Name: high-throughput dna plasmid multiplexing and transfection using acoustic nanodispensing technology
Uploaded: 2019-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology at JoVE.com

Gli autori hanno rivelato una ricevuta del seguente sostegno finanziario per la ricerca, la paternità e/o la pubblicazione di questo articolo: Inserm, Lille University, Lille Pasteur Institute, Conseil Régional du Nord, e PRIM-HCV1 e 2 (P Interdisciplinaire sur le Médicament), Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-EQPX-04-01), la Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) e la Comunità Europea (ERC-STG INTRACELL nTB 260901). Gli autori desiderano ringraziare il Dr. S. Moureu, il Dr. B. Villemagne, il Dr. R. Ferru-Clément e il Dr. H. Groult per la loro revisione critica e le correzioni del manoscritto.

1. Preparazione anticipata
<ol><li>Preparazione dei programmi di gestione dei liquidi peristaltici NOTA: Per le fasi di diluente e di erogazione cellulare del protocollo, è necessario preparare un programma dedicato, tenendo conto dell'altezza della testa di erogazione alla piastra utilizzata e dell'intento di passo.<ol>
<li>Per il passo di diluente 1 L, montare una cassetta da 1 ll e preparare un programma con le impostazioni come descritto nei passaggi 1.1.1.1 e 1.1.1.2.<ol>
<li>Regolare il param...

<ol>
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L'istituzione e l'ottimizzazione di un accurato metodo di trasflessazione ad alto throughput per una determinata linea cellulare richiedono agli scienziati di seguire alcuni parametri chiave descritti in questa sezione. Incoraggiamo vivamente a partire dai valori raccomandati in tutto il protocollo poiché queste impostazioni ottimizzate per le cellule HeLa si sono dimostrate efficienti anche per le cellule HEK. Tuttavia, poiché i parametri migliori possono dipendere dalle linee cellulari e dai reagenti di trasfezione, ...

Il metodo qui presentato descrive in dettaglio come eseguire il plasmide del DNA e la trasfezione nelle cellule dei mammiferi ad alta produttività utilizzando un nanodispenser liquido a base acustica in una piastra di 384 pozze, anche per i non specialisti del settore. Questo metodopubblicato di recente 1 permette di eseguire fino a 384 condizioni indipendenti di multiplexing e trasfezione del DNA plasmide in un esperimento, in meno di 1 h. Gli esperimenti di cotrafezione o singolo hanno avuto successo, raggiungendo un quasi 100% cotrafezione all'interno della popolazione di cellule trasfette. Questo protocollo semplifica la trasfezione perché la maggior parte dei passaggi noiosi, dispendiosi in termini di tempo e soggetti a errori sono ora guidati dal software (vedere Figura 1 per una panoramica generale). Ulteriori sforzi sono stati fatti per sviluppare strumenti dedicati per migliorare la facilità d'uso evitando gli errori umani durante il processo complessivo e per promuovere la trasfezione di successo anche per i non specialisti nel campo. Il protocollo descritto include un foglio di calcolo macro "user-friendly" che abbiamo sviluppato al fine di gestire 384 condizioni di trasfezione indipendenti con possibilità di multiplexing fino a quattro plasmidi in ogni pozzo. La macro genera automaticamente modelli delle lastre di origine per caricare il volume di plasmid di DNA previsto dall'avvio di soluzioni di stock e i file necessari per guidare il software nanodispenser sul progetto sperimentale che è stato inserito. Poiché l'erogazione manuale del DNA in una piastra sorgente 384-well è noiosa e soggetta a errori, abbiamo anche sviluppato un'applicazione dedicata basata su tablet per guidare l'utente durante l'erogazione della soluzione di DNA secondo il modello.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59570/59570fig1v3.jpg"> Figura 1: flusso di lavoro sperimentale. Rappresentazione schematica del protocollo di trasfezione inversa automatizzato ottimale ad alta velocità effettiva (dalla progettazione sperimentale al test biologico personalizzato). I passaggi manuali sono indicati dal simbolo della mano e il tempo approssimativo per ogni passo è scritto in una casella rossa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59570/59570fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Molti esperimenti basati sulle cellule iniziano con la trasfezione del DNA plasmida, e anche se molti reagenti dedicati sono stati e sono ancora in fase di sviluppo per migliorare l'efficienza della trasfezione e/o facilitare la procedura, molto resta da fare2,3 , 4. La trasfezione cellulare plasmida di DNA prevede diversi passaggi per raggiungere un'elevata efficienza, come un assorbimento complesso iniziale, fuga endosomica e trasporto citoplasmatico al nucleo5,6. Oltre alla precipitazione di calcio o tecniche fisiche come elettroporazione o microiniezione utilizzando dispositivi dedicati7, i moderni metodi chimici si sono concentrati sul miglioramento della somministrazione di cellule del DNA, abbassando la citossicità cellulare8, 9. L'uso di lipidi o polimeri cationici che formano complessi simili a liposomi e, più recentemente, sistemi chimici polimerici non liposomici ha reso la trasfezione più facile e più efficiente10. Nonostante questi sviluppi, la trasfezione cellulare richiede ancora competenze specifiche per essere eseguita con precisione poiché la maggior parte di questi protocolli di trasfezione fisica o chimica richiedono agli scienziati di preparare manualmente ogni condizione di reazione alla trasfezione del DNA, compromissione della velocità effettiva. Per aggirare questo problema, sono stati sviluppati protocolli di trasfezione inversa utilizzando reagenti di trasfezione chimica11,12,13, consentendo all'utente di testare o combinare diversi plasmidi in modo più veloce. In questi protocolli, si formano complessi di acido nucleico con reagenti di trasfezione prima di seminare le cellule sui complessi. Tuttavia, questi protocolli inversi sono ancora limitati dalla gestione manuale delle soluzioni del DNA e dalla combinazione di ciascuna delle condizioni indipendenti. Anche se è possibile eseguirli in un formato di piastra 96-well, la preparazione del DNA e dispensa sarà noioso, e probabilmente ci saranno errori. Quando sono necessarie e multiplexed con l'altro diverse quantità di diversi plasmidi di DNA, la trasfezione cellulare diventa ancora più difficile da raggiungere e gli errori umani diventano abbastanza inevitabili. Scalare fino al formato a 384 pozze in un approccio di trasfezione inverso, nonostante poche condizioni di trasfezione del DNA multiplexed, diventa una sfida impossibile a causa dei seguenti motivi. i) I volumi di DNA, reagente di trasfezione o miscela di reazione da gestire sono inferiori a 1 -L per ogni pozzo. ii) Il multiplexing di plasmidi per 384 condizioni indipendenti diventa estremamente complicato. La consegna in ciascuno dei 384 pozzi è anche iii) molto dispendioso in termini di tempo e iv) soggetto a errori. Infatti, erogare la soluzione giusta nei pozzi attesi è difficile da gestire perché i bassi volumi già erogati non consentono il monitoraggio visivo tra i pozzi vuoti e quelli già riempiti. v) Infine, c'è un alto rischio di essiccazione della miscela per evaporazione prima che le cellule vengano aggiunte a causa del tempo necessario per eseguire le fasi di erogazione necessarie. In sintesi, il fattore limitante per impostare analisi di trasfezione del DNA ad alto consumo sembra essere la miniaturizzazione dell'analisi, che implica multiplexing e gestione a basso volume che non possono più essere gestiti manualmente, ma sono anche difficilmente raggiungibili in un affidabile dai classici gestori di liquidi peristatici.
Come prova di difficoltà per automatizzare tali saggi e ottenere un alto rendimento, solo pochi tentativi di automatizzare la trasfezione sono stati pubblicati finora: un formato di piastra di 96 pozzetti che utilizza un dispositivo di movimentazione dei liquidi commerciali e precipitazioni di fosfato di calcio14 e, più recentemente, un reagente lipoplex e un chip microfluidico che consentono 280 trasfettazioni indipendenti15 ma richiedono competenze specializzate in questo campo. Un altro metodo, l'acoustoforesi, che consente la levitazione liquida e porta alla manipolazione e miscelazione dei fluidi, è stato utilizzato per eseguire la trasfezione del DNA nei formati da 24 a 96 pozzi16. Anche se fattibile, questo approccio soffre di una produttività estremamente bassa in quanto la miscela di cellule con miscela di trasfezione del DNA richiede un'incubazione di 60 s per ogni singolo punto prima della semina. Ciò implica una durata di almeno 96 min per una piastra completa di 96 pozze. Inoltre, questo protocollo è ben lungi dall'essere suscettibile al pubblico generale dei biologi in quanto questo lavoro è stato fatto con un dispositivo progettato e fabbricato in-house che attualmente non è disponibile sul mercato. Al contrario, negli ultimi anni, è emersa una tecnologia di erogazione basata sull'acustica basata su software di facile utilizzo con dispositivi di dispenser nanovolume. Utilizzando energia acustica focalizzata, questi dispositivi consentono l'espulsione strettamente controllata di piccoli volumi di liquidi da 2,5 nL a 500 nL da una piastra di origine a una destinazione17. Questa tecnologia, chiamata espulsione acustica delle goccioline (ADE), presenta numerosi vantaggi: è completamente automatizzata, senza contatto, senza punta, precisa e altamente riproducibile, e ha un alto throughput18. In primo luogo dedicato alla fornitura di soluzioni di zolfo dimetilico (DMSO), le impostazioni sono state migliorate per erogare tamponi acquosi19. I nanodispenser acustici, quindi, sembrano adatti per i protocolli di trasfezione inversa delle cellule e potrebbero aggirare la maggior parte delle limitazioni manuali di cui sopra. Poiché in precedenza non sono stati descritti tentativi di trasfezione plasmida utilizzando questa tecnologia, abbiamo recentemente valutato l'idoneità di un sistema di erogazione basato su acustica per eseguire la trasfezione inversa delle celle.
Approfittando della velocità effettiva dei nanodispenser e della facilità d'uso, abbiamo ottimizzato un protocollo di trasfezione inversa per le cellule HeLa verificando diversi parametri che possono influenzare la trafezione del DNA su una piastra singola di 384 pozzetto, vale a dire la quantità totale di DNA e concentrazione iniziale del DNA sorgente, volume diluente, reagente di trasfezione e numero di cellule di diffusione. Il protocollo sviluppato aggira i limiti manuali sopra descritti della trasfezione cellulare e presenta diversi vantaggi rispetto ad altri tentativi di trasfezione automatizzati. In primo luogo, è miniaturizzato, consentendo così un reagente di trasfezione conveniente salvando i preparati del plasmide del DNA e il reagente di trasfezione. In secondo luogo, è molto più ad alto rendimento e riproducibile rispetto al protocollo manuale (anche per i principianti), in quanto la trasfezione di un'intera piastra di 384 pozzetto può essere ottenuta in meno di 1 h. Infine, è basato sul software, consentendo il controllo della quantità di DNA erogato e il multiplexing di diversi plasmidi. Infatti, grazie al software nanodispenser (Tabella dei materiali), l'utente può elaborare un piano di studio per controllare i volumi da erogare da una piastra di origine definita a una di destinazione.
Il protocollo qui presentato è destinato principalmente a coloro che hanno accesso a un nanodispenser e vorrebbero impostare esperimenti di trasfezione ad alta produttività, ma anche per coloro che vogliono ottimizzare rapidamente i loro parametri di trasfezione per un determinato tipo di cellula l'applicazione di questo protocollo per eseguire il cross-test di diversi parametri a velocità effettiva elevata. In effetti, abbiamo dimostrato che i parametri ottimizzati identificati con questo protocollo su nanoscala possono essere trasposti in esperimenti di trasfezione su larga scala e manuali. Infine, poiché il reagente di trasfezione utilizzato nel presente protocollo consente la trasfezione del DNA o del siRNA secondo il produttore, il protocollo è anche di interesse per coloro che mirano a eseguire approcci di array per la sovraespressione genica o il knockdown. Le piastre di destinazione precompilate con DNA possono essere conservate fino a 7 giorni prima dell'uso in un saggio di trasfezione senza perdita di efficacia, che è un altro vantaggio del seguente protocollo per questo tipo di applicazione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1226px;" width="1224">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">384LDV Microplate</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;">LP-0200</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">384-well Microplate &#956;Clear Black</td>
			<td style="width:363px;">Greiner</td>
			<td style="width:202px;">781906</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:363px;">Sigma</td>
			<td style="width:202px;">A9393-5G</td>
			<td style="width:291px;">Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Android Tablet</td>
			<td style="width:363px;">Samsung</td>
			<td style="width:202px;">Galaxy Note 8</td>
			<td style="width:291px;">used to guide the user while the source plate manual dispense</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Aniospray Surf 29</td>
			<td style="width:363px;">Anios</td>
			<td style="width:202px;">2421073</td>
			<td style="width:291px;">disinfectant to clean the MicroFlo head</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Columbus software</td>
			<td style="width:363px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">image analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">10566032</td>
			<td style="width:291px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:371px;">Echo Cherry Pick 1.5.3 software</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Echo550</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">ADE-based dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">16000044</td>
			<td style="width:291px;">to add in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:363px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:202px;">HT501128-4L</td>
			<td style="width:291px;">to fix cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:363px;">ATCC</td>
			<td style="width:202px;">HeLa (ATCC&#174; CCL-2&#8482;)</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">H3570</td>
			<td style="width:291px;">10 mg/mL Solution in Water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">INCell Analyzer 6000</td>
			<td style="width:363px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:202px;">29043323</td>
			<td style="width:291px;">automated laser-based confocal imaging platform</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:371px;">LB medium</td>
			<td style="width:363px;">Thermoischer Scientific 
			LB Broth Base (Lennox L Broth Base)&#174;, powder</td>
			<td style="width:202px;">12780052</td>
			<td style="width:291px;">culture medium for bacteria growth</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Lysis Buffer (A2)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740912.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">MicroFlo 10&#181;L cassette</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7170013</td>
			<td style="width:291px;">to use with the Microflo Dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">MicroFlo 1&#956;L cassette</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7170012</td>
			<td style="width:291px;">to use with the Microflo Dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">MicroFlo Dispenser</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7171000</td>
			<td style="width:291px;">peristaltic pump-based liquid handler device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Microvolume spectrophotometer</td>
			<td style="width:363px;">Denovix</td>
			<td style="width:202px;">DS-11 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:291px;">Measure the DNA concentration of samples</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:371px;">mVenus plasmid</td>
			<td style="width:363px;">mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Neutralization Buffer (A3)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740913.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">NucleoSpin Plasmid kit</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740588.50</td>
			<td style="width:291px;">used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">31985070</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">optional Wash bufferWash Buffer (A4)</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740914.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;">orbital shaker&#160;</td>
			<td style="width:363px;">incubated large capacity shaker</td>
			<td style="width:202px;">444-7084</td>
			<td style="width:291px;">Used to grow bacteria under gentle agitation and 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">15140122</td>
			<td style="width:291px;">10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">10010001</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Plasmid mini-columns</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740499.250</td>
			<td style="width:291px;">Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Resuspension Buffer (A1)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740911.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">RNAse A</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740505</td>
			<td style="width:291px;">Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">tdTomato-N1 plasmid</td>
			<td style="width:363px;">Addgene</td>
			<td style="width:202px;">Plasmid #54642</td>
			<td style="width:291px;">Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">TransIT-X2 Dynamic Delivery System</td>
			<td style="width:363px;">Mirus Bio</td>
			<td style="width:202px;">MIR 6000</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Wash Buffer (AW)</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740916.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">3D printer</td>
			<td style="width:363px;">Creality</td>
			<td style="width:202px;">CR10S</td>
			<td style="width:291px;">used to print the plate adapter</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:371px;">Blender Software&#160;</td>
			<td style="width:363px;">&#160;https://www.blender.org/ 
			Free software under GNU General Public License (GPL).</td>
			<td style="width:202px;">version 2.79b</td>
			<td style="width:291px;">used to design the plate adapter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput dna plasmid multiplexing and transfection using acoustic nanodispensing technology

La trasfezione cellulare, indispensabile per molti studi biologici, richiede il controllo di molti parametri per un risultato accurato e di successo. Il più delle volte eseguita a bassa velocità effettiva, è inoltre dispendiosa in termini di tempo e soggetto a errori, ancora di più quando si multiplano diversi plasmidi. Abbiamo sviluppato un metodo semplice, veloce e preciso per eseguire la trasfezione cellulare in un layout a piastre a 384 pozze utilizzando la tecnologia di espulsione acustica delle goccioline (ADE). Il dispositivo nanodispenser utilizzato in questo studio si basa su questa tecnologia e consente la consegna precisa di nanovolume ad alta velocità da una piastra di pozzo di origine a una di destinazione. Può erogare e multispensare il DNA e il reagente di trasfezione secondo un foglio di calcolo pre-progettato. Qui presentiamo un protocollo ottimale per eseguire la trasfezione ad alta velocità basata su ADE che consente di raggiungere un'efficienza fino al 90% e una cotransfezione quasi al 100% negli esperimenti di cotransfezione. Estendiamo il lavoro iniziale proponendo una macro basata su fogli di calcolo user-friendly, in grado di gestire fino a quattro plasmidi/pozzi da una libreria contenente fino a 1.536 diversi plasmidi e un'applicazione di guida al pipettaggio basata su tablet. La macro progetta i modelli necessari delle lastre di origine e genera i file pronti all'uso per il nanodispenser e l'applicazione basata su tablet. Il protocollo di trasfezione a quattro fasi coinvolge i) un dispense diluente con un gestore di liquidi classico, ii) distribuzione del plasmide e multiplexing, iii) un reagente di trasfezione erosi dal nanodispense, e iv) placcatura cellulare sui pozzi precompilati. Il controllo basato su software descritto di ADE plasmide multiplexing e trasfezione consente anche ai non specialisti del settore di eseguire una trasfezione cellulare affidabile in modo rapido e sicuro. Questo metodo consente di ottenere rapidamente l'identificazione delle impostazioni ottimali per un determinato tipo di cellula e può essere trasposto in approcci manuali e su scala più elevata. Il protocollo facilita le applicazioni, come la proteina UMANA ORFeome (insieme di frame di lettura aperti [ORF] in un genoma) espressione o la convalida della funzione genica basata su CRISPR-Cas9, in strategie di screening non di pool.

Al fine di determinare se la tecnologia ADE potrebbe essere utilizzata per un protocollo di trasfezione inversa automatizzato, abbiamo monitorato l'efficienza della trasfezione cellulare mediante microscopia a fluorescenza, utilizzando un plasmide fluorescente rosso fluorescente. In primo luogo puntando a determinare i migliori parametri di trasfezione, diversi volumi diluenti e quantità totali di DNA sono stati testati in modo incrociato. Il volume diluente è stato utilizzato per conse...

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High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Plasmid di DNA ad alto throughput e trasfezione utilizzando la tecnologia di nanoedispensing acustico

Questo protocollo descrive la trasflessazione di plasmide ad alto rendimento delle cellule dei mammiferi in una piastra di 384 pozzetto che utilizza la tecnologia di espulsione acustica delle goccioline. L'erogazione e il multiplexing del DNA, che richiedono molto tempo e richiedono errori, ma anche il reagente di trasfezione, sono basati su software ed eseguiti da un dispositivo nanodispenser. Le cellule vengono poi semiate in questi pozzi precompilati.

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Il protocollo di trasfezione basato su NanoDispenser sviluppato per descrivere in questo video rappresenta il primo metodo di trasfezione intuitivo e ad alta produttività che consente anche ai principianti sul campo di avere successo. Questa tecnica ad alta produttività è facile da usare e consente la trasfezione di cellule con 384 condizioni indipendenti. Al momento, il metodo è a basso costo a causa del nano volume di reagente necessario.Per definire i migliori parametri di trasfezione per tutto il tipo di cellula, suggeriamo di mantenere costante la concentrazione di DNA sorgente e di utilizzare quantità variabili di DNA trasfetto, reagente di trasfezione e numero di cellule. Per l'erogazione delle sospensioni a celle da 40 microliter, montare una cassetta da 10 microliter sul dispositivo di gestione del liquido peristaltico e preparare un programma appropriato. In primo luogo, regolare il parametro della portata a basso per erogare le cellule a bassa velocità per evitare di promuovere potenziali danni alle cellule a causa dello stress e dell'alto impatto sul fondo dei pozzi.Quindi, regolare l'altezza di erogazione a 11,43 millimetri. L'altezza deve essere abbastanza alta da ridurre l'impatto cellulare sul fondo dei pozzi durante il processo di erogazione, ma abbastanza bassa da evitare la ritenzione delle goccioline sulla testa di erogazione. Successivamente, regolare l'altezza chiara della piastra a 16 millimetri per consentire lo spostamento libero della testa di erogazione sulla piastra dopo aver dispensato ogni riga.Controllare visivamente le impostazioni corrette dell'altezza della testa del gestore liquido peristaltico. Assicurarsi che non siano conservate gocce sulle punte di erogazione durante l'erogazione. Verificare inoltre che la testa sia abbastanza alta da consentire lo spostamento della testa dopo l'erogazione di ogni riga.Per generare liste di prelievo per guidare la dispensazione ADE, è stata sviluppata una macro di fogli di calcolo intuitiva per gestire le quantità di DNA e mescolare fino a quattro plasmidi in un formato a piastre di pozzo 384. I volumi ottimali vengono precompilati in alcune celle del foglio di calcolo, ma possono essere modificati. Nei campi rosa, il reagente di trasfezione, o valore della miscela TR, è impostato su 500 nanolitri.Il valore minimo del volume nei pozzi della piastra di sorgente è impostato su quattro microlitri e il volume massimo nei pozzi della piastra di sorgente è di 11,25 microlitri. Immettere 100 nanogrammi per dna microlitro che iniziano concentrazioni nei campi blu corrispondenti al DNA sottostante. Quindi, inserisci la quantità di DNA desiderata nei campi grigio e verde corrispondente ai 384 pozzi della piastra.Inserisci le quantità e i nomi plasmidici e assicurati che venga utilizzata la stessa ortografia se lo stesso plasmide deve essere trasfetto in più pozzi. Fare clic su genera elenchi a discesa per verificare i valori immessi e, se richiesto, correggere le celle riempite di arancione che indicano errori o volumi che non possono essere gestiti da NanoDispenser. Se non ne viene rilevato alcuno, la macro genererà la guida all'erogazione del pozzo 384, il file della lista di prelievo del DNA e il file della lista a discesa TR dai dati raccolti sui fogli corrispondenti.Stampare il modello dal foglio della piastra di origine per visualizzare i pozzi da riempire prima dell'erogazione. Sono indicati nomi plasmidici e volumi di riempimento minimi. I volumi di miscela di reagenti di trasfezione che verranno riempiti nei seguenti pozzi, sono indicati come TR ed evidenziati in verde.Per preparare la piastra sorgente del DNA, diluire il plasmide di DNA immagazzinato a 100 nanogrammi per microlitro usando acqua distillata. Ora, calibrare la griglia del pozzo 384 in base alle dimensioni della piastra. Aprire l'applicazione 384 Well Pipetting Guide su un tablet.Posizionare la posizione di origine sulla griglia nella schermata inferiore. Nel menu di calibrazione in alto a sinistra, fare clic su più o meno per migliorare o ridurre le dimensioni della griglia e dei pozzi per regolare i pozzi verdi ai quattro pozzi angolari della piastra. Utilizzando nastro a doppia parte, montare l'adattatore a piastre stampate in 3D sullo schermo per evitare movimenti della piastra sorgente durante l'erogazione.Se necessario, spostare la griglia calibrata utilizzando le frecce di rotazione e i pulsanti su, giù, destra e sinistra per regolare la griglia in base alla posizione della piastra. Una volta calibrate e posizionate correttamente la griglia e le dimensioni dei pozzi, spuntare la casella di calibrazione del blocco. Fate clic sul file e aprite la guida alla pipettazione a 384 pozzi.csv. Seguire le istruzioni dello schermo per erogare manualmente il volume indicato di plasmide alla concentrazione specificata nel pozzo evidenziato in bianco che corrisponde alla destinazione target corretta della piastra prevista. Usa frecce meno o più per tornare indietro o più avanti nel processo di erogazione del DNA.Interrompere l'erogazione al raggiungimento della prima soluzione di reagente di trasfezione da caricare. Una volta terminate le dispensazioni di DNA, rimuovere la piastra di origine dall'adattatore. Se devono essere riempite più piastre sorgente, posizionare una nuova piastra di sorgente sull'adattatore e seguire le istruzioni di erogazione.Centrifugare le piastre di sorgente riempite di DNA per garantire un corretto livellamento del liquido e rimuovere le bolle che portano all'imprecisione nei trasferimenti di base ADE. Ora, esegui un sondaggio per controllare i volumi erogati manualmente. Nel PC NanoDispenser eseguire il programma NanoDispenser.Vai alla scheda diagnostica, spunta la posta in uscita della piastra di origine, carica la piastra di origine sul supporto della piastra e spunta per inserire la piastra. Quando richiesto, selezionare 384LDV_AQ_B2 impostare NanoDispenser sulla modalità di erogazione del buffer acquoso e premere OK. Selezionare sondaggio nel menu varie. E clicca sul lancio.Selezionare i pozzi precompilato da analizzare e fare clic sul pulsante vai. Verificare che i volumi misurati corrispondano a quelli previsti e assicurarsi che non siano stati caricati pozzi con volumi di oltre 12 microlitri. Innescare il tubo con mezzo privo di siero riempiendo un nuovo recipiente sterile con 10 millilitri di mezzo privo di siero pre-riscaldato e immergendovi l'organizzatore del tubo.Premere il pulsante primo del gestore liquido peristaltico per circa 10 secondi. Assicurarsi che la punta non sia intasata ispezionando visivamente il flusso dalla testa di erogazione. Posizionare una piastra sterile di coltura del pozzo 384 sul supporto peristanziale della piastra del conduttore liquido e rimuovere il coperchio.Eseguire il programma pre-calibrato per erogare un microliter in ogni pozzo della piastra del pozzo 384. Il tempo di erogazione è di circa otto secondi. Quindi sostituire il coperchio della piastra del pozzo 384.Per configurare l'erogazione di DNA basata su ADE, eseguire il software della lista di prelievo. Impostare i 384 pozzi provenienti da 384LDV. Impostare il dispositivo sulla modalità di erogazione del buffer acquoso selezionando 384LDV_AQ_B2.E i tipi di piastre di destinazione da Greiner_384PS_781096. Velocità effettiva di trasferimento ottimizzata senza graduazione. Selezionare la scheda elenco di selezione.Clicca sull'importazione. E selezionare il file DNA_Picklist_CSV file. Quindi, fai clic su riproduci e salva il protocollo.Fare clic su simula per eseguire una simulazione delle dispensazioni del programma per assicurarsi che l'elenco a discesa corrisponda al progetto sperimentale previsto. Clicca sul pulsante esegui e avvia il programma di erogazione. Quando richiesto, inserire la targa di origine richiesta.E poi la targa di destinazione nel NanoDispenser. Per impostare la dispensazione del reagente di trasfezione, lavorare in un armadio di biosicurezza per diluire il reagente di trasfezione lipopoliplex in mezzo privo di siero a una concentrazione finale di una x e vortice del tubo. Erogare immediatamente la miscela TR in base alla piastra di sorgente predefinita degnata dalla macro e utilizzando l'applicazione di guida di tubazione del pozzo 384 pre-calibrata.Dopo l'erogazione tr, eseguire un'indagine per controllare i volumi caricati TR come fatto in precedenza per il DNA caricato. Selezionare la miscela di reazione di trasfezione dei pozzi precompilato da analizzare. E clicca sul pulsante vai.Verificare che i volumi misurati corrispondano a quelli previsti. E assicurarsi che nessun pozzo sia stato caricato con volumi di oltre 12 microlitri. Ora esegui un reset dell'elenco a discesa del DNA nel software della lista dei picklist.Verificare che i parametri del dispositivo siano ancora impostati su buffer acquosi. Immettere i tipi di targa di origine e di destinazione corretti. Nella scheda elenco di prelievo fare clic su reimposta per cancellare l'elenco di esempio.Quindi clicca su importa e scegli il TR_Picklist. CSV. Clicca sul gioco.Salvare il protocollo se richiesto ed eseguire una simulazione delle dispensazioni della miscela di reagente di trasfezione del programma per garantire la corretta progettazione facendo clic sul pulsante simula. Come fatto in precedenza, dopo aver fatto clic sul pulsante di esecuzione e aver avviato il programma di erogazione posizionare la piastra di origine e quindi la piastra di destinazione nel NanoDipsenser come richiesto. Per erogare le cellule, riempire un nuovo vaso sterile con la sospensione cellulare preparata e mescolarlo per evitare la sedimentazione che porta all'imprecisione e alla densità cellulare.Inserire l'organizzatore del tubo nella soluzione. Quindi, premere il pulsante primo fino a quando la sospensione cellulare inizia a sciacquarsi dalla testa di erogazione. Assicurarsi che la punta non sia intasata ispezionando visivamente il flusso dalla testa di erogazione durante lo sciacquone e assicurarsi che ogni tubo sia caricato con sospensioni cellulari.Ora, caricare la piastra di destinazione del pozzo 384 riempita di DNA e TR sul supporto peristanziale della piastra del gestore del liquido e rimuovere il coperchio. Eseguire il programma pre-calibrato per erogare 40 microlitri della sospensione cellulare sulla piastra completa da 384 pozzi. Il tempo di erogazione è di circa 45 secondi.Infine, sostituire il coperchio della piastra del pozzo 384. La trasfezione delle cellule HeLa usando il reagente lipopolyplex ebbe successo. Quantità di DNA che vanno da cinque a 30 nanogrammi hanno mostrato la stessa efficienza e fino al 90% di trasfezione cellulare a un volume diluito di microliter.Al contrario, quantità più elevate hanno comportato una brusca diminuzione della percentuale di cellule trasfette. Sono stati testati vari volumi diluenti che vanno da 15 nanolitri a quattro microlitri e un microlitro è stato identificato come la condizione migliore. Per migliorare ulteriormente la produttività di questo protocollo sono stati testati due efficaci metodi di conservazione del DNA, vale a dire la conservazione a secco della piastra o la conservazione congelata.Entrambi i metodi di conservazione non hanno portato a risultati significativamente diversi rispetto alla soluzione di DNA appena erosa immagazzinata per un massimo di sette giorni. Poiché la trasfezione al plasma di solito impiega almeno due diversi plasmidi, la capacità di multiplexing del DNA di questo protocollo è stata esaminata utilizzando le migliori condizioni identificate. La proteina fluorescente rossa tdTomato precedentemente usata che esprime plasmide è stata modificata per esprimere mVenus una proteina fluorescente giallo brillante ed entrambe sono state poi utilizzate nei tentativi di cotrasfezione.L'analisi delle cellule fluorescenti positive rosse o verdi ha mostrato che l'efficienza di trasfezione è di circa l'80%Tuttavia, quasi il 100% dei globuli rossi è stato anche cotrasfetto con il plasmide che esprime mVenus come si può vedere nell'analisi delle immagini rappresentativa basata su software. Una volta che i DNA sono stati dispensati nella piastra di origine. Eseguire un sondaggio per assicurarsi che i volumi previsti siano stati caricati e non superino i 12 microlitri.Durante l'erogazione del reagente di trasfezione nella piastra di sorgente, cercare di evitare bolle poiché le piastre sovvertenti centrifughe si tradurranno in una completa perdita di efficacia della trasfezione. Questo metodo può essere applicato all'esperimento biologico, ai crimini e alla trasfezione ed è adatto principalmente che può essere eseguito in un formato a piastre di pozzo 384. Una trasfezione fullproof apre la strada a nuove applicazioni come il plasmide basato noto per approcci non di screening con colata più nitida che consentono il monitoraggio dell'effetto intermittente attualmente incapace di essere ordinato in strategie scadenti.

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Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina nativo sequenziamento librerie per analisi di densità del nucleosoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Isolamento del DNA robusto e costruzione della libreria High-throughput sequenziamento per campioni di erbario

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Identificazione di High-throughput di combinazioni di farmaci sinergici con il metodo2 di sovrapposizione

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Il metodo Set di Replica: Un approccio High-throughput per quantitativamente misura Caenorhabditis elegans durata della vita

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Estrazione del DNA high-throughput e genotipizzazione delle larve di Zebrafish 3dpf di pinna Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Identificazione di High-throughput di sequenze regolatorie del Gene mediante sequenziamento di nuova generazione di cromosoma circolare conformazione catturare (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Indice competitivo digitale basato su PCR per l'analisi ad alto epossibilere del fitness nella Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...