Name: high-throughput dna plasmid multiplexing and transfection using acoustic nanodispensing technology
Uploaded: 2019-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology at JoVE.com

著者らは、この記事の研究、著作者、および/または出版物のための次の財政的支援の領収書を開示しました:インサーム、リール大学、リールパストゥール研究所、コンセイユ・レジオナル・デュ・ノール、およびPRIM-HCV1と2(Pôle de Rechercheインタージシプリンエア・シュル・ル・メディカメント、アジェンス・ナショナル・デ・ラ・レチェルシュ(ANR-10-EQPX-04-01)、フェデラー(12001407(D-AL)イマジネーションス・バイオメッド)および欧州共同体(ERC-STG INTRACELLTB n° 260901)。著者らは、S.モウリュー博士、B.ヴィルマグネ博士、R.フェルー・クレメント博士、H.グルート博士に対し、原稿の批判的なレビューと訂正に感謝したいと考えている。

1. 事前準備
<ol><li>蠕動液体ハンドラプログラムの準備 注:プロトコルの希釈および細胞分配ステップのために、使用されるプレートへの分配ヘッドの高さとステップ意図を考慮して、専用のプログラムを準備する必要があります。<ol>
<li>1 μL希釈分配工程では、1 μLカセットを取り付け、ステップ1.1.1.1および1.1.1.2に記載されている設定でプログラムを準備します。<ol>
<li>この?...

<ol>
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特定の細胞株に対する正確なハイスループットトランスフェクション法の確立と最適化は、科学者がこのセクションで説明するいくつかの重要なパラメータに従う必要があります。HeLa細胞用に最適化されたこれらの設定はHEK細胞に対しても効率的であることが証明されたため、プロトコル全体で推奨値から始めることを強くお勧めします。しかし、最良のパラメータは細胞株およびトランス...

ここで提示される方法は、384ウェルプレート内の音響ベースの液体ナノディスペンサーを用いて、哺乳類細胞におけるDNAプラスミド多重化およびトランスフェクションを高スループットで行う方法を詳細に説明する。この最近公開された方法1は、1回の実験で384個もの独立プラスミドDNA多重化およびトランスフェクション条件を行うことを可能にし、1時間未満で単一または共トランスフェクション実験に成功し、ほぼ100%に達するトランスフェクト細胞集団内のコトランスフェクション。このプロトコルは、退屈で時間がかかり、エラーが発生しやすい手順のほとんどがソフトウェア駆動型であるため、トランスフェクションを容易にします (概要については、図 1を参照)。さらに、全体的なプロセス中の人為的ミスを回避しつつ、使いやすさを高め、現場の非専門家にとってもトランスフェクションの成功を促進するための専用ツールの開発に取り組んでいます。記述されたプロトコルには、各ウェルに最大 4 つのプラスミドの可能性を多重化する可能性を持つ 384 の独立したトランスフェクション条件を管理するために開発した「ユーザーフレンドリーな」マクロ スプレッドシートが含まれています。マクロは、入力された実験設計時にナノディスペンサーソフトウェアを駆動するために必要なファイルと、開始ストックソリューションから予想されるDNAプラスミドボリュームをロードするために、ソースプレートのテンプレートを自動的に生成します。384ウェルのソースプレートにDNAを手動で塗布するのは退屈でエラーが起こりやすいため、テンプレートに従ってDNA溶液を分配しながらユーザーを導く専用のタブレットベースのアプリケーションも開発しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59570/59570fig1v3.jpg"> 図 1: 実験的なワークフロー。最適な自動ハイスループット逆トランスフェクションプロトコルの概略表現(実験設計からカスタム生物学的アッセイまで)。手動ステップは手の記号で示され、各ステップのおおよその時間は赤いボックスに書き込まれます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59570/59570fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
多くの細胞ベースの実験はプラスミドDNAトランスフェクションから始まり、トランスフェクション効率を高め、手順を容易にするために多くの専用試薬が開発されている場合でも、多くのことが行われるべきである2、3,4.DNAプラスミド細胞トランスフェクションは、初期複合体取り込み、エンドソームエスケープ、および核への細胞質輸送などの高効率に到達するためのいくつかのステップを伴う5、6。カルシウム沈殿や専用デバイス7を用いてのエレクトロポレーションやマイクロインジェクションなどの物理的な技術に加えて、現代の化学的方法は、細胞の毒性を低下させながらDNA細胞送達を高めることに焦点を当ててきた8、 9.リポソーム様複合体を形成する脂質またはカチオン性ポリマーの使用により、より最近では、非リポソーム高分子化学系はトランスフェクションをより容易かつ効率的に10にした。これらの開発にもかかわらず、細胞トランスフェクションは、これらの物理的または化学的トランスフェクションプロトコルのほとんどが、科学者が手動で各DNAトランスフェクション反応状態を準備する必要があるため、正確に実行する特定のスキルを必要とします。スループットを損なう。この問題を回避するために、逆トランスフェクションプロトコルは、化学トランスフェクション試薬11、12、13を使用して開発され、ユーザがより速い方法で複数のプラスミドをテストまたは組み合わせることを可能にする。これらのプロトコルでは、トランスフェクション試薬を用いた核酸複合体が、複合体上の細胞を播種する前に形成される。しかし、これらの逆プロトコルは、DNA溶液の手動処理と、独立した条件のそれぞれの組み合わせによって依然として制限されています。96ウェルプレート形式で行うことが可能ですが、DNAの調製と分配は退屈であり、間違いが起こる可能性があります。複数のDNAプラスミドの異なる量が必要とされ、互いに多重化されると、細胞トランスフェクションを達成するのがさらに難しくなり、時間がかかり、ヒューマンエラーは非常に避けられません。逆トランスフェクションアプローチで384ウェルプレートフォーマットにスケールアップすることは、多重化されたDNAトランスフェクション条件が少ないにもかかわらず、以下の理由により不可能な課題となります。i) 管理するDNA量、トランスフェクション試薬、または反応混合物量は、各ウェルに対して1μL未満である。ii) 384の独立した条件に対するプラスミドの多重化は極めて複雑になる。384ウェルの各々における送達もiii)非常に時間がかかり、iv)エラーが発生しやすい。確かに、期待される井戸に適切なソリューションを分配することは、既に分配されている少量は空の井戸と既に充填された井戸の間の視覚的な監視を許可しないため、管理が困難です。v)最後に、必要な分配工程を行うために必要な時間のために細胞が添加される前に蒸発によって混合物を乾燥させる危険性が高い。要約すると、ハイスループットのDNAプラスミドトランスフェクションアッセイを設定する制限要因は、アッセイの小型化であり、これは、もはや手動では処理できないが、また、ほとんど達成できないことを意味するアッセイの小型化である。古典的な前立腺液体ハンドラーによって信頼できる方法。
このようなアッセイを自動化し、高スループットを得ることが困難な証拠として、トランスフェクションを自動化する試みは、これまでに発表されているだけです:市販の液体処理装置とリン酸カルシウム沈殿14を使用した96ウェルプレートフォーマットそして、より最近では、リポレックス試薬、および280の独立したトランスフェクション15を可能にするマイクロ流体チップが、この分野で専門的なスキルを必要とします。別の方法は、アコストフォレシス、液体浮上を可能にし、流体操作および混合につながる、24〜96ウェルプレートフォーマット16でDNAトランスフェクションを行うために使用された。実現可能ですが、DNAトランスフェクション混合物と細胞を混合するには、播種前に1点ごとに60sのインキュベーションが必要とされるため、このアプローチは非常に低いスループットに苦しみます。これは、完全な96ウェルプレートの持続時間が少なくとも96分を意味します。さらに、このプロトコルは、現在市場で入手できない社内で設計され、製造されたデバイスで行われたため、生物学者全体の聴衆に対して受け入れられるものからは程遠い。それどころか、ここ数年、ソフトウェア駆動の音響ベースのディスペンス技術がナノボリュームディスペンサーデバイスで登場しました。集中した音響エネルギーを使用して、これらの装置は、ソースプレートから宛先117への2.5 nLから500 nLまでの小さな液体容積の厳密に制御された排出を可能にします。音響液滴の排出(ADE)と呼ばれるこの技術は多数の利点を有する:それは十分に自動化され、非接触、先端無し、正確、精密、および非常に再生可能であり、高いスループット18を有する。最初にジメチルスルホキシド(DMSO)ソリューションの提供に専念し、水性バッファー19を分配するように設定が強化されました。音響ナノディスペンサーは、その後、逆細胞トランスフェクションプロトコルに適しているように見え、上記の手動制限のほとんどを回避することができます。この技術を用いてプラスミドトランスフェクションの試みはこれまで述べられていなかったので、我々は最近、逆細胞トランスフェクションを行う音響ベースの分配システムの適合性を評価した。
ナノディスペンサーのスループットと使いやすさを活かし、384ウェル、シングルプレート、すなわち総DNA量とDNAトランスフェクションに影響を与える可能性のあるいくつかのパラメータをクロステストすることにより、HeLa細胞の逆トランスフェクションプロトコルを最適化しました。ソースDNA開始濃度、希釈体積、トランスフェクション試薬、および広がり細胞数。開発されたプロトコルは、細胞トランスフェクションの上述の手動制限を回避し、他の自動トランスフェクションの試みに対していくつかの利点を提示します。第1に、小型化により、DNAプラスミド製剤およびトランスフェクション試薬を保存することにより、費用対効果の高いトランスフェクション試薬を可能にします。第二に、384ウェルプレート全体のトランスフェクションが1時間未満で達成することができるので、それは手動プロトコル(初心者のためにも)よりもはるかに高スループットと再現性があります。最後に、それはソフトウェア主導であり、分配されたDNA量およびいくつかのプラスミドの多重化の制御を可能にする。確かに、ナノディスペンサーソフトウェア(材料のテーブル)のおかげで、ユーザーは、定義されたソースウェルプレートから宛先の1に分配されるボリュームを制御するための研究計画を精緻化することができます。
ここで提示されるプロトコルは、主にナノディスペンサーにアクセスし、高スループットでトランスフェクション実験を設定したい人を対象としていますが、特定のセルタイプに対するトランスフェクションパラメータを迅速に最適化したい方も対象です。このプロトコルを適用して、高スループットでいくつかのパラメータをクロステストします。実際、このナノスケールプロトコルで同定された最適化されたパラメータは、大規模かつ手動のトランスフェクション実験に移すことができることを示しました。最後に、本プロトコルで使用されるトランスフェクション試薬は、製造元に応じてDNAまたはsiRNAトランスフェクションを可能にするように、プロトコルは、遺伝子過剰発現またはノックダウンのための配列アプローチを行うことを目指す人にも興味がある。DNAで埋め込んだ宛先プレートは、有効性を損なうことなくトランスフェクションアッセイで使用する7日前まで保存することができ、この種のアプリケーションに対する次のプロトコルのもう一つの利点である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1226px;" width="1224">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">384LDV Microplate</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;">LP-0200</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">384-well Microplate &#956;Clear Black</td>
			<td style="width:363px;">Greiner</td>
			<td style="width:202px;">781906</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:363px;">Sigma</td>
			<td style="width:202px;">A9393-5G</td>
			<td style="width:291px;">Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Android Tablet</td>
			<td style="width:363px;">Samsung</td>
			<td style="width:202px;">Galaxy Note 8</td>
			<td style="width:291px;">used to guide the user while the source plate manual dispense</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Aniospray Surf 29</td>
			<td style="width:363px;">Anios</td>
			<td style="width:202px;">2421073</td>
			<td style="width:291px;">disinfectant to clean the MicroFlo head</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Columbus software</td>
			<td style="width:363px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">image analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">10566032</td>
			<td style="width:291px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:371px;">Echo Cherry Pick 1.5.3 software</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Echo550</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">ADE-based dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">16000044</td>
			<td style="width:291px;">to add in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:363px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:202px;">HT501128-4L</td>
			<td style="width:291px;">to fix cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:363px;">ATCC</td>
			<td style="width:202px;">HeLa (ATCC&#174; CCL-2&#8482;)</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">H3570</td>
			<td style="width:291px;">10 mg/mL Solution in Water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">INCell Analyzer 6000</td>
			<td style="width:363px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:202px;">29043323</td>
			<td style="width:291px;">automated laser-based confocal imaging platform</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:371px;">LB medium</td>
			<td style="width:363px;">Thermoischer Scientific 
			LB Broth Base (Lennox L Broth Base)&#174;, powder</td>
			<td style="width:202px;">12780052</td>
			<td style="width:291px;">culture medium for bacteria growth</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Lysis Buffer (A2)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740912.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">MicroFlo 10&#181;L cassette</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7170013</td>
			<td style="width:291px;">to use with the Microflo Dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">MicroFlo 1&#956;L cassette</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7170012</td>
			<td style="width:291px;">to use with the Microflo Dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">MicroFlo Dispenser</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7171000</td>
			<td style="width:291px;">peristaltic pump-based liquid handler device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Microvolume spectrophotometer</td>
			<td style="width:363px;">Denovix</td>
			<td style="width:202px;">DS-11 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:291px;">Measure the DNA concentration of samples</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:371px;">mVenus plasmid</td>
			<td style="width:363px;">mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Neutralization Buffer (A3)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740913.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">NucleoSpin Plasmid kit</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740588.50</td>
			<td style="width:291px;">used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">31985070</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">optional Wash bufferWash Buffer (A4)</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740914.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;">orbital shaker&#160;</td>
			<td style="width:363px;">incubated large capacity shaker</td>
			<td style="width:202px;">444-7084</td>
			<td style="width:291px;">Used to grow bacteria under gentle agitation and 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">15140122</td>
			<td style="width:291px;">10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">10010001</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Plasmid mini-columns</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740499.250</td>
			<td style="width:291px;">Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Resuspension Buffer (A1)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740911.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">RNAse A</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740505</td>
			<td style="width:291px;">Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">tdTomato-N1 plasmid</td>
			<td style="width:363px;">Addgene</td>
			<td style="width:202px;">Plasmid #54642</td>
			<td style="width:291px;">Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">TransIT-X2 Dynamic Delivery System</td>
			<td style="width:363px;">Mirus Bio</td>
			<td style="width:202px;">MIR 6000</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Wash Buffer (AW)</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740916.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">3D printer</td>
			<td style="width:363px;">Creality</td>
			<td style="width:202px;">CR10S</td>
			<td style="width:291px;">used to print the plate adapter</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:371px;">Blender Software&#160;</td>
			<td style="width:363px;">&#160;https://www.blender.org/ 
			Free software under GNU General Public License (GPL).</td>
			<td style="width:202px;">version 2.79b</td>
			<td style="width:291px;">used to design the plate adapter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput dna plasmid multiplexing and transfection using acoustic nanodispensing technology

多くの生物学的研究に不可欠な細胞トランスフェクションは、正確で成功した達成のために多くのパラメータを制御する必要があります。ほとんどの場合、低スループットで実行され、さらに時間がかかり、エラーが発生しやすく、複数のプラスミドを多重化する場合はさらにそうです。私たちは、音響液滴放出(ADE)技術を使用して384ウェルプレートレイアウトで細胞トランスフェクションを行う簡単で迅速かつ正確な方法を開発しました。本研究で用いられるナノディスペンサー装置は、この技術に基づいており、ソースウェルプレートから目的地への高速での正確なナノボリューム送達を可能にします。あらかじめ設計されたスプレッドシートに従って、DNAおよびトランスフェクション試薬を分配し、多重化することができる。ここでは、ADEベースのハイスループットプラスミドトランスフェクションを実行するための最適なプロトコルを提示し、コトランスフェクション実験において最大90%の効率とほぼ100%のコトランスフェクションに到達することを可能にします。最大 1,536 個の異なるプラスミドを含むライブラリから最大 4 つのプラスミド/ウェルを管理できるユーザーフレンドリーなスプレッドシート ベースのマクロと、タブレットベースのピペッティング ガイド アプリケーションを提案することで、初期作業を拡張します。マクロは、ソースプレートの必要なテンプレートを設計し、ナノディスペンサーとタブレットベースのアプリケーション用にすぐに使用できるファイルを生成します。4ステップトランスフェクションプロトコルは、i)古典的な液体ハンドラを有する希釈剤、ii)プラスミド分布および多重化、iii)ナノディスペンサーによるトランスフェクション試薬分配、およびiv)予め充填されたウェル上の細胞めっきを含む。ADEプラスミド多重化およびトランスフェクションの記載されたソフトウェアベースの制御は、現場の非専門家でさえ、迅速かつ安全な方法で信頼性の高い細胞トランスフェクションを実行することを可能にします。この方法は、特定のセルタイプに最適な設定を迅速に特定し、より大規模かつ手動のアプローチに転置することができます。このプロトコルは、ヒトORFeomeタンパク質(ゲノムにおけるオープンリーディングフレーム[ORFs]のセット)発現やCRISPR-Cas9ベースの遺伝子機能検証などのアプリケーションを非プールスクリーニング戦略で容易にします。

fADE技術が自動逆トランスフェクションプロトコルに使用できるかどうかを判断するために、赤色蛍光tdトマト発現プラスミドを用いて蛍光顕微鏡による細胞トランスフェクション効率をモニタリングした。まず、最良のトランスフェクションパラメータを決定するために、異なる希釈量とDNAの総量をクロステストしました。希釈体積は、DNA液滴が一度分配されると、?...

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High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

音響ナノディスペンス技術を用いたハイスループットDNAプラスミド多重化とトランスフェクション

このプロトコルは、音響液滴排出技術を用いて384ウェルプレートにおける哺乳動物細胞のハイスループットプラスミドトランスフェクションについて説明する。時間がかかり、エラーが起こりやすいDNA分配と多重化だけでなく、トランスフェクション試薬の分配は、ソフトウェア駆動型であり、ナノディスペンサーデバイスによって実行されます。細胞は、次いで、これらの予め充填された井戸に播種されます。

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

このビデオで説明するために開発されたNanoDispenserベースのトランスフェクションプロトコルは、初めてのユーザーフレンドリーで高スループットのトランスフェクション方式を表し、現場の初心者でも成功を収めることを可能にします。これは384の独立した条件の細胞のトランスフェクションを可能にするハイスループットの技術で容易である。現在のところ、この方法は、必要な試薬のナノ量に起因する低コストです。すべての細胞タイプに最適なトランスフェクションパラメータを定義するために、ソースDNA濃度を一定に保ち、様々な量のトランスフェクションDNA、トランスフェクション試薬、および細胞数を使用することをお勧めします。40マイクロリットルのセル懸濁液を分配するために、蠕動性液体ハンドラ装置に10マイクロリットルカセットを取り付け、適切なプログラムを準備する。まず、流量パラメータを低に調整して、細胞の低速度を分配し、完全なストレスとウェルの底部への高い影響によって細胞への潜在的な損傷を促進しないようにします。その後、分配の高さを11.43ミリメートルに調整します。高さは、分配プロセス中にウェルの底部に対する細胞の影響を下げるほど高くなければならないが、分配ヘッドの液滴の保持を避けるのに十分低い。次に、プレートのクリア高さを16ミリメートルに調整し、各列を分配した後に分配ヘッドの自由な変位をプレート上に置きます。蠕動性液体ハンドラヘッド高の適切な設定を視覚的に制御します。分配の間に分配の先端に滴が保持されないです。また、各行を分配した後にヘッドの変位を可能にするのに十分な高さであることを確認してください。ADEディスペンスを駆動するための選択リストを生成するために、DNA量を管理し、384ウェルプレート形式で最大4つのプラスミドを混合するためのユーザーフレンドリーなスプレッドシートマクロが開発されました。最適なボリュームはスプレッドシートの一部のセルに事前入力されていますが、変更できます。ピンクの分野では、トランスフェクション試薬、またはTR混合物値が500ナノリットルに設定されている。ソースプレートウェルの最小体積値は4マイクロリットルに設定され、ソースプレートウェルの最大体積は11.25マイクロリットルに設定されます。基礎となるDNAに対応する青いフィールドに、マイクロリットルDNA開始濃度あたり100ナノグラムを入力します。次に、プレートの384ウェルに対応するグレーおよび緑色のフィールドに所望のDNA量を入力する。量とプラスミド名を入力し、同じプラスミドがいくつかの井戸にトランスフェクションする必要がある場合は、同じスペルが使用されていることを確認します。入力された値を確認するために選択リストを生成する をクリックし、要求された場合は、NanoDispenser で処理できないエラーまたはボリュームを示すオレンジ色の塗り潰しセルを修正します。何も検出されない場合、マクロは、対応するシート上で収集されたデータから384ウェルディスペンスガイド、DNA選択リストファイル、およびTR選択リストファイルを生成します。ソースプレートシートからテンプレートを印刷して、分配する前に充填するウェルを視覚化します。プラスミド名と最小充填量が示されます。トランスフェクション試薬混合物容積は、以下のウェルに充填され、TRとして示され、緑色で強調表示される。DNAソースプレートを調製するには、蒸留水を用いて保存されたDNAプラスミドを1マイクロリットル当たり100ナノグラムに希釈する。さて、プレート寸法に384ウェルグリッドをキャリブレーションします。タブレット上の384ウェルピペットガイドアプリケーションを開きます。ソースを下の画面のグリッド上に配置します。左上の調整メニューで、プラスまたはマイナスをクリックして、プレートの 4 つのコーナーウェルにグリーンウェルを調整するために、グリッドとウェルのサイズを増減します。両面テープを使用して、3Dプリントされたプレートアダプタを画面に取り付け、分配中にソースプレートの動きを避けます。必要に応じて、回転矢印を使用して、グリッドを上下左右のボタンを使用して、グリッドをプレートの位置に調整します。グリッドとウェルサイズが適切に調整され、配置されたら、ロックキャリブレーションボックスにチェックを入れます。ファイルをクリックして、384-ウェルズピペットガイドを開きます。csv ファイル。画面の指示に従って、指定された濃度のプラスミドの示された体積を、期待されるプレートの適切なターゲット先に対応する白い強調表示ウェルに手動で分配します。DNAの分配プロセスに戻るか、またはさらに進むために、マイナスまたはプラス矢印を使用してください。最初のトランスフェクション試薬溶液に到達すると、分配を停止します。DNAの分配が終わったら、アダプターからソースプレートを取り外します。複数のソースプレートを充填する場合は、アダプタに新しいソースプレートを置き、塗布指示に従います。適切な液体のレベリングを確保し、ADEベース転送の不正確さにつながる気泡を除去するために、DNA充填ソースプレートを遠心分離します。次に、調査を実行して、手動で分配されたボリュームを制御します。ナノディスペンサーPCで、ナノディスペンサープログラムを実行します。診断タブに移動し、ソースプレートのアウトボックスにチェックを入れ、プレートホルダーにソースプレートをロードし、プレートに入るためにチェックを入れます。プロンプトが表示されたら、384LDV_AQ_B2選択してNanoDispenserを水性バッファディスペンスモードに設定し、[OK]を押します。その他のメニューでアンケートを選択します。そして、起動をクリックします。分析する事前に充填されたウェルを選択し、移動ボタンをクリックします。測定されたボリュームが期待したボリュームと一致することを確認し、12マイクロリットル以上のボリュームで井戸がロードされていないことを確認します。新しい無菌容器に10ミリリットルのプレウォームドセラムフリー培地を充填し、チューブオーガナイザーを水没させることで、無血清培地でチューブをプライムします。蠕動性液体ハンドラの素本ボタンを約10秒間押します。分配ヘッドからの流れを目視で点検して、先端が詰まっていることを確認してください。滅菌384ウェル培養プレートを蠕動性液体ハンドラプレートキャリアに置き、蓋を取り外します。384ウェルプレートの各ウェルに1マイクロリットルを分配するために、事前校正されたプログラムを実行します。分配時間はおよそ8秒である。その後、384ウェルプレートの蓋を交換してください。ADE 駆動 DNA ディスペンスを設定するには、選択リスト ソフトウェアを実行します。384 ウェルを 384LDV に設定します。384LDV_AQ_B2を選択して、デバイスを水性バッファー塗布モードに設定します。そして、Greiner_384PS_781096するデスティネーションプレートタイプ。ティックを解除して最適化された転送スループットをオフにします。選択リスト タブを選択します。インポートをクリックします。DNA_Picklist_CSVファイルを選択します。次に、再生をクリックしてプロトコルを保存します。[シミュレーション]をクリックしてプログラムディスペンスのシミュレーションを実行し、選択リストが予想される実験計画と一致することを確認します。実行ボタンをクリックして、塗布プログラムを開始します。要求されたら、要求されたソース プレートを挿入します。そして、ナノディスペンサーの目的地プレート。トランスフェクション試薬の塗布をセットアップするには、バイオセーフティキャビネットで、無血清培地でリポポリプレックストランスフェクション試薬を1 x最終濃度に希釈し、チューブをボルテックスします。すぐにマクロによって有される事前に定義されたソースプレートに従ってTRの混合物を分配し、事前に校正された384井戸ピペットガイドアプリケーションを使用して。TRディスペンスに続いて、ロードされたDNAに対して以前に行われたようにTRロードされたボリュームを制御するための調査を行います。分析するトランスフェクション反応ミックスプレフィルドウェルを選択します。そして、移動ボタンをクリックします。測定されたボリュームが期待したボリュームと一致することを確認します。そして、井戸が12マイクロリットル以上のボリュームでロードされていないことを確認してください。選択リストソフトウェアでDNA選択リストのリセットを実行します。デバイス パラメータが、依然として水性バッファに設定されていることを確認します。正しいソースプレートと宛先プレートタイプを入力します。選択リストタブで、リセットをクリックしてサンプルリストをクリアします。次に、インポートをクリックして、TR_Picklistを選択します。CSV ファイル。再生をクリックします。プロンプトが表示されたらプロトコルを保存し、プログラムトランスフェクション試薬の混合剤のディザレーションのシミュレーションを実行して、シミュレーションボタンをクリックして適切な設計を保証します。前に行われたように、実行ボタンをクリックして、塗布プログラムを開始した後、要求に応じて、ソースプレートと、NanoDipsenserの宛先プレートを配置します。細胞を分配するには、新しい無菌容器に調製された細胞懸濁液を充填し、不正確さと細胞密度につながる沈下を避けるためにそれを攪拌する。ソリューションにチューブ オーガナイザーを挿入します。次に、セル懸濁液が分配ヘッドからフラッシュし始めるまでプライムボタンを押します。フラッシュ中に分配ヘッドからの流れを視覚的に検査して先端が詰まっていることを確認し、各チューブにセルサスペンションが積み込まれているようにしてください。今度は、蠕動性液体ハンドラプレートキャリアにDNAおよびTR充填384ウェル先送りプレートをロードし、その蓋を取り外します。完全な384ウェルプレート上の細胞懸濁液の40マイクロリットルを分配するために事前校正されたプログラムを実行します。分配の時間は約45秒である。最後に、384ウェルプレートの蓋を交換します。リポポリプレックス試薬を用いたHeLa細胞のトランスフェクションが成功した。5~30ナノグラムのDNA量は、1マイクロリットルの希釈体積で同じ効率と最大90%の細胞トランスフェクションを示した。対照的に、高い量は、トランスフェクトされた細胞の割合の急激な減少をもたらした。15ナノリットルから4マイクロリットルまでの様々な希釈液量を試験し、1マイクロリットルが最良の条件として同定された。このプロトコルのスループットをさらに高めるために、2つの効率的なDNA保存方法は、すなわちプレートまたは凍結貯蔵を乾燥して保存して試験した。両方の保存方法は、最大7日間保存された新しい分注されたDNA溶液とは有意に異なる結果を導かなかった。血漿トランスフェクションは通常、少なくとも2つの異なるプラスミドを採用するので、このプロトコルのDNA多重化能を、最良の同定された条件を用いて検討した。以前に使用したtdTomato赤色蛍光タンパク質をプラスミドを発現させ、mVenusを明るい黄色の蛍光タンパク質を発現するように改変し、その後、両方をコトランスフェクションの試みに使用した。赤色または緑色蛍光陽性細胞分析はトランスフェクション効率が約80%であることを示したが、代表的なソフトウェアベースの画像分析で見られるように、赤細胞のほぼ100%がプラスミドを発現するmVenusと共感染した。一度DNAがソースプレートに分配されました。予想されるボリュームがロードされ、12マイクロリットルを超えないように調査を実行します。ソースプレートにトランスフェクション試薬を塗布しながら、遠心サブプレートがトランスフェクション効果の完全な損失をもたらすので、気泡を避けるようにしてください。この方法は、生物実験、犯罪、およびトランスフェクションに適用することができ、384ウェルプレート形式で行うことができる大部分に適しています。フルプルーフトランスフェクションは、クリスピーキャスト非スクリーニングアプローチで知られるプラスミドベースなどの新しいアプリケーションへの道を開き、現在貧弱な戦略でソートすることができない断続的な影響の監視を可能にします。

Research

JoVE Journal

Genetics

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

過敏性腸症候群におけるmiRNA循環の摂動は多重化ハイスループット遺伝子発現プラットフォームを使用して検出します

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

高脂肪食給餌とキイロショウジョウバエの高スループット Triacylglyceride 試金

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

ネイティブのクロマチン免疫沈降のヌクレオソーム密度解析ライブラリをシーケンスの生成

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

重複2法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

レプリカの設定方法: 定量的測定線虫の寿命を高スループット方法

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

ハイスループット DNA の抽出およびフィン クリッピングが 3dpf ゼブラフィッシュ仔のジェノタイピング

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

サルモネラ菌におけるフィットネスのハイスループット分析に関するデジタルPCRベースの競争指数

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...