Name: high-throughput dna plasmid multiplexing and transfection using acoustic nanodispensing technology
Uploaded: 2019-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology at JoVE.com

Les auteurs ont révélé un reçu du soutien financier suivant pour la recherche, la paternité et/ou la publication de cet article : Inserm, Université de Lille, Institut Pasteur de Lille, Conseil Régional du Nord, et PRIM-HCV1 et 2 (Pôle de Recherche Interdisciplinaire sur le Médicament), l'Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-EQPX-04-01), le Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) et la Communauté européenne (ERC-STG INTRACELLTB n ' 260901). Les auteurs tiennent à remercier le Dr S. Moureu, le Dr B. Villemagne, le Dr R. Ferru-Clément et le Dr H. Groult pour leur examen critique et les corrections du manuscrit.

1. Préparations préalables
<ol><li>Préparation des programmes de manutention de liquides péristaltiques REMARQUE : Pour les étapes de diluant et de distribution cellulaire du protocole, un programme dédié doit être préparé, en tenant compte de la hauteur de la tête distributrice à la plaque utilisée et de l'intention d'étape.<ol>
<li>Pour l'étape de distribution de diluant de 1 l,l, montez une cassette de 1 L et préparez un programme avec les paramètres décrits dans les étapes 1.1...

<ol>
	<li>Colin, B., Deprez, B., Couturier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+DNA+Plasmid+Transfection+Using+Acoustic+Droplet+Ejection+Technology.">High-Throughput DNA Plasmid Transfection Using Acoustic Droplet Ejection Technology.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R &#38; D. , 2472555218803064 (2018).</li><li>Mirus Bio. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optimising Transfection Performance. , (2019).</li><li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Factors Influencing Transfection Efficiency | Thermo Fisher Scientific - FR. , (2019).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).</li><li>Figueroa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanistic+investigation+exploring+the+differential+transfection+efficiencies+between+the+easy-to-transfect+SK-BR3+and+difficult-to-transfect+CT26+cell+lines.">A mechanistic investigation exploring the differential transfection efficiencies between the easy-to-transfect SK-BR3 and difficult-to-transfect CT26 cell lines.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 36 (2017).</li><li>Kirchenbuechler, I., Kirchenbuechler, D., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+cationic+lipid-based+transfection+and+cell+division.">Correlation between cationic lipid-based transfection and cell division.</a> Experimental Cell Research. 345 (1), 1-5 (2016).</li><li>Zhang, Z., Qiu, S., Zhang, X., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+DNA+electroporation+for+primary+human+T+cell+engineering.">Optimized DNA electroporation for primary human T cell engineering.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), 4 (2018).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+activity+and+the+mechanism+of+pDNA-complexes+based+on+the+hybrid+of+low-generation+PAMAM+and+branched+PEI-1.8k.">Transfection activity and the mechanism of pDNA-complexes based on the hybrid of low-generation PAMAM and branched PEI-1.8k.</a> Molecular bioSystems. 9 (12), 3175-3186 (2013).</li><li>Bos, A. 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J., Henry, K., Twaroski, M. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+and+biological+effects+of+high-frequency+sound-waves+of+great+intensity.">The physical and biological effects of high-frequency sound-waves of great intensity.</a> The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 4 (22), 417-436 (1927).</li><li>Mamat, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eliminating+Endotoxin+at+the+Source+-+A+Novel+Competent+Cell+Line+with+Modified+Lipopolysaccharide+for+Low-Endotoxin+Plasmid+Production.">Eliminating Endotoxin at the Source - A Novel Competent Cell Line with Modified Lipopolysaccharide for Low-Endotoxin Plasmid Production.</a> , (2014).</li><li>Ivanova, N. V., Kuzmina, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+dry+DNA+storage+and+shipment+at+room+temperature.">Protocols for dry DNA storage and shipment at room temperature.</a> Molecular Ecology Resources. 13 (5), 890-898 (2013).</li><li>Lesnick, J., Lejeune-Dodge, A., Ruppert, N., Jarman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High-Precision Cell Dispensing with the Labcyte Echo&#174; Liquid Handler. , (2017).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+public+genome-scale+lentiviral+expression+library+of+human+ORFs.">A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs.</a> Nature Methods. 8 (8), 659-661 (2011).</li><li>Peng, J., Zhou, Y., Zhu, S., Wei, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screens+in+mammalian+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">High-throughput screens in mammalian cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> The FEBS journal. 282 (11), 2089-2096 (2015).</li></ol>

L'établissement et l'optimisation d'une méthode précise de transfection à haut débit pour une lignée cellulaire donnée exigent des scientifiques qu'ils suivent certains paramètres clés décrits dans cette section. Nous encourageons fortement en commençant par les valeurs recommandées tout au long du protocole que ces paramètres optimisés pour les cellules HeLa s'est également avéré efficace pour les cellules HEK. Cependant, comme les meilleurs paramètres peuvent dépendre des lignées cellulaires et des ...

La méthode présentée ici décrit en détail comment effectuer le multiplexage et la transfection du plasmide de l'ADN dans les cellules de mammifères à haut débit à l'aide d'un nanodistributeur liquide à base acoustique dans une plaque de 384 puits, même pour les non-spécialistes dans le domaine. Cette méthode1 récemment publiée permet d'exécuter jusqu'à 384 multiplesx d'ADN plasmide indépendants et des conditions de transfection dans une expérience, en moins de 1 h. Les expériences simples ou de cotransfection ont été couronnées de succès, atteignant près de 100 % cotransfection au sein de la population de cellules transfectées. Ce protocole facilite la transfection parce que la plupart des étapes fastidieuses, longues et sujettes aux erreurs sont maintenant pilotées par logiciel (voir la figure 1 pour un aperçu général). D'autres efforts ont été faits pour développer des outils dédiés pour améliorer la facilité d'utilisation tout en évitant les erreurs humaines au cours du processus global et pour promouvoir la transfection réussie, même pour les non-spécialistes dans le domaine. Le protocole décrit comprend une feuille de calcul macro « conviviale » que nous avons développée afin de gérer 384 conditions de transfection indépendantes avec des possibilités de multiplexage allant jusqu'à quatre plasmides dans chaque puits. La macro génère automatiquement des modèles de la plaque source (s) pour charger le volume plasmide de l'ADN prévu à partir de solutions de stock de départ et les fichiers nécessaires pour conduire le logiciel nanodispenser sur la conception expérimentale qui a été entré. Comme la distribution manuelle de l'ADN dans une plaque source de 384 puits est fastidieuse et sujette aux erreurs, nous avons également développé une application dédiée à la tablette pour guider l'utilisateur tout en distribuant une solution d'ADN selon le modèle.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59570/59570fig1v3.jpg"> Figure 1 : Flux de travail expérimental. Représentation schématique du protocole de transfection inverse automatisé automatisé optimal (de la conception expérimentale à l'analyse biologique personnalisée). Les étapes manuelles sont indiquées par le symbole de la main et le temps approximatif de chaque étape est écrit dans une boîte rouge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59570/59570fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Beaucoup d'expériences cellulaires commencent par la transfection d'ADN plasmique, et même si de nombreux réactifs dédiés ont été et sont encore en cours de développement pour améliorer l'efficacité de la transfection et / ou faciliter la procédure, beaucoup reste à faire2,3 , 4. la transfection de cellules plasmiques d'ADN implique plusieurs étapes pour atteindre l'efficacité élevée, telle qu'une prise complexe initiale, l'évasion endosomal, et le transport cytoplasmique au noyau5,6. En plus de la précipitation de calcium ou des techniques physiques telles que l'électroporation ou la microinjection à l'aide d'appareils dédiés7, les méthodes chimiques modernes se sont concentrées sur l'amélioration de la livraison des cellules d'ADN tout en abaissant la cytoxicité cellulaire8, 9. L'utilisation de lipides ou de polymères cationiques formant des complexes liposome-like et, plus récemment, des systèmes de chimie polymère nonliposomal a rendu la transfection plus facile et plus efficace10. Malgré ces développements, la transfection cellulaire nécessite toujours des compétences spécifiques à effectuer avec précision que la plupart de ces protocoles de transfection physique ou chimique exigent des scientifiques de préparer manuellement chaque condition de réaction de transfection de l'ADN, donc altérer le débit. Pour contourner ce problème, des protocoles de transfection inverse ont été développés à l'aide de réactifs chimiques de transfection11,12,13, permettant à l'utilisateur de tester ou de combiner plusieurs plasmides d'une manière plus rapide. Dans ces protocoles, des complexes d'acide nucléique avec des réactifs de transfection sont formés avant d'ensemencer les cellules sur les complexes. Cependant, ces protocoles inverses sont encore limités par la manipulation manuelle des solutions d'ADN et par la combinaison de chacune des conditions indépendantes. Bien qu'il soit possible de les exécuter dans un format de plaque de 96 puits, la préparation de l'ADN et les dispenses seront fastidieuses, et il y aura probablement des erreurs. Lorsque différentes quantités de plusieurs plasmides d'ADN sont nécessaires et multiplexées les unes avec les autres, la transfection cellulaire devient encore plus difficile à réaliser et plus de temps, et les erreurs humaines deviennent tout à fait inévitables. L'extension jusqu'au format de plaque de 384 puits dans une approche de transfection inverse, en dépit de quelques conditions de transfection multiplexed d'ADN, devient un défi impossible en raison des raisons suivantes. i) Les quantités d'ADN, de réactif de transfection ou de mélange de réaction à gérer sont inférieures à 1 L pour chaque puits. ii) Le multiplexage des plasmides pour 384 conditions indépendantes devient extrêmement compliqué. La livraison dans chacun des 384 puits est également iii) très longue et iv) sujette aux erreurs. En effet, la distribution de la bonne solution dans les puits attendus est difficile à gérer car les faibles volumes déjà distribués ne permettent pas de surveiller visuellement entre les puits vides et déjà remplis. v) Enfin, il y a un risque élevé de séchage du mélange par évaporation avant l'ajout des cellules en raison du temps nécessaire pour effectuer les étapes de distribution nécessaires. En résumé, le facteur limitant pour mettre en place des tests de transfection de plasmide d'ADN à haut débit semble être la miniaturisation de l'analyse, ce qui implique un multiplexage et une gestion à faible volume qui ne peuvent plus être manipulés manuellement, mais qui ne sont pas non plus réalisables dans un manière fiable par les manipulateurs de liquides péristatiques classiques.
Comme preuve de difficulté à automatiser de tels essais et à obtenir un débit élevé, seules quelques tentatives d'automatisation de la transfection ont été publiées jusqu'à présent : un format de plaque de 96 puits à l'aide d'un dispositif commercial de manutention des liquides et des précipitations de phosphate de calcium14. et, plus récemment, un réactif lipoplex, et une puce microfluidique permettant 280 transfections indépendantes15, mais nécessitant des compétences spécialisées dans ce domaine. Une autre méthode, l'acoustophoresis, permettant la lévitation liquide et conduisant à la manipulation et au mélange de fluides, a été employée pour effectuer la transfection d'ADN dans les formats de plaque de 24 à 96 puits16. Bien que faisable, cette approche souffre d'un débit extrêmement faible car le mélange des cellules avec le mélange de transfection d'ADN nécessite une incubation de 60 s pour chaque point avant l'ensemencement. Cela implique une durée d'au moins 96 min pour une plaque complète de 96 puits. En outre, ce protocole est loin d'être favorable à l'audience globale des biologistes puisque ce travail a été fait avec un dispositif interne conçu et fabriqué qui n'est actuellement pas disponible sur le marché. Au contraire, au cours des dernières années, une technologie de distribution acoustique facile à utiliser par logiciel a vu le jour avec des distributeurs de nanovolume. Utilisant l'énergie acoustique focalisée, ces dispositifs permettent l'éjection étroitement contrôlée de petits volumes liquides de 2.5 nL à 500 nL d'une plaque source à une destination17. Cette technologie, appelée éjection acoustique de gouttelettes (ADE), présente de nombreux avantages : elle est entièrement automatisée, sans contact, sans pointe, précise, précise et hautement reproductible, et elle a un débit élevé18. D'abord consacré à la livraison de solutions de sulfoxide de diméthyle (DMSO), les paramètres ont été améliorés pour distribuer des tampons aqueux19. Les nanodistributeurs acoustiques semblent donc adaptés aux protocoles de transfection des cellules inversées et pourraient contourner la plupart des limitations manuelles mentionnées ci-dessus. Comme aucune tentative de transfection plasmique n'a été précédemment décrite à l'aide de cette technologie, nous avons récemment évalué la pertinence d'un système de distribution acoustique pour effectuer la transfection des cellules inversées.
Profitant du débit nanodispenser et de la facilité d'utilisation, nous avons optimisé un protocole de transfection inverse pour les cellules HeLa en testant plusieurs paramètres qui peuvent influencer la transfection de l'ADN sur une plaque unique de 384 puits, à savoir la quantité totale d'ADN et concentration de départ de l'ADN source, volume diluant, réactif de transfection, et nombre de cellules de propagation. Le protocole développé contourne les limites manuelles décrites ci-dessus de la transfection cellulaire et présente plusieurs avantages par rapport à d'autres tentatives de transfection automatisées. Tout d'abord, il est miniaturisé, permettant ainsi un réactif de transfection rentable en économisant les préparations de plasmide d'ADN et le réactif de transfection. Deuxièmement, il est beaucoup plus haut débit et reproductible que le protocole manuel (même pour les débutants), comme la transfection d'une plaque entière de 384 puits peut être atteint en moins de 1 h. Enfin, il est piloté par un logiciel, permettant le contrôle de la quantité d'ADN distribué et le multiplexage de plusieurs plasmides. En effet, grâce au logiciel nanodispenser (Tableaudes Matériaux),l'utilisateur peut élaborer un plan d'étude pour contrôler les volumes à distribuer à partir d'une plaque de puits de source définie à une plaque de destination.
Le protocole présenté ici est principalement destiné à ceux qui ont accès à un nanodispenser et qui souhaitent mettre en place des expériences de transfection à haut débit, mais aussi pour ceux qui veulent optimiser rapidement leurs paramètres de transfection pour un type de cellule donné par l'application de ce protocole pour contre-vérifier plusieurs paramètres à haut débit. En effet, nous avons montré que les paramètres optimisés identifiés avec ce protocole à l'échelle nanométrique peuvent être transposés à des expériences de transfection manuelles et à plus grande échelle. Enfin, comme le réactif de transfection utilisé dans le protocole actuel permet la transfection d'ADN ou de siRNA selon le fabricant, le protocole est également d'intérêt pour ceux qui visent à effectuer des approches de tableau pour la surexpression ou le knockdown de gène. Les plaques de destination préremplies d'ADN peuvent être conservées jusqu'à 7 jours avant utilisation dans un test de transfection sans perte d'efficacité, ce qui est un autre avantage du protocole suivant pour ce type d'application.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1226px;" width="1224">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">384LDV Microplate</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;">LP-0200</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">384-well Microplate &#956;Clear Black</td>
			<td style="width:363px;">Greiner</td>
			<td style="width:202px;">781906</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:363px;">Sigma</td>
			<td style="width:202px;">A9393-5G</td>
			<td style="width:291px;">Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Android Tablet</td>
			<td style="width:363px;">Samsung</td>
			<td style="width:202px;">Galaxy Note 8</td>
			<td style="width:291px;">used to guide the user while the source plate manual dispense</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Aniospray Surf 29</td>
			<td style="width:363px;">Anios</td>
			<td style="width:202px;">2421073</td>
			<td style="width:291px;">disinfectant to clean the MicroFlo head</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Columbus software</td>
			<td style="width:363px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">image analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">10566032</td>
			<td style="width:291px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:371px;">Echo Cherry Pick 1.5.3 software</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Echo550</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">ADE-based dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">16000044</td>
			<td style="width:291px;">to add in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:363px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:202px;">HT501128-4L</td>
			<td style="width:291px;">to fix cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:363px;">ATCC</td>
			<td style="width:202px;">HeLa (ATCC&#174; CCL-2&#8482;)</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">H3570</td>
			<td style="width:291px;">10 mg/mL Solution in Water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">INCell Analyzer 6000</td>
			<td style="width:363px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:202px;">29043323</td>
			<td style="width:291px;">automated laser-based confocal imaging platform</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:371px;">LB medium</td>
			<td style="width:363px;">Thermoischer Scientific 
			LB Broth Base (Lennox L Broth Base)&#174;, powder</td>
			<td style="width:202px;">12780052</td>
			<td style="width:291px;">culture medium for bacteria growth</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Lysis Buffer (A2)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740912.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">MicroFlo 10&#181;L cassette</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7170013</td>
			<td style="width:291px;">to use with the Microflo Dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">MicroFlo 1&#956;L cassette</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7170012</td>
			<td style="width:291px;">to use with the Microflo Dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">MicroFlo Dispenser</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7171000</td>
			<td style="width:291px;">peristaltic pump-based liquid handler device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Microvolume spectrophotometer</td>
			<td style="width:363px;">Denovix</td>
			<td style="width:202px;">DS-11 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:291px;">Measure the DNA concentration of samples</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:371px;">mVenus plasmid</td>
			<td style="width:363px;">mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Neutralization Buffer (A3)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740913.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">NucleoSpin Plasmid kit</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740588.50</td>
			<td style="width:291px;">used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">31985070</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">optional Wash bufferWash Buffer (A4)</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740914.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;">orbital shaker&#160;</td>
			<td style="width:363px;">incubated large capacity shaker</td>
			<td style="width:202px;">444-7084</td>
			<td style="width:291px;">Used to grow bacteria under gentle agitation and 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">15140122</td>
			<td style="width:291px;">10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">10010001</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Plasmid mini-columns</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740499.250</td>
			<td style="width:291px;">Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Resuspension Buffer (A1)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740911.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">RNAse A</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740505</td>
			<td style="width:291px;">Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">tdTomato-N1 plasmid</td>
			<td style="width:363px;">Addgene</td>
			<td style="width:202px;">Plasmid #54642</td>
			<td style="width:291px;">Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">TransIT-X2 Dynamic Delivery System</td>
			<td style="width:363px;">Mirus Bio</td>
			<td style="width:202px;">MIR 6000</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Wash Buffer (AW)</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740916.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">3D printer</td>
			<td style="width:363px;">Creality</td>
			<td style="width:202px;">CR10S</td>
			<td style="width:291px;">used to print the plate adapter</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:371px;">Blender Software&#160;</td>
			<td style="width:363px;">&#160;https://www.blender.org/ 
			Free software under GNU General Public License (GPL).</td>
			<td style="width:202px;">version 2.79b</td>
			<td style="width:291px;">used to design the plate adapter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput dna plasmid multiplexing and transfection using acoustic nanodispensing technology

La transfection cellulaire, indispensable pour de nombreuses études biologiques, nécessite le contrôle de nombreux paramètres pour une réalisation précise et réussie. Le plus souvent effectué à faible débit, il est d'ailleurs long et sujet aux erreurs, d'autant plus lorsque le multiplexage de plusieurs plasmides. Nous avons développé une méthode facile, rapide et précise pour effectuer la transfection cellulaire dans une mise en page de plaque de 384 puits en utilisant la technologie acoustique d'éjection de gouttelettes (ADE). Le dispositif nanodistributeur utilisé dans cette étude est basé sur cette technologie et permet une livraison précise de nanovolume à grande vitesse à partir d'une plaque de puits source à une plaque de destination. Il peut distribuer et multiplex ADN et réactif de transfection selon une feuille de calcul préconçue. Ici, nous présentons un protocole optimal pour effectuer la transfection plasmide à haut débit à base d'ADE qui permet d'atteindre une efficacité allant jusqu'à 90% et une cotransfection de près de 100% dans les expériences de cotransfection. Nous étendons le travail initial en proposant une macro basée sur une feuille de calcul conviviale, capable de gérer jusqu'à quatre plasmides/puits à partir d'une bibliothèque contenant jusqu'à 1 536 plasmides différents, et une application de guide de pipetage à base de tablettes. La macro conçoit le modèle (s) nécessaire de la plaque source et génère les fichiers prêts à l'emploi pour l'application nanodispenser et tablette. Le protocole de transfection en quatre étapes implique i) un diluant se passer d'un manipulateur liquide classique, ii) la distribution plasmide et le multiplexage, iii) un réactif de transfection distribué par le nanodispenser, et iv) le placage cellulaire sur les puits préremplis. Le contrôle logiciel décrit du multiplexage et de la transfection du plasmide ADE permet même aux non-spécialistes sur le terrain d'effectuer une transfection cellulaire fiable d'une manière rapide et sûre. Cette méthode permet d'identifier rapidement les paramètres optimaux pour un type de cellule donné et peut être transposée à des approches manuelles et à échelle supérieure. Le protocole facilite les applications, telles que la protéine ORFeome humaine (ensemble de cadres de lecture ouverts [ORFs] dans un génome) expression ou CRISPR-Cas9-basé validation de la fonction génique, dans les stratégies de dépistage non pooled.

fAfin de déterminer si la technologie ADE pourrait être utilisée pour un protocole automatisé de transfection inverse, nous avons surveillé l'efficacité de la transfection cellulaire par microscopie fluorescence, à l'aide d'un tdTomato fluorescent rouge exprimant plasmide. D'abord visant à déterminer les meilleurs paramètres de transfection, différents volumes de diluants et quantités totales d'ADN ont été testés. Le volume diluant a été utilisé pour permettre aux goutte...

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High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Multiplexage et transfection d'ADN à haut débit à l'aide de la technologie de nanodispensation acoustique

Ce protocole décrit la transfection plasmique à haut débit des cellules de mammifères dans une plaque de 384 puits utilisant la technologie acoustique d'éjection de gouttelettes. La distribution et le multiplexage d'ADN, longs et sujets aux erreurs, mais aussi la distribution de réactifs transfection, sont pilotés par un logiciel et exécutés par un dispositif de nanodistributeur. Les cellules sont ensuite ensecées dans ces puits préremplis.

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Le protocole de transfection basé sur NanoDispenser sur développé pour décrire dans cette vidéo représente la première méthode de transfection conviviale et à haut débit permettant même aux débutants sur le terrain de réussir. Ceci est facile sur la technique à haut débit permet la transfection de la cellule avec 384 état indépendant. À partir de maintenant, la méthode est faible coût en raison du nano volume de reagent nécessaire.Pour définir les meilleurs paramètres de transfection pour tout le type de cellule, nous suggérons de maintenir la concentration d’ADN source constante, et en utilisant des quantités variables d’ADN transfecté, réagent de transfection, et le nombre de cellules. Pour la distribution de la suspension cellulaire de 40 microlitres, montez une cassette de 10 microlitres sur le dispositif peristaltic de gestionnaire liquide, et préparez un programme approprié. Tout d’abord, ajuster le paramètre du débit à faible pour distribuer les cellules à basse vitesse afin d’éviter de favoriser les dommages potentiels aux cellules par le stress et l’impact élevé sur le fond des puits.Ensuite, réglez la hauteur de distribution à 11,43 millimètres. La hauteur doit être suffisamment élevée pour réduire l’impact de la cellule sur le fond des puits pendant le processus de distribution, mais suffisamment basse pour éviter la rétention des gouttelettes sur la tête de distribution. Ensuite, ajustez la hauteur claire de la plaque à 16 millimètres pour permettre le déplacement libre de la tête de distribution au-dessus de la plaque après la distribution de chaque rangée.Contrôlez visuellement les réglages appropriés de la hauteur de la tête du gestionnaire liquide périssaltique. Assurez-vous qu’aucune goutte n’est conservée sur les conseils de distribution pendant la distribution. Vérifiez également que la tête est suffisamment haute pour permettre le déplacement de la tête après la distribution de chaque rangée.Afin de générer des listes de sélection pour conduire la dispensation de l’ADE, une macro de feuille de calcul conviviale a été développée pour gérer les quantités d’ADN et mélanger jusqu’à quatre plasmides dans un format de plaque de puits 384. Les volumes optimaux sont pré-remplis dans certaines cellules de la feuille de calcul, mais peuvent être modifiés. Dans les champs roses, le réaccente de transfection, ou valeur du mélange TR, est fixé à 500 nanolitres.La valeur de volume minimale dans les puits de plaque source est définie à quatre microlitres, et le volume maximal dans les puits de plaque source à 11,25 microlitres. Entrez 100 nanogrammes par ADN microlitre à partir des concentrations dans les champs bleus correspondant à l’ADN sous-jacent. Ensuite, entrez la quantité d’ADN désirée dans les champs gris et verts correspondant aux 384 puits de la plaque.Entrez les quantités et les noms plasmides et assurez-vous que la même orthographe est utilisée si le même plasmide doit être transfecté dans plusieurs puits. Cliquez sur générer des listes de sélection pour vérifier les valeurs saisies et, sur demande, corrigez les cellules remplies d’orange indiquant les erreurs ou les volumes qui ne peuvent pas être manipulés par le NanoDispenser. Si aucun n’est détecté, la macro générera le guide de distribution de puits 384, le fichier de liste de sélection d’ADN, et le fichier de liste de sélection TR à partir des données recueillies sur les feuilles correspondantes.Imprimez le modèle à partir de la feuille de plaque source pour visualiser les puits à remplir avant de le distribuer. Des noms plasmides et des volumes de remplissage minimes sont indiqués. Les volumes de mélange de réaccfection transfection qui seront remplis dans les puits suivants, sont indiqués comme TR et mis en évidence en vert.Pour préparer la plaque source d’ADN, diluer le plasmide d’ADN stocké à 100 nanogrammes par microlitre à l’aide d’eau distillée. Maintenant, calibrer la grille de puits 384 aux dimensions de la plaque. Ouvrez l’application 384 Well Pipetting Guide sur une tablette.Placez la place source sur la grille sur l’écran inférieur. Dans le menu d’étalonnage supérieur gauche, cliquez plus ou moins pour améliorer ou réduire la taille de la grille et des puits afin d’ajuster les puits verts aux quatre puits d’angle de la plaque. À l’aide de ruban adhésif à double face, montez l’adaptateur de plaque imprimé 3D sur l’écran pour éviter les mouvements des plaques sources pendant la distribution.Si nécessaire, déplacez la grille calibrée à l’aide des flèches de rotation et des boutons vers le haut, vers le bas, à droite et à gauche pour ajuster la grille à la position de la plaque. Une fois que la grille et la taille des puits sont correctement calibrées et localisées, cochez la case d’étalonnage de verrouillage. Cliquez sur le fichier et ouvrez le 384-Wells-Pipetting-Guide.fichier csv. Suivez les instructions de l’écran pour distribuer manuellement le volume indiqué de plasmide à la concentration spécifiée dans le puits blanc surligné qui correspond à la destination cible appropriée de la plaque prévue. Utilisez moins ou plus de flèches pour revenir en arrière ou plus loin dans le processus de distribution d’ADN.Arrêtez de distribuer en atteignant la première solution de réaccente de transfection à charger. Une fois les dispensations d’ADN terminées, retirez la plaque source de l’adaptateur. Si plusieurs plaques sources doivent être remplies, placez une nouvelle plaque source sur l’adaptateur et suivez les instructions de distribution.Centrifugeuse les plaques sources remplies d’ADN pour assurer un nivellement adéquat du liquide et éliminer les bulles conduisant à l’inexactitude dans les transferts de base ADE. Maintenant, exécutez une enquête pour contrôler les volumes distribués manuellement. Sur le PC NanoDispenser, exécutez le programme NanoDispenser.Allez à l’onglet de diagnostic, cochez la boîte de réception de la plaque source, chargez la plaque source sur le porte-plaques et cochez pour entrer dans la plaque. Lorsqu’il est invité, sélectionnez 384LDV_AQ_B2 pour définir le NanoDispenser sur le mode de distribution tampon aqueux et appuyez sur OK. Sélectionnez l’enquête dans le menu divers. Et cliquez sur le lancement.Sélectionnez les puits pré-remplis pour analyser et cliquez sur le bouton aller. Vérifiez que les volumes mesurés correspondent aux volumes attendus et assurez-vous qu’aucun puits n’a été chargé avec des volumes de plus de 12 microlitres. Primez le tube avec le milieu libre de sérum en remplissant un nouveau récipient stérile avec 10 millilitres de milieu libre de sérum préchauffé et en vantant l’organisateur de tube dedans.Appuyez sur le bouton principal du gestionnaire liquide périssaltique pendant environ 10 secondes. Assurez-vous que la pointe n’est pas obstruée en inspectant visuellement le débit de la tête de distribution. Placez une plaque stérile 384 bien culture sur le porte-plaques de manutention liquide périssaltique, et retirez son couvercle.Exécutez le programme pré-calibré pour distribuer un microlitre dans chaque puits de la plaque de puits 384. Le temps de distribution est d’environ huit secondes. Remplacez ensuite le couvercle de la plaque de puits 384.Pour configurer la distribution d’ADN pilotée par ADE, exécutez le logiciel picklist. Réglez les 384 puits provenant de 384LDV. Réglez l’appareil en mode de distribution tampon aqueux en sélectionnant 384LDV_AQ_B2.Et les types de plaques de destination à Greiner_384PS_781096. Débit de transfert optimisé non coché. Sélectionnez l’onglet liste de sélection.Cliquez sur l’importation. Et sélectionnez le DNA_Picklist_CSV fichier. Ensuite, cliquez sur jouer et enregistrer le protocole.Cliquez sur simuler pour effectuer une simulation des dispensations du programme pour vous assurer que la liste de sélection correspond à la conception expérimentale attendue. Cliquez sur le bouton exécuter et démarrer le programme de distribution. Lorsqu’on vous le demande, insérez la plaque source demandée.Et puis la plaque de destination dans le NanoDispenser. Pour mettre en place la dispensation de réaccélération transfection, travailler dans un cabinet de biosécurité pour diluer le réagent transfection lipopolyplex dans le sérum moyen libre à une concentration finale d’un x et vortex le tube. Distribuez immédiatement le mélange TR selon la plaque source prédéfinie daignée par la macro et à l’aide de l’application pré-calibrée de guide de pipetage de puits 384.Après la distribution de TR, effectuez un levé pour contrôler les volumes chargés tr comme cela a été fait auparavant pour l’ADN chargé. Sélectionnez le mélange de réaction de transfection précalé des puits à analyser. Et cliquez sur le bouton aller.Vérifiez que les volumes mesurés correspondent aux volumes attendus. Et assurez-vous qu’aucun puits n’a été chargé avec des volumes de plus de 12 microlitres. Effectuez maintenant une réinitialisation de la liste de sélection d’ADN dans le logiciel picklist.Vérifiez que les paramètres de l’appareil sont toujours définis sur des tampons aqueux. Entrez les bons types de plaques de source et de destination. Sur l’onglet liste de sélection, cliquez sur réinitialiser pour effacer la liste d’échantillons.Cliquez ensuite sur l’importation et choisissez le TR_Picklist. Fichier CSV. Cliquez sur jouer.Enregistrez le protocole si cela est demandé et effectuez une simulation des dispensations du mélange de réaccfection transfection du programme afin d’assurer une conception appropriée en cliquant sur le bouton simuler. Comme cela a été fait précédemment, après avoir cliqué sur le bouton d’exécuter et de commencer le programme de distribution placer la plaque source, puis la plaque de destination dans le NanoDipsenser comme demandé. Pour distribuer les cellules, remplissez un nouveau vaisseau stérile avec la suspension cellulaire préparée et remuez-la pour éviter la sédimentation menant à l’inexactitude et à la densité cellulaire.Insérez l’organisateur du tube dans la solution. Ensuite, appuyez sur le bouton principal jusqu’à ce que la suspension cellulaire commence à rincer de la tête de distribution. Assurez-vous que la pointe n’est pas obstruée en inspectant visuellement le débit de la tête de distribution pendant la chasse d’eau et assurez-vous que chaque tube est chargé de suspension cellulaire.Maintenant, chargez l’ADN et tr rempli 384 plaque de destination de puits sur le transporteur peristaltic plaque gestionnaire liquide et enlever son couvercle. Exécutez le programme pré-calibré pour distribuer 40 microlitres de la suspension cellulaire sur la plaque complète de 384 puits. Le temps de distribution est d’environ 45 secondes.Enfin, remplacez le couvercle de la plaque de puits 384. La transfection des cellules d’HeLa utilisant le reagent lipopolyplex a été réussie. Les quantités d’ADN allant de cinq à 30 nanogrammes ont montré la même efficacité et jusqu’à 90% de transfection cellulaire à un volume de diluant microlitre.En revanche, des quantités plus élevées ont entraîné une diminution brutale du pourcentage de cellules transfectées. Divers volumes de diluants allant de 15 nanolitres à quatre microlitres ont été testés et un microlitre a été identifié comme la meilleure condition. Afin d’améliorer davantage le débit de ce protocole, deux méthodes efficaces de stockage de l’ADN ont été testées, à savoir le stockage à sec de la plaque ou l’entreposage congelé.Les deux méthodes de stockage n’ont pas conduit à des résultats significativement différents de la solution d’ADN fraîchement distribuée stockée pendant jusqu’à sept jours. Comme la transfection plasmatique emploie habituellement au moins deux plasmides différents, la capacité de multiplexage d’ADN de ce protocole a été examinée en utilisant les conditions les mieux identifiées. La protéine fluorescente rouge tdTomato précédemment utilisée exprimant le plasmide a été modifiée pour exprimer mVenus une protéine fluorescente jaune vif et les deux ont ensuite été employées dans des tentatives de cotransfection.L’analyse des cellules positives fluorescentes rouges ou vertes a montré que l’efficacité de la transfection était d’environ 80 %Cependant, près de 100 % des globules rouges ont également été cotransfectés, les mVenus exprimant le plasmide comme on peut le voir dans l’analyse représentative de l’image basée sur les logiciels. Une fois que les AD ont été distribués dans la plaque source. Effectuez un sondage pour vous assurer que les volumes prévus ont été chargés et ne dépassent pas 12 microlitres.Tout en distribuant le réaccfection transfection dans la plaque source, essayez d’éviter les bulles car les sous-plaques centrifugeuses entraîneront une perte complète de l’efficacité de la transfection. Cette méthode peut être appliquée à l’expérience biologique, les crimes et la transfection et convient pour la plupart qui peut être effectuée dans un format de plaque de puits 384. Une transfection à toute épreuve ouvre la voie à de nouvelles applications telles que le plasmide basé sur des approches de non-criblage plus nettes permettant de surveiller l’effet intermittent actuellement incapable d’être triés dans des stratégies médiocres.

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The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

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La méthode Set de la réplique : Une approche de haut-débit pour mesurer quantitativement Caenorhabditis elegans durée de vie

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Extraction d’ADN de haut débit et le génotypage des larves de poisson zèbre 3dpf de découpage Fin

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

High-throughput Identification des séquences régulatrices du gène à l’aide de prochaine génération séquençage du Chromosome circulaire Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-through Analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based Competitive Index for High-through Analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based Competitive Index for High-through analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...