om een goed ontwerp te garanderen door op de knop simuleren te klikken. Zoals eerder gedaan, na het klikken op de run-knop en het starten van het doseerprogramma plaats de bronplaat en vervolgens de bestemmingsplaat in de NanoDipsenser zoals gevraagd. Om de cellen af te geven, vul een nieuw steriel vat met de voorbereide celsuspensie en roer het om sedimentatie te voorkomen die leidt tot onnauwkeurigheid en celdichtheid.Plaats de buisorganisator in de oplossing. Druk vervolgens op de prime-knop totdat de celopening begint te spoelen van de doseerkop. Zorg ervoor dat de tip niet verstopt is door de stroom van de doseerkop visueel te inspecteren tijdens het spoelen en zorg ervoor dat elke buis wordt geladen met celsuspensie.Laad nu het DNA en TR gevuld 384 goed bestemming plaat op de peristaltische vloeistof handler plaat drager en verwijder het deksel. Voer het voorgekalibreerde programma uit om 40 microliter van de celsuspensie af te geven op de volledige 384 putplaat. De doseertijd is ongeveer 45 seconden.Tot slot, vervang het deksel van de 384 put plaat. De transfectie van HeLa cellen met behulp van lipopolyplex reagens was succesvol. DNA-bedragen variërend van vijf tot 30 nanogram toonden dezelfde efficiëntie en tot 90% celtransfectie bij één microliter verdunningsvolume.Hogere bedragen resulteerden daarentegen in een abrupte afname van het percentage transfected cellen. Verschillende verdunningsvolumes variërend van 15 nanoliter tot vier microliter werden getest en één microliter werd geïdentificeerd als de beste conditie. Om de doorvoer van dit protocol verder te verbeteren werden twee efficiënte DNA-opslagmethoden getest, namelijk het droog opslaan van de plaat of bevroren opslag.Beide opslagmethoden leidden niet tot significant andere resultaten dan vers afgegeven DNA-oplossing die tot zeven dagen is opgeslagen. Aangezien plasmatransfectie meestal ten minste twee verschillende plasmiden gebruikt, werd het DNA-multiplexing vermogen van dit protocol onderzocht met behulp van de best geïdentificeerde omstandigheden. De eerder gebruikte tdTomato rode fluorescerende eiwit uitdrukken plasmid werd gewijzigd om mVenus een heldere gele fluorescerende eiwit uit te drukken en beide werden vervolgens gebruikt in cotransfectie pogingen.Rode of groene fluorescerende positieve celanalyse toonde aan dat de transfectie-efficiëntie ongeveer 80% bedroeg, Maar bijna 100% van de rode cellen werden ook gecotransfecteerd met de mVenus die plasmide uitdrukt, zoals te zien is in de representatieve softwaregebaseerde beeldanalyse. Zodra DNAs zijn afgegeven in de bronplaat. Voer een enquête uit om ervoor te zorgen dat de verwachte volumes zijn geladen en niet meer dan 12 microliter.Probeer tijdens het afgeven van het transfectiereagens in de bronplaat bellen te vermijden, omdat het centrifugeren van subplaten zal resulteren in een volledig verlies van transfectiewerkzaamheid. Deze methode kan worden toegepast op biologisch experiment, misdaden en transfectie en is geschikt voor meestal dat kan worden uitgevoerd in een 384 put plaat formaat. Een volledig bewijsdichte transfectie maakt de weg vrij voor nieuwe toepassingen zoals plasmide die bekend staan om scherpere gegoten niet-screeningbenaderingen die het mogelijk maken de monitoring van intermitterende affecten mogelijk te maken die momenteel niet in slechte strategieën kunnen worden gesorteerd.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Een Robotic Platform voor High-throughput protoplastisola- en Transformatie

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Verstoringen van circulerende miRNAs in het prikkelbare darm syndroom gedetecteerd met een multiplexverzending High-throughput genexpressie Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Hoog vet dieet voeding en High Throughput triglyceride test bij Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generatie van inheemse chromatine Immunoprecipitation Sequencing bibliotheken nucleosoom dichtheid p.a.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robuuste DNA isolatie en High-throughput Sequencing bibliotheek bouw voor Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput identificatie van synergetische Drug combinaties door de overlapping2 methode

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

De Replica Set, methode: Een High-throughput benadering van kwantitatief maatregel Caenorhabditis elegans levensduur

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

High-throughput DNA-extractie en de genotypering van 3dpf Zebrafish larven door Fin knippen

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

High-throughput identificatie van regelgevende gensequenties met behulp van Next-generation Sequencing van circulaire chromosoom conformatie Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digitale PCR-gebaseerde competitieve index voor high-throughput analyse van de geschiktheid in salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...