Name: high-throughput dna plasmid multiplexing and transfection using acoustic nanodispensing technology
Uploaded: 2019-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology at JoVE.com

Die Autoren gaben die folgende finanzielle Unterstützung für die Recherche, Die Urheberschaft und/oder die Veröffentlichung dieses Artikels bekannt: Inserm, Universität Lille, Lille Pasteur Institute, Conseil Régional du Nord und PRIM-HCV1 und 2 (Péle de Recherche Interdisciplinaire sur le Médicament), Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-EQPX-04-01), feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) und die Europäische Gemeinschaft (ERC-STG INTRACELLTB n° 260901). Die Autoren danken Dr. S. Moureu, Dr. B. Villemagne, Dr. R. Ferru-Clément und Dr. H. Groult für ihre kritische Überprüfung und Korrektur des Manuskripts.

1. Vorarbeiten
<ol><li>Vorbereitung der peristaltischen Flüssigkeitshandlerprogramme HINWEIS: Für die Verdünnungs- und Zelldosierschritte des Protokolls muss ein spezielles Programm vorbereitet werden, das die Höhe des Dosierkopfes an der verwendeten Platte und die Schrittabsicht berücksichtigt.<ol>
<li>Montieren Sie für den Verdünnungsgang 1 l eine 1-L-Kassette und bereiten Sie ein Programm mit den Einstellungen gemäß den Schritten 1.1.1.1 und 1.1.1.2 vor.<ol>
<li>Passen Sie den Durchfluss...

<ol>
	<li>Colin, B., Deprez, B., Couturier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+DNA+Plasmid+Transfection+Using+Acoustic+Droplet+Ejection+Technology.">High-Throughput DNA Plasmid Transfection Using Acoustic Droplet Ejection Technology.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R &#38; D. , 2472555218803064 (2018).</li><li>Mirus Bio. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optimising Transfection Performance. , (2019).</li><li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Factors Influencing Transfection Efficiency | Thermo Fisher Scientific - FR. , (2019).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).</li><li>Figueroa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanistic+investigation+exploring+the+differential+transfection+efficiencies+between+the+easy-to-transfect+SK-BR3+and+difficult-to-transfect+CT26+cell+lines.">A mechanistic investigation exploring the differential transfection efficiencies between the easy-to-transfect SK-BR3 and difficult-to-transfect CT26 cell lines.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 36 (2017).</li><li>Kirchenbuechler, I., Kirchenbuechler, D., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+cationic+lipid-based+transfection+and+cell+division.">Correlation between cationic lipid-based transfection and cell division.</a> Experimental Cell Research. 345 (1), 1-5 (2016).</li><li>Zhang, Z., Qiu, S., Zhang, X., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+DNA+electroporation+for+primary+human+T+cell+engineering.">Optimized DNA electroporation for primary human T cell engineering.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), 4 (2018).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+activity+and+the+mechanism+of+pDNA-complexes+based+on+the+hybrid+of+low-generation+PAMAM+and+branched+PEI-1.8k.">Transfection activity and the mechanism of pDNA-complexes based on the hybrid of low-generation PAMAM and branched PEI-1.8k.</a> Molecular bioSystems. 9 (12), 3175-3186 (2013).</li><li>Bos, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+semi-automated+high+throughput+transient+transfection+system.">Development of a semi-automated high throughput transient transfection system.</a> Journal of Biotechnology. 180, 10-16 (2014).</li><li>Colosimo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+and+expression+of+foreign+genes+in+mammalian+cells.">Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells.</a> BioTechniques. 29 (2), 314-318 (2000).</li><li>Villa-Diaz, L. G., Garcia-Perez, J. L., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+transfection+efficiency+of+human+embryonic+stem+cells+by+the+incorporation+of+DNA+liposomes+in+extracellular+matrix.">Enhanced transfection efficiency of human embryonic stem cells by the incorporation of DNA liposomes in extracellular matrix.</a> Stem Cells and Development. 19 (12), 1949-1957 (2010).</li><li>Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Reverse transfection method. , WO2001020015A1 (2001).</li><li>Raymond, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+polyethylenimine-mediated+transfection+process+for+large-scale+and+high-throughput+applications.">A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications.</a> Methods (San Diego, CA). 55 (1), 44-51 (2011).</li><li>Junquera, E., Aicart, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+gene+therapy+to+deliver+nucleic+acids+with+multivalent+cationic+vectors.">Recent progress in gene therapy to deliver nucleic acids with multivalent cationic vectors.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 233, 161-175 (2016).</li><li>Woodruff, K., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Microfluidic+Platform+for+Mammalian+Cell+Transfection+and+Culturing.">A High-Throughput Microfluidic Platform for Mammalian Cell Transfection and Culturing.</a> Scientific Reports. 6, 23937 (2016).</li><li>Vasileiou, T., Foresti, D., Bayram, A., Poulikakos, D., Ferrari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+Contactless+Biology:+Acoustophoretic+DNA+Transfection.">Toward Contactless Biology: Acoustophoretic DNA Transfection.</a> Scientific Reports. 6, 20023 (2016).</li><li>Hadimioglu, B., Stearns, R., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+Liquids+with+Sound:+The+Physics+of+Acoustic+Droplet+Ejection+for+Robust+Laboratory+Automation+in+Life+Sciences.">Moving Liquids with Sound: The Physics of Acoustic Droplet Ejection for Robust Laboratory Automation in Life Sciences.</a> Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 4-18 (2016).</li><li>Grant, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+accurate+compound+concentration+in+cell-based+screening:+validation+of+acoustic+droplet+ejection+technology.">Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology.</a> Journal of Biomolecular Screening. 14 (5), 452-459 (2009).</li><li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+That+Enable+Accurate+and+Precise+Nano-+to+Milliliter-Scale+Liquid+Dispensing+of+Aqueous+Reagents+Using+Acoustic+Droplet+Ejection.">Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection.</a> Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 166-177 (2016).</li><li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+protein+palette:+tools+for+cellular+imaging.">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chemical Society Reviews. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li><li>Zielinski, D., Gordon, A., Zaks, B. L., Erlich, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPipet:+sample+handling+using+a+tablet.">iPipet: sample handling using a tablet.</a> Nature Methods. 11 (8), 784-785 (2014).</li><li>Brunner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+dependence+of+gene+transfer+by+lipoplex,+polyplex+and+recombinant+adenovirus.">Cell cycle dependence of gene transfer by lipoplex, polyplex and recombinant adenovirus.</a> Gene Therapy. 7 (5), 401-407 (2000).</li><li>Nii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell-State+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Increases+Transfection+Efficiency.">Single-Cell-State Culture of Human Pluripotent Stem Cells Increases Transfection Efficiency.</a> BioResearch Open Access. 5 (1), 127-136 (2016).</li><li>Noonan, D. J., Henry, K., Twaroski, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Mammalian+Cell-Based+Transient+Transfection+Assay.">A High-Throughput Mammalian Cell-Based Transient Transfection Assay.</a> Signal Transduction Protocols. 284, 051-066 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transfection | TransIT Transfection Reagents | Mirus Bio. , (2015).</li><li>American Type Culture Collection. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> General protocol for transfection of stem cells, primary cells, and continuous cell lines with ATCC TransfeX Transfection Reagent. , (2017).</li><li>American Type Culture Collection. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transfection Reagents for Nucleic Acid Transfer into ATCC Cells. , (2017).</li><li>de Los Milagros Bassani Molinas, M., Beer, C., Hesse, F., Wirth, M., Wagner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+transient+transfection+process+of+HEK-293+suspension+cells+for+protein+production+by+nucleotide+ratio+monitoring.">Optimizing the transient transfection process of HEK-293 suspension cells for protein production by nucleotide ratio monitoring.</a> Cytotechnology. 66 (3), 493-514 (2014).</li><li>Promega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> FuGENE&#174; 6 Transfection Reagent. , (2019).</li><li>Olden, B. R., Cheng, Y., Yu, J. L., Pun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+polymers+for+non-viral+gene+delivery+to+human+T+cells.">Cationic polymers for non-viral gene delivery to human T cells.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 282, 140-147 (2018).</li><li>Park, E., Cho, H. B., Takimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+gene+delivery+into+adipose-derived+stem+cells:+transfection+of+cells+in+suspension+with+the+use+of+a+nuclear+localization+signal+peptide-conjugated+polyethylenimine.">Effective gene delivery into adipose-derived stem cells: transfection of cells in suspension with the use of a nuclear localization signal peptide-conjugated polyethylenimine.</a> Cytotherapy. 17 (5), 536-542 (2015).</li><li>Wood, R. W., Loomis, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+and+biological+effects+of+high-frequency+sound-waves+of+great+intensity.">The physical and biological effects of high-frequency sound-waves of great intensity.</a> The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 4 (22), 417-436 (1927).</li><li>Mamat, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eliminating+Endotoxin+at+the+Source+-+A+Novel+Competent+Cell+Line+with+Modified+Lipopolysaccharide+for+Low-Endotoxin+Plasmid+Production.">Eliminating Endotoxin at the Source - A Novel Competent Cell Line with Modified Lipopolysaccharide for Low-Endotoxin Plasmid Production.</a> , (2014).</li><li>Ivanova, N. V., Kuzmina, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+dry+DNA+storage+and+shipment+at+room+temperature.">Protocols for dry DNA storage and shipment at room temperature.</a> Molecular Ecology Resources. 13 (5), 890-898 (2013).</li><li>Lesnick, J., Lejeune-Dodge, A., Ruppert, N., Jarman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High-Precision Cell Dispensing with the Labcyte Echo&#174; Liquid Handler. , (2017).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+public+genome-scale+lentiviral+expression+library+of+human+ORFs.">A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs.</a> Nature Methods. 8 (8), 659-661 (2011).</li><li>Peng, J., Zhou, Y., Zhu, S., Wei, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screens+in+mammalian+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">High-throughput screens in mammalian cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> The FEBS journal. 282 (11), 2089-2096 (2015).</li></ol>

Die Etablierung und Optimierung einer genauen Transfektionsmethode mit hohem Durchsatz für eine bestimmte Zelllinie erfordert, dass die Wissenschaftler einige wichtige Parameter befolgen, die in diesem Abschnitt beschrieben werden. Wir empfehlen dringend, mit den empfohlenen Werten im gesamten Protokoll zu beginnen, da sich diese für HeLa-Zellen optimierten Einstellungen auch für HEK-Zellen als effizient erwiesen haben. Da jedoch die besten Parameter von den Zelllinien und Transfektionsreagenzien abhängen können, k?...

Die hier vorgestellte Methode beschreibt detailliert, wie DNA-Plasmidmultiplexing und -transfektion in Säugetierzellen bei hohem Durchsatz mit einem akustischen flüssigen Nanospender in einer 384-Well-Platte durchgeführt werden kann, selbst für Nicht-Spezialisten auf diesem Gebiet. Diese kürzlich veröffentlichte Methode1 ermöglicht die Durchführung von bis zu 384 unabhängigen Plasmid-DNA-Multiplex- und Transfektionsbedingungen in einem Experiment in weniger als 1 h. Einzel- oder Kotransfektionsexperimente waren erfolgreich und erreichten fast 100 % Kotransfektion innerhalb der Population der transfizierten Zellen. Dieses Protokoll erleichtert die Transfektion, da die meisten mühsamen, zeitaufwändigen und fehleranfälligen Schritte jetzt softwaregesteuert sind (eine allgemeine Übersicht siehe Abbildung 1). Es wurden weitere Anstrengungen unternommen, um spezielle Instrumente zu entwickeln, um die Benutzerfreundlichkeit zu verbessern und menschliche Fehler während des gesamten Prozesses zu vermeiden und eine erfolgreiche Transfektion auch für Nicht-Spezialisten auf diesem Gebiet zu fördern. Das beschriebene Protokoll enthält eine "benutzerfreundliche" Makrotabelle, die wir entwickelt haben, um 384 unabhängige Transfektionsbedingungen mit Multiplexing-Möglichkeiten von bis zu vier Plasmiden in jedem Brunnen zu verwalten. Das Makro generiert automatisch Vorlagen der Quellplatte(n), um das erwartete DNA-Plasmidvolumen vom Start von Bestandslösungen und die Dateien zu laden, die erforderlich sind, um die Nanodispenser-Software nach dem eingegebenen experimentellen Design anzutreiben. Da die manuelle Abgabe von DNA in einer 384-Well-Quellplatte mühsam und fehleranfällig ist, haben wir auch eine spezielle Tablet-basierte Anwendung entwickelt, um den Benutzer zu führen und gleichzeitig dna-Lösung entsprechend der Vorlage zu dosieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59570/59570fig1v3.jpg"> Abbildung 1: Experimenteller Workflow. Schematische Darstellung des optimalen automatisierten Hochdurchsatz-Reverse-Transfektionsprotokolls (vom experimentellen Design bis zum benutzerdefinierten biologischen Assay). Manuelle Schritte werden durch das Handsymbol angezeigt und die ungefähre Zeit für jeden Schritt ist in ein rotes Feld geschrieben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59570/59570fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Viele zellbasierte Experimente beginnen mit der Plasmid-DNA-Transfektion, und selbst wenn viele dedizierte Reagenzien entwickelt wurden und werden, um die Transfektionseffizienz zu verbessern und/oder das Verfahren zu erleichtern, bleibt noch viel zu tun2,3 , 4. DNA-Plasmid-Zell-Transfektion umfasst mehrere Schritte, um eine hohe Effizienz zu erreichen, wie eine anfängliche komplexe Aufnahme, endosomale Flucht und zytoplasmatischen Transport zum Kern5,6. Neben Kalziumfällung oder physikalischen Techniken wie Elektroporation oder Mikroinjektion mit speziellen Geräten7haben sich moderne chemische Methoden auf die Verbesserung der DNA-Zell-Entbindung konzentriert und gleichzeitig die Zellzytoxizitätgesenkt 8, 9. Die Verwendung von Lipiden oder kationischen Polymeren, die liposomeähnliche Komplexe bilden, und in jüngerer Zeit nichtliposomaler polymerer Chemiesysteme hat die Transfektion einfacher und effizienter gemacht10. Trotz dieser Entwicklungen erfordert die Zelltransfektion immer noch spezifische Fähigkeiten, die genau ausgeführt werden müssen, da die meisten dieser physikalischen oder chemischen Transfektionsprotokolle von Wissenschaftlern verlangen, jeden DNA-Transfektionsreaktionszustand manuell vorzubereiten. den Durchsatz zu beeinträchtigen. Um dieses Problem zu umgehen, wurden Reverse-Transfektionsprotokolle mit chemischen Transfektionsreagenzien11,12,13entwickelt, die es dem Anwender ermöglichen, mehrere Plasmide schneller zu testen oder zu kombinieren. In diesen Protokollen werden Nukleinsäurekomplexe mit Transfektionsreagenzien gebildet, bevor die Zellen auf den Komplexen gesät werden. Diese Reverse-Protokolle sind jedoch nach wie vor durch den manuellen Umgang mit DNA-Lösungen und durch die Kombination der einzelnen unabhängigen Bedingungen begrenzt. Obwohl es machbar ist, sie in einem 96-Well-Plattenformat durchzuführen, wird die DNA-Vorbereitung und die Abgabe mühsam sein, und es wird wahrscheinlich Fehler geben. Wenn unterschiedliche Mengen von mehreren DNA-Plasmiden erforderlich und miteinander multiplexiert werden, wird die Zelltransfektion noch schwieriger zu erreichen und zeitaufwändiger, und menschliche Fehler werden unvermeidlich. Die Skalierung auf das 384-Well-Plattenformat in einem umgekehrten Transfektionsansatz wird trotz weniger multiplexierter DNA-Transfektionsbedingungen aus folgenden Gründen zu einer unmöglichen Herausforderung. i) Die zu verwaltenden DNA-Mengen, Transfektionsreagenz oder Reaktionsgemischvolumina sind für jeden Brunnen weniger als 1 L. ii) Das Multiplexing von Plasmiden für 384 unabhängige Erkrankungen wird extrem kompliziert. Die Lieferung in jeder der 384 Brunnen ist auch iii) sehr zeitaufwändig und iv) fehleranfällig. Tatsächlich ist es schwierig, die richtige Lösung in den erwarteten Brunnen zu verteilen, da die bereits ausgegebenen geringen Volumina keine visuelle Überwachung zwischen den leeren und bereits gefüllten Brunnen ermöglichen. v) Schließlich besteht ein hohes Risiko, das Gemisch durch Verdunstung zu trocknen, bevor die Zellen hinzugefügt werden, da die für die Durchführung der erforderlichen Dosierschritte erforderlichen Zeit benötigt wird. Zusammenfassend scheint der begrenzende Faktor für die Einrichtung von DNA-Plasmid-Transfektions-Assays mit hohem Durchsatz die Miniaturisierung des Assays zu sein, was ein Low-Volume-Multiplexing und -Management impliziert, das nicht mehr manuell behandelt werden kann, aber auch in einem zuverlässigen Weg durch klassische peristatische Flüssigkeitshandler.
Als Beweis für die Schwierigkeit, solche Tests zu automatisieren und einen hohen Durchsatz zu erzielen, wurden bisher nur wenige Versuche zur Automatisierung der Transfektion veröffentlicht: ein 96-Well-Plattenformat mit einem kommerziellen Flüssigkeitshandhabungsgerät und Calciumphosphatniederschlag14 und in jüngerer Zeit ein Lipoplex-Reagenz und ein mikrofluidischer Chip, der 280 unabhängige Transfektionen15 ermöglicht, aber spezielle Fähigkeiten in diesem Bereich erfordert. Eine andere Methode, die Acoustophorese, die eine Flüssigkeitsschwebe ermöglicht und zu Flüssigkeitsmanipulation und -mischung führt, wurde verwendet, um DNA-Transfektion in 24- bis 96-Well-Plattenformaten16durchzuführen. Obwohl dieser Ansatz machbar ist, leidet er unter einem extrem niedrigen Durchsatz, da das Mischen von Zellen mit DNA-Transfektionsgemisch eine Inkubation von 60 s für jeden einzelnen Punkt vor der Aussaat erfordert. Dies bedeutet eine Dauer von mindestens 96 min für eine komplette 96-Well-Platte. Darüber hinaus ist dieses Protokoll weit davon entfernt, dem Publikum der Biologen zugänglich zu sein, da diese Arbeit mit einem eigens entwickelten und hergestellten Gerät durchgeführt wurde, das derzeit nicht auf dem Markt erhältlich ist. Im Gegenteil, in den letzten Jahren ist mit Nanovolumen-Dispenser-Geräten eine einfach zu bedienende softwaregesteuerte akustische Dosiertechnologie entstanden. Mit fokussierter akustischer Energie ermöglichen diese Geräte den streng kontrollierten Auswurf kleiner Flüssigkeitsvolumina von 2,5 nL bis 500 nL von einer Quellplatte zu einem Ziel17. Diese Technologie, die als akustischer Tröpfchenauswurf (ADE) bezeichnet wird, hat zahlreiche Vorteile: Sie ist vollautomatisiert, berührungslos, spitzenlos, präzise, präzise und hoch reproduzierbar und hat einen hohen Durchsatzvon 18. Zuerst für die Lieferung von Dimethylsulfoxid (DMSO) Lösungen gewidmet, wurden die Einstellungen verbessert, um wässrige Puffer zu verteilen19. Akustische Nanospender scheinen daher für Reverse-Zell-Transfektionsprotokolle geeignet zu sein und könnten die meisten der oben genannten manuellen Einschränkungen umgehen. Da bisher keine Plasmidtransfektionsversuche mit dieser Technologie beschrieben wurden, haben wir kürzlich die Eignung eines akustischen Dosiersystems für die Durchführung von Reverse-Zell-Transfektionen bewertet.
Unter Ausnutzung des Nanodispensers-Durchsatzes und der Benutzerfreundlichkeit optimierten wir ein Reverse-Transfektionsprotokoll für HeLa-Zellen, indem wir mehrere Parameter kreuztesten, die die DNA-Transfektion auf einer 384-Well-Einzelplatte beeinflussen können, nämlich die gesamte DNA-Menge und Dna-Ausgangskonzentration, Verdünnungsvolumen, Transfektionsreagenz und Anzahl der Streuzellen. Das entwickelte Protokoll umgeht die oben beschriebenen manuellen Einschränkungen der Zelltransfektion und bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen automatisierten Transfektionsversuchen. Erstens wird es miniaturisiert, wodurch ein kostengünstiges Transfektionsreagenz durch Speichern von DNA-Plasmidpräparaten und Transfektionsreagenz ermöglicht wird. Zweitens ist es viel mehr durchsatzfähig und reproduzierbar als das manuelle Protokoll (auch für Anfänger), da die Transfektion einer ganzen 384-Well-Platte in weniger als 1 h erreicht werden kann. Schließlich ist es softwaregesteuert, so dass die Kontrolle der abgegebenen DNA-Menge und die Multiplexing von mehreren Plasmiden. Dank der Nanodispenser-Software (Table of Materials) kann der Anwender einen Studienplan ausarbeiten, um die Volumina zu steuern, die von einer definierten Quellbrunnenplatte zu einem Zielschild abgegeben werden sollen.
Das hier vorgestellte Protokoll richtet sich vor allem an diejenigen, die Zugang zu einem Nanospender haben und Transfektionsexperimente mit hohem Durchsatz einrichten möchten, aber auch für diejenigen, die ihre Transfektionsparameter für einen bestimmten Zelltyp schnell optimieren möchten, Anwendung dieses Protokolls, um mehrere Parameter bei hohem Durchsatz zu kreuztesten. Tatsächlich haben wir gezeigt, dass optimierte Parameter, die mit diesem nanoskaligen Protokoll identifiziert wurden, auf größere und manuelle Transfektionsexperimente übertragen werden können. Da das im vorliegenden Protokoll verwendete Transfektionsreagenz dna- oder siRNA-Transfektion nach Angaben des Herstellers zulässt, ist das Protokoll auch für diejenigen von Interesse, die Array-Ansätze für Genüberexpression oder Knockdown durchführen wollen. Die mit DNA vorgefüllten Zielplatten können bis zu 7 Tage vor der Anwendung in einem Transfektionstest ohne Wirksamkeitsverlust konserviert werden, was ein weiterer Vorteil des folgenden Protokolls für diese Art der Anwendung ist.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1226px;" width="1224">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">384LDV Microplate</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;">LP-0200</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">384-well Microplate &#956;Clear Black</td>
			<td style="width:363px;">Greiner</td>
			<td style="width:202px;">781906</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:363px;">Sigma</td>
			<td style="width:202px;">A9393-5G</td>
			<td style="width:291px;">Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Android Tablet</td>
			<td style="width:363px;">Samsung</td>
			<td style="width:202px;">Galaxy Note 8</td>
			<td style="width:291px;">used to guide the user while the source plate manual dispense</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Aniospray Surf 29</td>
			<td style="width:363px;">Anios</td>
			<td style="width:202px;">2421073</td>
			<td style="width:291px;">disinfectant to clean the MicroFlo head</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Columbus software</td>
			<td style="width:363px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">image analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">10566032</td>
			<td style="width:291px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:371px;">Echo Cherry Pick 1.5.3 software</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Echo550</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">ADE-based dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">16000044</td>
			<td style="width:291px;">to add in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:363px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:202px;">HT501128-4L</td>
			<td style="width:291px;">to fix cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:363px;">ATCC</td>
			<td style="width:202px;">HeLa (ATCC&#174; CCL-2&#8482;)</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">H3570</td>
			<td style="width:291px;">10 mg/mL Solution in Water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">INCell Analyzer 6000</td>
			<td style="width:363px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:202px;">29043323</td>
			<td style="width:291px;">automated laser-based confocal imaging platform</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:371px;">LB medium</td>
			<td style="width:363px;">Thermoischer Scientific 
			LB Broth Base (Lennox L Broth Base)&#174;, powder</td>
			<td style="width:202px;">12780052</td>
			<td style="width:291px;">culture medium for bacteria growth</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Lysis Buffer (A2)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740912.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">MicroFlo 10&#181;L cassette</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7170013</td>
			<td style="width:291px;">to use with the Microflo Dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">MicroFlo 1&#956;L cassette</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7170012</td>
			<td style="width:291px;">to use with the Microflo Dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">MicroFlo Dispenser</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7171000</td>
			<td style="width:291px;">peristaltic pump-based liquid handler device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Microvolume spectrophotometer</td>
			<td style="width:363px;">Denovix</td>
			<td style="width:202px;">DS-11 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:291px;">Measure the DNA concentration of samples</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:371px;">mVenus plasmid</td>
			<td style="width:363px;">mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Neutralization Buffer (A3)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740913.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">NucleoSpin Plasmid kit</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740588.50</td>
			<td style="width:291px;">used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">31985070</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">optional Wash bufferWash Buffer (A4)</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740914.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;">orbital shaker&#160;</td>
			<td style="width:363px;">incubated large capacity shaker</td>
			<td style="width:202px;">444-7084</td>
			<td style="width:291px;">Used to grow bacteria under gentle agitation and 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">15140122</td>
			<td style="width:291px;">10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">10010001</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Plasmid mini-columns</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740499.250</td>
			<td style="width:291px;">Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Resuspension Buffer (A1)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740911.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">RNAse A</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740505</td>
			<td style="width:291px;">Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">tdTomato-N1 plasmid</td>
			<td style="width:363px;">Addgene</td>
			<td style="width:202px;">Plasmid #54642</td>
			<td style="width:291px;">Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">TransIT-X2 Dynamic Delivery System</td>
			<td style="width:363px;">Mirus Bio</td>
			<td style="width:202px;">MIR 6000</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Wash Buffer (AW)</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740916.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">3D printer</td>
			<td style="width:363px;">Creality</td>
			<td style="width:202px;">CR10S</td>
			<td style="width:291px;">used to print the plate adapter</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:371px;">Blender Software&#160;</td>
			<td style="width:363px;">&#160;https://www.blender.org/ 
			Free software under GNU General Public License (GPL).</td>
			<td style="width:202px;">version 2.79b</td>
			<td style="width:291px;">used to design the plate adapter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput dna plasmid multiplexing and transfection using acoustic nanodispensing technology

Die Zelltransfektion, die für viele biologische Studien unverzichtbar ist, erfordert die Kontrolle vieler Parameter für eine genaue und erfolgreiche Leistung. Am häufigsten bei geringem Durchsatz durchgeführt, ist es darüber hinaus zeitaufwändig und fehleranfällig, noch mehr beim Multiplexing mehrerer Plasmide. Wir haben eine einfache, schnelle und genaue Methode entwickelt, um die Zelltransfektion in einem 384-Well-Plattenlayout mit akustischer Droplet-Auswurf-Technologie (ADE) durchzuführen. Das in dieser Studie verwendete Nanodispenser-Gerät basiert auf dieser Technologie und ermöglicht eine präzise Nanovolumenabgabe bei hoher Geschwindigkeit von einer Quellbrunnenplatte zu einem Ziel. Es kann nach einer vorgefertigten Kalkulationstabelle DNA- und Transfektionsreagenz abgeben und multiplexieren. Hier präsentieren wir ein optimales Protokoll zur Durchführung einer ADE-basierten Hochdurchsatz-Plasmidtransfektion, die es ermöglicht, einen Wirkungsgrad von bis zu 90% und eine fast 100% Kotransfektion in Kotransfektionsexperimenten zu erreichen. Wir erweitern die anfängliche Arbeit, indem wir ein benutzerfreundliches, auf Tabellenkalkulationen basierendes Makro vorschlagen, das in der Lage ist, bis zu vier Plasmide/Brunnen aus einer Bibliothek mit bis zu 1.536 verschiedenen Plasmiden und eine Tablett-basierte Pipettieranleitung zu verwalten. Das Makro entwirft die erforderlichen Schablonen der/die Quellplatte(n) und generiert die gebrauchsfertigen Dateien für die Nanospender- und Tablet-basierte Anwendung. Das vierstufige Transfektionsprotokoll beinhaltet i) eine Verdünnungsmittelabgabe mit einem klassischen Flüssigkeitshandler, ii) Plasmidverteilung und Multiplexing, iii) eine transfektionspflichtige Reagenz, die vom Nanospender abgegeben wird, und iv) Zellbeschichtung auf den vorgefüllten Brunnen. Die beschriebene softwarebasierte Steuerung von ADE-Plasmidmultiplexing und -transfektion ermöglicht es auch Nicht-Spezialisten auf dem Gebiet, eine zuverlässige Zelltransfektion schnell und sicher durchzuführen. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Identifizierung optimaler Einstellungen für einen bestimmten Zelltyp und kann auf höherskalige und manuelle Ansätze übertragen werden. Das Protokoll erleichtert Anwendungen, wie z. B. menschliches ORFeome-Protein (Satz offener Leserahmen [ORFs] in einem Genom) oder CRISPR-Cas9-basierte Genfunktionsvalidierung, in nicht gepoolten Screening-Strategien.

fUm festzustellen, ob die ADE-Technologie für ein automatisiertes Reverse-Transfektionsprotokoll verwendet werden könnte, überwachten wir die Effizienz der Zelltransfektion durch Fluoreszenzmikroskopie, indem wir ein rotes fluoreszierendes tdTomato-exzierendes Plasmid verwendeten. Zunächst wurden die besten Transfektionsparameter ermittelt, verschiedene Verdünnungsvolumina und Gesamtmengen an DNA wurden kreuzgetestet. Das Verdünnungsvolumen wurde verwendet, um die nach der Abgabe ve...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology at JoVE.com

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing und Transfektion mit akustischer Nanodispensing-Technologie

Dieses Protokoll beschreibt die Durchsatz-Plasmidtransfektion von Säugetierzellen in einer 384-Well-Platte mit akustischer Tröpfchenauswurftechnologie. Die zeitaufwändige, fehleranfällige DNA-Dosierung und Multiplexing, aber auch die Transfektionsreagenz-Dosierung, sind softwaregesteuert und werden von einem Nanospenderdurchgeführt ausgeführt. Die Zellen werden dann in diesen vorgefüllten Brunnen gesät.

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Das NanoDispenser-basierte Transfektionsprotokoll, das zur Beschreibung in diesem Video entwickelt wurde, stellt die erste benutzerfreundliche, hochdurchsatzübergreifende Methode dar, die es auch Anfängern auf diesem Gebiet ermöglicht, erfolgreich zu sein. Dies ist einfach auf High-Throughput-Technik ermöglicht die Transfektion von Zelle mit 384 unabhängigen Zustand. Ab sofort ist die Methode aufgrund des Nanovolumens des Reagenzes kostengünstig.Um die besten Transfektionsparameter für den gesamten Zelltyp zu definieren, empfehlen wir, die DNA-Konzentration der Quelle konstant zu halten und unterschiedliche Mengen an transfizierter DNA, Transfektionsreagenz und Anzahl der Zellen zu verwenden. Für die Abgabe der 40-Mikroliter-Zellsuspension eine 10-Mikroliter-Kassette auf dem peristaltischen Flüssigkeitshandler-Gerät montieren und ein entsprechendes Programm vorbereiten. Passen Sie zunächst den Durchflussparameter auf niedrig an, um Zellen mit einer niedrigen Geschwindigkeit zu verzichten, um potenzielle Schäden an den Zellen durch schiere Belastung und hohe Auswirkungen auf den Boden der Brunnen zu vermeiden.Passen Sie dann die Dispensationshöhe auf 11,43 Millimeter an. Die Höhe muss hoch genug sein, um den Zelleinfluss auf den Boden der Brunnen während des Dosierprozesses zu senken, aber niedrig genug, um eine Retention der Tröpfchen auf dem Dosierkopf zu vermeiden. Passen Sie als Nächstes die Plattenklarheitauflängchen auf 16 Millimeter an, um eine freie Verschiebung des Dosierkopfes über die Platte nach dem Dosieren jeder Reihe zu ermöglichen.Steuern Sie visuell die richtigen Einstellungen der peristaltischen Flüssigkeitshandler Kopfhöhe. Stellen Sie sicher, dass während der Abgabe keine Tropfen auf den Dosierspitzen zurückgehalten werden. Überprüfen Sie auch, ob der Kopf hoch genug ist, um eine Verschiebung des Kopfes nach dem Dosieren jeder Reihe zu ermöglichen.Um Picklists zu generieren, um die ADE-Dispensation voranzutreiben, wurde ein benutzerfreundliches Tabellenmakro entwickelt, um DNA-Mengen zu verwalten und bis zu vier Plasmide in einem 384-Well-Plattenformat zu mischen. Optimale Volumes werden in einigen Zellen der Kalkulationstabelle vorgefüllt, können jedoch geändert werden. In den rosa Feldern wird das Transfektionsreagenz oder tr-Mischwert auf 500 Nanoliter eingestellt.Der minimale Volumenwert in den Quellplattenbrunnen wird auf vier Mikroliter und das maximale Volumen in den Quellplattenbrunnen auf 11,25 Mikroliter eingestellt. Geben Sie 100 Nanogramm pro Mikroliter DNA-Ausgangskonzentrationen in die blauen Felder ein, die der zugrunde liegenden DNA entsprechen. Geben Sie dann die gewünschte DNA-Menge in die grauen und grünen Felder ein, die den 384 Brunnen der Platte entsprechen.Geben Sie die Mengen und Plasmidnamen ein und stellen Sie sicher, dass die gleiche Schreibweise verwendet wird, wenn dasselbe Plasmid in mehreren Brunnen transfiziert werden muss. Klicken Sie auf Auswahllisten generieren, um die eingegebenen Werte zu überprüfen, und korrigieren Sie auf Wunsch die orange gefüllten Zellen, die Fehler oder Volumes anzeigen, die vom NanoDispenser nicht verarbeitet werden können. Wenn keines erkannt wird, generiert das Makro die 384 Well-Dosieranleitung, die DNA-Auswahllistendatei und die TR-Auswahlliste-Datei aus Daten, die auf den entsprechenden Blättern gesammelt wurden.Drucken Sie die Vorlage aus dem Quellplattenblatt, um die zu füllenden Brunnen vor dem Dosieren zu visualisieren. Plasmidnamen und minimale Füllmengen sind angegeben. Transfektionsreagenz-Mischungsvolumen, die in den folgenden Brunnen gefüllt werden, werden als TR angezeigt und grün hervorgehoben.Um die DNA-Quellenplatte vorzubereiten, verdünnen Sie das gespeicherte DNA-Plasmid mit destilliertem Wasser auf 100 Nanogramm pro Mikroliter. Kalibrieren Sie nun das 384-Well-Raster auf die Plattenabmessungen. Öffnen Sie die 384 Well Pipetting Guide Application auf einem Tablet.Platzieren Sie den Quellplatz auf dem Raster auf dem unteren Bildschirm. Klicken Sie im oberen linken Kalibriermenü auf Plus oder Minus, um die Größe des Gitters und der Brunnen zu verbessern oder zu verkleinern, um die grünen Brunnen an die vier Eckbrunnen der Platte anzupassen. Montieren Sie mit doppelseitigem Klebeband den 3D-gedruckten Plattenadapter auf dem Bildschirm, um Quellplattenbewegungen während der Abgabe zu vermeiden.Verschieben Sie bei Bedarf das kalibrierte Raster mit den Rotationspfeilen und nach oben, unten, rechts, links, um das Raster an die Plattenposition anzupassen. Sobald das Raster und die Brunnengrößen richtig kalibriert und lokalisiert sind, aktivieren Sie das Sperrkalibrierungsfeld. Klicken Sie auf Datei und öffnen Sie den 384-Wells-Pipetting-Guide.csv-Datei. Befolgen Sie die Bildschirmanweisungen, um das angegebene Volumen des Plasmids bei der angegebenen Konzentration manuell in den weiß hervorgehobenen Brunnen zu geben, der dem richtigen Zielder der erwarteten Platte entspricht. Verwenden Sie Minus- oder Pluspfeile, um im DNA-Dosierprozess zurück oder weiter zu gehen.Beenden Sie die Abgabe, wenn Sie die erste transfektionspflichtige Reagenzlösung zum Beladen erreichen. Sobald die DNA-Dosierungen abgeschlossen sind, entfernen Sie die Quellplatte aus dem Adapter. Wenn mehrere Quellplatten gefüllt werden sollen, legen Sie eine neue Quellplatte auf den Adapter und folgen Sie den Dosieranweisungen.Zentrifugieren Sie die DNA-gefüllten Quellenplatten, um eine ordnungsgemäße Flüssigkeitsnivellierung zu gewährleisten und Blasen zu entfernen, die zu Ungenauigkeiten bei den ADE-Basisübertragungen führen. Führen Sie nun eine Umfrage durch, um die manuell ausgegebenen Volumes zu steuern. Führen Sie auf dem NanoDispenser-PC das NanoDispenser-Programm aus.Gehen Sie zur Diagnose-Registerkarte, kreuzen Sie den Ausgangsschild-Ausgang an, laden Sie die Quellplatte auf den Plattenhalter und ticken Sie ein, um die Platte einzugeben. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, wählen Sie 384LDV_AQ_B2, um den NanoDispenser auf den wässrigen Pufferausgabemodus einzustellen, und drücken Sie OK. Wählen Sie Umfrage im Menü "Verschiedenes" aus. Und klicken Sie auf Start.Wählen Sie die vorgefüllten Brunnen aus, um sie zu analysieren, und klicken Sie auf die Schaltfläche "Gehen". Stellen Sie sicher, dass die gemessenen Volumina mit den erwarteten volumen übereinstimmen, und stellen Sie sicher, dass keine Brunnen mit Volumen von mehr als 12 Mikrolitern beladen wurden. Den Schlauch mit serumfreiem Medium grundieren, indem Sie ein neues steriles Gefäß mit 10 Millilitern vorgewärmtem Serum-freien Medium füllen und den Röhrenorganisator darin untertauchen.Drücken Sie die Prime-Taste des peristaltischen Flüssigkeitshandlers für ca. 10 Sekunden. Stellen Sie sicher, dass die Spitze nicht verstopft ist, indem Sie den Fluss vom Dosierkopf visuell überprüfen. Legen Sie eine sterile 384 Brunnenkulturplatte auf den peristaltischen Flüssigkeitshandler-Plattenträger und entfernen Sie ihren Deckel.Führen Sie das vorkalibrierte Programm aus, um in jedem Brunnen der 384-Well-Platte einen Mikroliter auszugeben. Die Dosierzeit beträgt ca. acht Sekunden. Dann den Deckel der 384 WellPlatte austauschen.Um ADE-gesteuerte DNA-Dosierung einzurichten, führen Sie die Picklist-Software aus. Stellen Sie die 384 Brunnen aus der Quelle auf 384LDV. Legen Sie das Gerät auf den wässrigen Pufferdosiermodus fest, indem Sie 384LDV_AQ_B2 auswählen.Und die Zielplattentypen zu Greiner_384PS_781096. Nicht tickoptimierter Übertragungsdurchsatz. Wählen Sie die Registerkarte "Auswahlliste" aus.Klicken Sie auf Import. Wählen Sie die DNA_Picklist_CSV-Datei aus. Klicken Sie dann auf Spielen und speichern Sie das Protokoll.Klicken Sie auf Simulieren, um eine Simulation der Programmdispensationen durchzuführen, um sicherzustellen, dass die Auswahlliste dem erwarteten experimentellen Entwurf entspricht. Klicken Sie auf die Run-Taste und starten Sie das Dosierprogramm. Legen Sie auf Anfrage die gewünschte Quellplatte ein.Und dann die Zielplatte im NanoDispenser. Um die Transfektionsreagenzdispensation einzurichten, arbeiten Sie in einem Biosicherheitsschrank, um lipopolyplextransfektionsreagenz in serumfreiem Medium auf eine ein x endliche Konzentration zu verdünnen und das Rohr zu wirbeln. Geben Sie den TR-Mix sofort entsprechend der vordefinierten Quellplatte, die vom Makro deigned wird, und verwenden Sie die vorkalibrierte 384 Well Pipettierführung.Führen Sie nach der TR-Dosierung eine Umfrage durch, um die TR-geladenen Volumina wie zuvor für die geladene DNA zu steuern. Wählen Sie den zu analysierenden Transfektionsreaktionsmix vorgefüllte Brunnen aus. Und klicken Sie auf den Go-Button.Stellen Sie sicher, dass die gemessenen Volumes mit den erwarteten übereinstimmen. Und stellen Sie sicher, dass keine Brunnen mit Volumen von mehr als 12 Mikrolitern beladen wurden. Führen Sie nun einen Reset der DNA-Auswahlliste in der Auswahllistensoftware durch.Stellen Sie sicher, dass die Geräteparameter weiterhin auf wässrige Puffer festgelegt sind. Geben Sie die richtigen Quell- und Zielplattentypen ein. Klicken Sie auf der Registerkarte "Auswahlliste" auf Zurücksetzen, um die Beispielliste zu löschen.Klicken Sie dann auf Importieren und wählen Sie die TR_Picklist. CSV-Datei. Klicken Sie auf play.Speichern Sie das Protokoll, wenn Sie dazu aufgefordert werden, und führen Sie eine Simulation der Programmtransfektionsreagenz-Mischungsdosierungen durch, um ein korrektes Design zu gewährleisten, indem Sie auf die Schaltfläche "Simulieren" klicken. Wie zuvor, nach dem Klicken auf die Run-Taste und starten des Dosierprogramms platzieren Sie die Quellplatte und dann die Zielplatte in der NanoDipsenser wie gewünscht. Um die Zellen zu verteilen, füllen Sie ein neues steriles Gefäß mit der vorbereiteten Zellsuspension und rühren Sie es, um Sedimentationen zu vermeiden, die zu Ungenauigkeitund Zelldichte führen.Fügen Sie den Rohrorganisator in die Lösung ein. Drücken Sie dann die Prime-Taste, bis die Zellsuspension vom Dosierkopf zu spülen beginnt. Stellen Sie sicher, dass die Spitze nicht verstopft ist, indem Sie den Fluss vom Dosierkopf während der Spülung visuell überprüfen und sicherstellen, dass jedes Rohr mit Zellsuspension beladen ist.Laden Sie nun die DNA und TR gefüllt 384 gut Zielplatte auf die peristaltic Flüssigkeit Handler Plattenträger und entfernen Sie seinen Deckel. Führen Sie das vorkalibrierte Programm aus, um 40 Mikroliter der Zellsuspension auf die komplette 384-Well-Platte zu verteilen. Die Dosierzeit beträgt ca. 45 Sekunden.Schließlich ersetzen Sie den Deckel der 384 Well Platte. Die Transfektion von HeLa-Zellen mit Lipopolyplexer Reagenz war erfolgreich. DNA-Mengen zwischen fünf und 30 Nanogramm zeigten die gleiche Effizienz und bis zu 90% Zelltransfektion bei einem Mikroliter-Verdünnungsvolumen.Im Gegensatz dazu führten höhere Mengen zu einer abrupten Abnahme des Prozentsatzes der transfizierten Zellen. Verschiedene Verdünnungsvolumina von 15 Nanolitern bis zu vier Mikrolitern wurden getestet und ein Mikroliter als bester Zustand identifiziert. Um den Durchsatz dieses Protokolls weiter zu verbessern, wurden zwei effiziente DNA-Speichermethoden getestet, nämlich die Trockenlagerung der Platte oder die tiefgefrorene Lagerung.Beide Speichermethoden führten nicht zu signifikant unterschiedlichen Ergebnissen als frisch dosierte DNA-Lösungen, die bis zu sieben Tage gelagert wurden. Da die Plasmatransfektion in der Regel mindestens zwei verschiedene Plasmide verwendet, wurde die DNA-Multiplexing-Fähigkeit dieses Protokolls unter Verwendung der besten identifizierten Bedingungen untersucht. Das zuvor verwendete tdTomato rote fluoreszierende Protein, das Plasmid exprimiert, wurde modifiziert, um mVenus ein hellgelbes fluoreszierendes Protein auszudrücken, und beide wurden dann bei Kotransfektionsversuchen verwendet.Rote oder grüne fluoreszierende positive Zellanalyse zeigte die Transfektionseffizienz etwa 80%Allerdings wurden fast 100% der roten Zellen auch mit dem mVenus exezierenden Plasmid kotransfiziert, wie in der repräsentativen softwarebasierten Bildanalyse zu sehen ist. Sobald DNAs in der Quellplatte abgegeben wurden. Führen Sie eine Umfrage durch, um sicherzustellen, dass die erwarteten Volumes geladen wurden und 12 Mikroliter nicht überschreiten.Während der Abgabe des Transfektionsreagenzes in der Quellplatte, versuchen Sie, Blasen zu vermeiden, da zentrifugierende Unterplatten zu einem vollständigen Verlust der Transfektion Wirksamkeit führen. Diese Methode kann auf biologische Experimente, Verbrechen und Transfektion angewendet werden und eignet sich für die meisten, die in einem 384 Well-Platten-Format durchgeführt werden können. Eine vollfeste Transfektion ebnet den Weg für neue Anwendungen wie Plasmid, das für knackigere Nicht-Screening-Ansätze bekannt ist und die Überwachung intermittierender Affekte ermöglicht, die derzeit nicht in schlechten Strategien sortiert werden können.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Forschung

Genetik

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Störeinflüsse von Zirkulierende miRNAs in Irritable Bowel Syndrome erkannt einen Multiplexed Hochdurchsatz-Gene Expression-Plattform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Fettreiche Ernährung Fütterung und Hochdurchsatz Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Erzeugung von nativen Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Bibliotheken für Nukleosom Dichteanalyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Hochdurchsatz-Identifizierung von synergistischen Wirkstoffkombinationen durch die Überlappung2 Methode

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Die Replica-Set-Methode: Eine Hochdurchsatz-Ansatz zu quantitativ Messen Caenorhabditis Elegans Lebensdauer

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digitaler PCR-basierter Wettbewerbsindex für High-Throughput-Analyse der Fitness bei Salmonellen

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...