Name: high-throughput dna plasmid multiplexing and transfection using acoustic nanodispensing technology
Uploaded: 2019-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology at JoVE.com

Os autores divulgaram um recebimento do seguinte apoio financeiro para a pesquisa, autoria e/ou publicação deste artigo: INSERM, Lille University, Lille Pasteur Institute, Conseil Régional du Nord, e PRIM-HCV1 e 2 (Pôle de Recherche Interdisciplinaire sur le Médicament), Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-EQPX-04-01), o FEDER (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) e a Comunidade Européia (ERC-STG INTRACELLTB n ° 260901). Os autores desejam agradecer ao Dr. S. Moureu, Dr. B. Villemagne, Dr. R. ferru-Clément, e Dr. H. Groult por sua revisão crítica e correções do manuscrito.

1. preparações antecipadas
<ol><li>Preparação dos programas de tratamento de líquidos peristálticos Nota: para o diluente e as etapas de dispensação da célula do protocolo, um programa dedicado deve ser preparado, tendo em conta a altura da cabeça dispensadora para a placa utilizada e a intenção da etapa.<ol>
<li>Para o passo de dosagem de diluente de 1 μL, monte uma gaveta de 1 μL e prepare um programa com as definições descritas nas etapas 1.1.1.1 e 1.1.1.2.<ol>
<li>Ajuste o parâm...

<ol>
	<li>Colin, B., Deprez, B., Couturier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+DNA+Plasmid+Transfection+Using+Acoustic+Droplet+Ejection+Technology.">High-Throughput DNA Plasmid Transfection Using Acoustic Droplet Ejection Technology.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R &#38; D. , 2472555218803064 (2018).</li><li>Mirus Bio. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optimising Transfection Performance. , (2019).</li><li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Factors Influencing Transfection Efficiency | Thermo Fisher Scientific - FR. , (2019).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).</li><li>Figueroa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanistic+investigation+exploring+the+differential+transfection+efficiencies+between+the+easy-to-transfect+SK-BR3+and+difficult-to-transfect+CT26+cell+lines.">A mechanistic investigation exploring the differential transfection efficiencies between the easy-to-transfect SK-BR3 and difficult-to-transfect CT26 cell lines.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 36 (2017).</li><li>Kirchenbuechler, I., Kirchenbuechler, D., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+cationic+lipid-based+transfection+and+cell+division.">Correlation between cationic lipid-based transfection and cell division.</a> Experimental Cell Research. 345 (1), 1-5 (2016).</li><li>Zhang, Z., Qiu, S., Zhang, X., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+DNA+electroporation+for+primary+human+T+cell+engineering.">Optimized DNA electroporation for primary human T cell engineering.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), 4 (2018).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+activity+and+the+mechanism+of+pDNA-complexes+based+on+the+hybrid+of+low-generation+PAMAM+and+branched+PEI-1.8k.">Transfection activity and the mechanism of pDNA-complexes based on the hybrid of low-generation PAMAM and branched PEI-1.8k.</a> Molecular bioSystems. 9 (12), 3175-3186 (2013).</li><li>Bos, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+semi-automated+high+throughput+transient+transfection+system.">Development of a semi-automated high throughput transient transfection system.</a> Journal of Biotechnology. 180, 10-16 (2014).</li><li>Colosimo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+and+expression+of+foreign+genes+in+mammalian+cells.">Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells.</a> BioTechniques. 29 (2), 314-318 (2000).</li><li>Villa-Diaz, L. G., Garcia-Perez, J. L., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+transfection+efficiency+of+human+embryonic+stem+cells+by+the+incorporation+of+DNA+liposomes+in+extracellular+matrix.">Enhanced transfection efficiency of human embryonic stem cells by the incorporation of DNA liposomes in extracellular matrix.</a> Stem Cells and Development. 19 (12), 1949-1957 (2010).</li><li>Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Reverse transfection method. , WO2001020015A1 (2001).</li><li>Raymond, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+polyethylenimine-mediated+transfection+process+for+large-scale+and+high-throughput+applications.">A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications.</a> Methods (San Diego, CA). 55 (1), 44-51 (2011).</li><li>Junquera, E., Aicart, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+gene+therapy+to+deliver+nucleic+acids+with+multivalent+cationic+vectors.">Recent progress in gene therapy to deliver nucleic acids with multivalent cationic vectors.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 233, 161-175 (2016).</li><li>Woodruff, K., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Microfluidic+Platform+for+Mammalian+Cell+Transfection+and+Culturing.">A High-Throughput Microfluidic Platform for Mammalian Cell Transfection and Culturing.</a> Scientific Reports. 6, 23937 (2016).</li><li>Vasileiou, T., Foresti, D., Bayram, A., Poulikakos, D., Ferrari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+Contactless+Biology:+Acoustophoretic+DNA+Transfection.">Toward Contactless Biology: Acoustophoretic DNA Transfection.</a> Scientific Reports. 6, 20023 (2016).</li><li>Hadimioglu, B., Stearns, R., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+Liquids+with+Sound:+The+Physics+of+Acoustic+Droplet+Ejection+for+Robust+Laboratory+Automation+in+Life+Sciences.">Moving Liquids with Sound: The Physics of Acoustic Droplet Ejection for Robust Laboratory Automation in Life Sciences.</a> Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 4-18 (2016).</li><li>Grant, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+accurate+compound+concentration+in+cell-based+screening:+validation+of+acoustic+droplet+ejection+technology.">Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology.</a> Journal of Biomolecular Screening. 14 (5), 452-459 (2009).</li><li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+That+Enable+Accurate+and+Precise+Nano-+to+Milliliter-Scale+Liquid+Dispensing+of+Aqueous+Reagents+Using+Acoustic+Droplet+Ejection.">Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection.</a> Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 166-177 (2016).</li><li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+protein+palette:+tools+for+cellular+imaging.">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chemical Society Reviews. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li><li>Zielinski, D., Gordon, A., Zaks, B. L., Erlich, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPipet:+sample+handling+using+a+tablet.">iPipet: sample handling using a tablet.</a> Nature Methods. 11 (8), 784-785 (2014).</li><li>Brunner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+dependence+of+gene+transfer+by+lipoplex,+polyplex+and+recombinant+adenovirus.">Cell cycle dependence of gene transfer by lipoplex, polyplex and recombinant adenovirus.</a> Gene Therapy. 7 (5), 401-407 (2000).</li><li>Nii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell-State+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Increases+Transfection+Efficiency.">Single-Cell-State Culture of Human Pluripotent Stem Cells Increases Transfection Efficiency.</a> BioResearch Open Access. 5 (1), 127-136 (2016).</li><li>Noonan, D. J., Henry, K., Twaroski, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Mammalian+Cell-Based+Transient+Transfection+Assay.">A High-Throughput Mammalian Cell-Based Transient Transfection Assay.</a> Signal Transduction Protocols. 284, 051-066 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transfection | TransIT Transfection Reagents | Mirus Bio. , (2015).</li><li>American Type Culture Collection. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> General protocol for transfection of stem cells, primary cells, and continuous cell lines with ATCC TransfeX Transfection Reagent. , (2017).</li><li>American Type Culture Collection. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transfection Reagents for Nucleic Acid Transfer into ATCC Cells. , (2017).</li><li>de Los Milagros Bassani Molinas, M., Beer, C., Hesse, F., Wirth, M., Wagner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+transient+transfection+process+of+HEK-293+suspension+cells+for+protein+production+by+nucleotide+ratio+monitoring.">Optimizing the transient transfection process of HEK-293 suspension cells for protein production by nucleotide ratio monitoring.</a> Cytotechnology. 66 (3), 493-514 (2014).</li><li>Promega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> FuGENE&#174; 6 Transfection Reagent. , (2019).</li><li>Olden, B. R., Cheng, Y., Yu, J. L., Pun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+polymers+for+non-viral+gene+delivery+to+human+T+cells.">Cationic polymers for non-viral gene delivery to human T cells.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 282, 140-147 (2018).</li><li>Park, E., Cho, H. B., Takimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+gene+delivery+into+adipose-derived+stem+cells:+transfection+of+cells+in+suspension+with+the+use+of+a+nuclear+localization+signal+peptide-conjugated+polyethylenimine.">Effective gene delivery into adipose-derived stem cells: transfection of cells in suspension with the use of a nuclear localization signal peptide-conjugated polyethylenimine.</a> Cytotherapy. 17 (5), 536-542 (2015).</li><li>Wood, R. W., Loomis, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+and+biological+effects+of+high-frequency+sound-waves+of+great+intensity.">The physical and biological effects of high-frequency sound-waves of great intensity.</a> The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 4 (22), 417-436 (1927).</li><li>Mamat, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eliminating+Endotoxin+at+the+Source+-+A+Novel+Competent+Cell+Line+with+Modified+Lipopolysaccharide+for+Low-Endotoxin+Plasmid+Production.">Eliminating Endotoxin at the Source - A Novel Competent Cell Line with Modified Lipopolysaccharide for Low-Endotoxin Plasmid Production.</a> , (2014).</li><li>Ivanova, N. V., Kuzmina, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+dry+DNA+storage+and+shipment+at+room+temperature.">Protocols for dry DNA storage and shipment at room temperature.</a> Molecular Ecology Resources. 13 (5), 890-898 (2013).</li><li>Lesnick, J., Lejeune-Dodge, A., Ruppert, N., Jarman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High-Precision Cell Dispensing with the Labcyte Echo&#174; Liquid Handler. , (2017).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+public+genome-scale+lentiviral+expression+library+of+human+ORFs.">A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs.</a> Nature Methods. 8 (8), 659-661 (2011).</li><li>Peng, J., Zhou, Y., Zhu, S., Wei, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screens+in+mammalian+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">High-throughput screens in mammalian cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> The FEBS journal. 282 (11), 2089-2096 (2015).</li></ol>

O estabelecimento e a otimização de um método de transfecção de alta taxa de transferência precisa para uma determinada linha de célula exigem que os cientistas sigam alguns dos principais parâmetros descritos nesta seção. Nós encorajamos a começar com os valores recomendados em todo o protocolo como essas configurações otimizadas para células HeLa também provou ser eficiente para células HEK. No entanto, como os melhores parâmetros podem depender das linhas celulares e reagentes de transfecção, as co...

O método aqui apresentado descreve detalhadamente como realizar a multiplexação e transfecção de plasmídeo de DNA em células de mamíferos com alta taxa de transferência usando um nanodispensador líquido acústico em uma placa de 384 poços, mesmo para não especialistas no campo. Este método publicado recentemente1 permite executar tanto quanto 384 condições independentes da multiplexação e do transfection do ADN do plasmídeo em um experimento, em menos de 1 h. os únicos ou os experimentos do Cotransfection eram bem sucedidos, alcançando uns 100% próximos Cotransfection dentro da população transfected das pilhas. Esse protocolo facilita a transfecção porque a maioria dos passos tediosos, demorados e propensos a erros agora são acionados por software (consulte a Figura 1 para obter uma visão geral). Mais esforços foram feitos para desenvolver ferramentas dedicadas para melhorar a facilidade de uso, evitando erros humanos durante o processo geral e para promover a transfecção bem-sucedida, mesmo para os não-especialistas no campo. O protocolo descrito inclui uma planilha de macro "fácil de usar" que desenvolvemos a fim de gerenciar 384 condições de transfecção independentes com possibilidades de multiplexação de até quatro plasmídos em cada poço. A macro gera automaticamente modelos de placas de origem para carregar o volume de plasmídeo de DNA esperado de iniciar soluções de estoque e os arquivos necessários para conduzir o software nanodispenser sobre o experimento que foi introduzido. Como a dispensação manual do DNA em uma placa de fonte 384-well é tedioso e propenso a erros, também desenvolvemos um aplicativo baseado em Tablet dedicado para orientar o usuário ao dispensar a solução de DNA de acordo com o modelo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59570/59570fig1v3.jpg"> Figura 1: fluxo de trabalho experimental. Representação esquemática do protocolo de transfecção reversa de alta taxa de transferência automatizada ideal (do experimento experimental para o ensaio biológico personalizado). As etapas manuais são indicadas pelo símbolo da mão e o tempo aproximado para cada etapa é escrito em uma caixa vermelha. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59570/59570fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Muitas experiências Cell-Based começam com o transfection do ADN do plasmídeo, e mesmo se muitos reagentes dedicados foram e estão sendo desenvolvidos ainda para realçar a eficiência do transfection e/ou facilitar o procedimento, muito resta ser feito2,3 , 4. o transfection da pilha do plasmídeo do ADN envolve diversas etapas para alcangar a eficiência elevada, tal como uma tomada complexa inicial, um escape endosomal, e um transporte cytoplasmic ao núcleo5,6. Além de precipitação de cálcio ou técnicas físicas, como eletroporação ou microinjeção usando dispositivos dedicados7, métodos químicos modernos têm focado em melhorar a entrega de células de DNA, reduzindo a citoxicidade celular8, a 9. O uso de lipídios ou polímeros catiônicos formando complexos liposemelhantes e, mais recentemente, os sistemas de química polimérico não-Liposomal tornaram a transfecção mais fácil e eficiente10. Apesar destes desenvolvimentos, o transfection da pilha ainda exige habilidades específicas ser executado exatamente como a maioria destes protocolos físicos ou químicos do transfection exigem cientistas de preparar manualmente cada condição da reação do transfection do ADN, assim prejudicar a taxa de transferência. Para contornar esse problema, os protocolos de transfecção reversa foram desenvolvidos usando reagentes de transfecçãoquímica 11,12,13, permitindoao usuário testar ou combinar vários plasmídos de forma mais rápida. Nestes protocolos, os complexos de ácidos nucleicos com reagentes de transfecção são formados antes da semeadura das células nos complexos. No entanto, esses protocolos inversos ainda são limitados pelo manuseio manual de soluções de DNA e pela combinação de cada uma das condições independentes. Embora seja viável para realizá-los em um formato de placa 96-well, a preparação de DNA e dispensa será tedioso, e provavelmente haverá erros. Quando as quantidades diferentes de diversos plasmídeos do ADN são exigidas e multiplexados com se, o transfection da pilha se torna ainda mais duro de conseguir e mais demorado, e os erros humanos tornam-se completamente inevitáveis. Escalar até o formato da placa 384-well em uma aproximação reversa do transfection, apesar de poucas condições multiplexados do transfection do ADN, transforma-se um desafio impossível devido às seguintes razões. i) as quantidades de ADN, o reagente de transfecção ou os volumes de mistura de reacção a gerir são inferiores a 1 μL para cada poço. II) a multiplexação de plasmídeos para 384 condições independentes torna-se extremamente complicada. A entrega em cada um dos 384 poços também é III) altamente demorado e IV) propenso a erros. De fato, dispensar a solução certa nos poços esperados é difícil de administrar, pois os volumes baixos já dispensados não permitem o monitoramento visual entre os poços vazios e já preenchidos. v) finalmente, há um alto risco de secagem da mistura por evaporação antes que as células sejam adicionadas devido ao tempo necessário para realizar as etapas de dispensação necessárias. Em resumo, o fator limitante para configurar ensaios de transfecção de plasmídeo de DNA de alta taxa de transferência parece ser a miniaturização do ensaio, o que implica a multiplexação e o gerenciamento de baixo volume que não podem ser manuseados manualmente, mas também dificilmente alcançáveis em um maneira de confiança por manipuladores líquidos Peristatic clássicos.
Como prova de dificuldade para automatizar tais ensaios e obter alta taxa de transferência, apenas algumas tentativas de automatização da transfecção foram publicadas até agora: um formato de placa de 96 poços usando um dispositivo comercial de manuseio de líquidos e uma precipitação de fosfato de cálcio14 e, mais recentemente, um reagente lipoplex, e um chip microfluídico permitindo 280 Transfections independentes15 , mas exigindo habilidades especializadas neste campo. Outro método, acoustophoresis, permitindo a levitação líquida e conduzindo à manipulação e à mistura fluidas, foi usado para executar o transfection do ADN em 24-aos formatos da placa de 96-well16. Embora viável, esta aproximação sofre de uma taxa de transferência extremamente baixa como a mistura das pilhas com a mistura do transfection do ADN exige uma incubação de 60 s para cada único ponto antes de semear. Isso implica uma duração de pelo menos 96 min para uma placa completa de 96 poços. Além disso, este protocolo está longe de ser passíveis ao público geral dos biólogos como este trabalho foi feito com um dispositivo interno projetado e manufacturado que não esteja atualmente disponível no mercado. Pelo contrário, nos últimos anos, uma tecnologia de dispensação acústica baseada em software fácil de usar surgiu com dispositivos de dispensador de nanovolume. Usando a energia acústica focalizada, estes dispositivos permitem a ejeção firmemente controlada de volumes líquidos pequenos de 2,5 nL a 500 nL de uma placa da fonte a um destino um17. Esta tecnologia, chamada de ejeção de gotas acústicas (ADE), tem inúmeras vantagens: é totalmente automatizada, sem contato, tipless, precisa, precisa e altamente reprodutível, e tem uma alta taxa de transferência18. Primeiro dedicado à entrega de soluções de dimetil sulfóxido (DMSO), as configurações foram aprimoradas para dispensar buffers aquosos19. Os nanodispensadores acústicos, então, parecem adequados para protocolos de transfecção de células reversas e podem contornar a maioria das limitações manuais acima mencionadas. Como nenhuma tentativa do transfection do plasmídeo foi descrita previamente usando esta tecnologia, nós avaliamos recentemente a adequação de um sistema de distribuição acústico-baseado para executar o transfection reverso da pilha.
Aproveitando-se da taxa de transferência do nanodispenser e da facilidade de utilização, nós otimizamos um protocolo reverso do transfection para pilhas de HeLa por testes cruzados diversos parâmetros que podem influenciar o transfection do ADN em uma placa 384-well, única, a saber, a quantidade total do ADN e concentração inicial do ADN da fonte, volume do diluente, reagente do transfection, e número de pilhas da propagação. O protocolo desenvolvido contorna as limitações manuais acima descritas do Transfection da pilha e apresenta diversas vantagens sobre outras tentativas automatizadas do transfection. Em primeiro lugar, é miniaturizado, permitindo assim o reagente de transfecção rentável, salvando as preparações de plasmídeo de DNA e o reagente de transfecção. Em segundo lugar, é muito mais elevado-throughput e reprodutível do que o protocolo manual (mesmo para novatos), porque o transfection de uma placa inteira de 384-well pode ser conseguido em menos de 1 h. Finalmente, é orientado por software, permitindo o controle da quantidade de DNA dispensado e a multiplexação de vários plasmídos. Certamente, agradecimentos ao software do nanodispenser (tabela dos materiais), o usuário pode elaborar uma planta do estudo para controlar os volumes a ser dispensados de uma placa bem definida da fonte a um destino um.
O protocolo aqui apresentado destina-se principalmente àqueles que têm acesso a um nanodispenser e gostaria de configurar experimentos de transfecção em alta taxa de transferência, mas também para aqueles que desejam otimizar rapidamente seus parâmetros de transfecção para um determinado tipo de célula por Aplicando este protocolo para Cross-Test vários parâmetros em alta taxa de transferência. Na verdade, mostramos que os parâmetros otimizados identificados com este protocolo de nanoescala podem ser transpostos para experimentos de transfecção de maior escala e manuais. Finalmente, como o reagente do transfection usado no protocolo atual permite o transfection do ADN ou do siRNA de acordo com o fabricante, o protocolo é igualmente do interesse àqueles que visam executar aproximações da disposição para o superexpressão ou o knockdown do gene. As placas do destino pré-enchidas com o ADN podem ser conservadas até 7 dias antes do uso em um ensaio do transfection sem perda de eficácia, que é uma outra vantagem do seguinte protocolo para este tipo da aplicação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1226px;" width="1224">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">384LDV Microplate</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;">LP-0200</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">384-well Microplate &#956;Clear Black</td>
			<td style="width:363px;">Greiner</td>
			<td style="width:202px;">781906</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:363px;">Sigma</td>
			<td style="width:202px;">A9393-5G</td>
			<td style="width:291px;">Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Android Tablet</td>
			<td style="width:363px;">Samsung</td>
			<td style="width:202px;">Galaxy Note 8</td>
			<td style="width:291px;">used to guide the user while the source plate manual dispense</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Aniospray Surf 29</td>
			<td style="width:363px;">Anios</td>
			<td style="width:202px;">2421073</td>
			<td style="width:291px;">disinfectant to clean the MicroFlo head</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Columbus software</td>
			<td style="width:363px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">image analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">10566032</td>
			<td style="width:291px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:371px;">Echo Cherry Pick 1.5.3 software</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Echo550</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">ADE-based dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">16000044</td>
			<td style="width:291px;">to add in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:363px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:202px;">HT501128-4L</td>
			<td style="width:291px;">to fix cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:363px;">ATCC</td>
			<td style="width:202px;">HeLa (ATCC&#174; CCL-2&#8482;)</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">H3570</td>
			<td style="width:291px;">10 mg/mL Solution in Water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">INCell Analyzer 6000</td>
			<td style="width:363px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:202px;">29043323</td>
			<td style="width:291px;">automated laser-based confocal imaging platform</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:371px;">LB medium</td>
			<td style="width:363px;">Thermoischer Scientific 
			LB Broth Base (Lennox L Broth Base)&#174;, powder</td>
			<td style="width:202px;">12780052</td>
			<td style="width:291px;">culture medium for bacteria growth</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Lysis Buffer (A2)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740912.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">MicroFlo 10&#181;L cassette</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7170013</td>
			<td style="width:291px;">to use with the Microflo Dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">MicroFlo 1&#956;L cassette</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7170012</td>
			<td style="width:291px;">to use with the Microflo Dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">MicroFlo Dispenser</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7171000</td>
			<td style="width:291px;">peristaltic pump-based liquid handler device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Microvolume spectrophotometer</td>
			<td style="width:363px;">Denovix</td>
			<td style="width:202px;">DS-11 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:291px;">Measure the DNA concentration of samples</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:371px;">mVenus plasmid</td>
			<td style="width:363px;">mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Neutralization Buffer (A3)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740913.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">NucleoSpin Plasmid kit</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740588.50</td>
			<td style="width:291px;">used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">31985070</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">optional Wash bufferWash Buffer (A4)</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740914.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;">orbital shaker&#160;</td>
			<td style="width:363px;">incubated large capacity shaker</td>
			<td style="width:202px;">444-7084</td>
			<td style="width:291px;">Used to grow bacteria under gentle agitation and 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">15140122</td>
			<td style="width:291px;">10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">10010001</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Plasmid mini-columns</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740499.250</td>
			<td style="width:291px;">Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Resuspension Buffer (A1)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740911.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">RNAse A</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740505</td>
			<td style="width:291px;">Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">tdTomato-N1 plasmid</td>
			<td style="width:363px;">Addgene</td>
			<td style="width:202px;">Plasmid #54642</td>
			<td style="width:291px;">Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">TransIT-X2 Dynamic Delivery System</td>
			<td style="width:363px;">Mirus Bio</td>
			<td style="width:202px;">MIR 6000</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Wash Buffer (AW)</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740916.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">3D printer</td>
			<td style="width:363px;">Creality</td>
			<td style="width:202px;">CR10S</td>
			<td style="width:291px;">used to print the plate adapter</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:371px;">Blender Software&#160;</td>
			<td style="width:363px;">&#160;https://www.blender.org/ 
			Free software under GNU General Public License (GPL).</td>
			<td style="width:202px;">version 2.79b</td>
			<td style="width:291px;">used to design the plate adapter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput dna plasmid multiplexing and transfection using acoustic nanodispensing technology

O transfection da pilha, indispensável para muitos estudos biológicos, exige controlar muitos parâmetros para uma realização exata e bem sucedida. Na maioria das vezes realizada em baixa taxa de transferência, é, além disso demorado e propenso a erros, ainda mais quando multiplexar vários plasmídos. Nós desenvolvemos um método fácil, rápido, e exato executar o transfection da pilha em um layout da placa de 384 poços usando a tecnologia acústica da ejeção da gota (ADE). O dispositivo do nanodispenser usado neste estudo é baseado nesta tecnologia e permite a entrega precisa do nanovolume na alta velocidade de uma placa do poço da fonte a um destino um. Pode dispensar e Multiplex o ADN e o reagente do transfection de acordo com uma folha de cálculo pré-definidos. Aqui nós apresentamos um protocolo óptimo para executar o transfection do plasmídeo da elevado-produção baseada em ADE que faz possível alcangar uma eficiência de até 90% e um Cotransfection de quase 100% em experimentos do Cotransfection. Estendemos o trabalho inicial propondo uma macro baseada em planilhas de fácil utilização, capaz de gerenciar até quatro plasmímetros/poços de uma biblioteca contendo até 1.536 plasmímetros diferentes e uma aplicação de guia de pipetagem baseada em Tablets. A macro projeta os modelos necessários da placa de origem (s) e gera os arquivos prontos para uso para o aplicativo baseado em Tablet e nanodispenser. O protocolo da transfecção de quatro etapas envolve i) um diluente dispensar com um manipulador líquido clássico, II) distribuição e multiplexação do plasmídeo, III) um reagente do transfection dispense pelo nanodispenser, e IV) chapeamento de pilha nos poços pré-preenchidos. O controle software-baseado descrito da multiplexação e do transfection do plasmídeo do Ade permite mesmo especialistas no campo de executar um transfection de pilha de confiança em uma maneira rápida e segura. Esse método permite a rápida identificação de configurações ideais para um determinado tipo de célula e pode ser transposta para abordagens de maior escala e manual. O protocolo facilita aplicações, como a proteína ORFeome humana (conjunto de quadros de leitura abertos [ORFs] em um genoma) ou a validação da função gênica baseada em CRISPR-Cas9, em estratégias de triagem não agrupadas.

fIn para determinar se a tecnologia ADE poderia ser usada para um protocolo de transfecção reversa automatizada, monitoramos a eficiência da transfecção celular por microscopia de fluorescência, usando um tdTomato fluorescente vermelho expressando plasmídeo. Primeiramente visando determinar os melhores parâmetros de transfecção, diferentes volumes de diluentes e quantidades totais de DNA foram testados em cruz. O volume de diluente foi utilizado para permitir que as gotas de DNA...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology at JoVE.com

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Multiplexação e transfecção de plasmídeo de DNA de alta produtividade usando tecnologia de Nanodosagem acústica

Este protocolo descreve o transfection do plasmídeo da elevado-produção de pilhas de mamíferos em uma placa 384-well usando a tecnologia acústica da ejeção da gota. O tempo-demorado, erro-propenso a dispensar e Multiplexing do ADN, mas igualmente a dispensação do reagente do transfection, são software-driven e executado por um dispositivo do nanodispenser. As células são então semeadas nestes poços pré-preenchidos.

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

O protocolo de transfecção baseado em NanoDispenser desenvolvido para descrever neste vídeo representa o primeiro método de transfecção de alto rendimento, que permite que até mesmo iniciantes no campo sejam bem sucedidos. Isso é fácil na técnica de alta produtividade permite a transfecção de células com 384 condições independentes. A partir de agora, o método é de baixo custo devido ao nano volume de reagente necessário.Para definir os melhores parâmetros de transfecção para todo o tipo de célula, sugerimos manter a concentração de DNA de origem constante, e usando quantidades variadas de DNA transfectado, reagente de transfecção e número de células. Para dispensar a suspensão celular de 40 microliter, monte um de 10 microliter no dispositivo manipulador líquido peristáltico e prepare um programa apropriado. Primeiro, ajuste o parâmetro da taxa de fluxo para baixo para dispensar as células com uma baixa velocidade para evitar promover danos potenciais às células por puro estresse e alto impacto na parte inferior dos poços.Em seguida, ajuste a altura de dispensação para 11,43 milímetros. A altura deve ser alta o suficiente para diminuir o impacto celular na parte inferior dos poços durante o processo de dispensação, mas baixa o suficiente para evitar a retenção das gotículas na cabeça de distribuição. Em seguida, ajuste a altura clara da placa para 16 milímetros para permitir o deslocamento livre da cabeça de distribuição sobre a placa após dispensar cada linha.Controle visualmente as configurações adequadas da altura da cabeça do manipulador de líquido peristáltico. Certifique-se de que não há gotas retidas nas pontas de distribuição durante a dispensação. Verifique também se a cabeça está alta o suficiente para permitir o deslocamento da cabeça após a dispensa de cada linha.Para gerar picklists para conduzir a dispensação de ADE, uma macro de planilha amigável foi desenvolvida para gerenciar quantidades de DNA e misturar até quatro plasmídeos em um formato de placa de poço 384. Os volumes ideais são pré-preenchidos em algumas células da planilha, mas podem ser alterados. Nos campos cor-de-rosa, o reagente de transfecção, ou valor da mistura TR, é definido para 500 nanoliters.O valor mínimo de volume nos poços de placa de origem é definido para quatro microliters, e o volume máximo nos poços de placa de origem para 11,25 microliters. Digite 100 nanogramas por microliter dna concentrações iniciais nos campos azuis correspondentes ao DNA subjacente. Em seguida, insira a quantidade de DNA desejada nos campos cinza e verde correspondente aos 384 poços da placa.Digite os valores e nomes plasmídeos e certifique-se de que a mesma ortografia seja usada se o mesmo plasmídeo tiver que ser transfeinado em vários poços. Clique em gerar picklists para verificar os valores inseridos e, se solicitado, corrija as células cheias de laranja indicando erros ou volumes que não podem ser manipulados pelo NanoDispenser. Se nenhum for detectado, a macro gerará o guia de dispensação de poços 384, o arquivo picklist de DNA e o arquivo picklist TR a partir de dados coletados nas folhas correspondentes.Imprima o modelo da folha da placa de origem para visualizar os poços a serem preenchidos antes de dispensar. Nomes plasmídeos e volumes mínimos de preenchimento são indicados. Os volumes da mistura de reagentes transfeccionados que serão preenchidos nos seguintes poços, são indicados como TR e destacados em verde.Para preparar a placa de origem do DNA, diluir o plasmídeo de DNA armazenado para 100 nanogramas por microliter usando água destilada. Agora, calibrar a grade do poço 384 para as dimensões da placa. Abra o aplicativo 384 Well Pipetting Guide em um tablet.Coloque o local de origem na grade na tela inferior. No menu de calibração superior esquerdo, clique em mais ou menos para melhorar ou reduzir o tamanho da grade e dos poços, a fim de ajustar os poços verdes aos quatro poços de canto da placa. Usando fita dupla face, monte o adaptador de placa impresso em 3D na tela para evitar movimentos da placa de origem durante a dispensação.Se necessário, mova a grade calibrada usando as setas de rotação e para cima, para baixo, para a direita, para a esquerda para ajustar a grade à posição da placa. Uma vez que a grade e os tamanhos dos poços estejam devidamente calibrados e localizados, marque a caixa de calibração de bloqueio. Clique no arquivo e abra o Guia 384-Wells-Pipetting.arquivo csv. Siga as instruções de tela para dispensar manualmente o volume indicado de plasmídeo na concentração especificada no poço branco destacado que corresponde ao destino adequado da placa esperada. Use menos ou mais setas para voltar ou mais no processo de distribuição de DNA.Pare de dispensar ao atingir a primeira solução de reagente de transfecção para carregar. Uma vez que as dispensas de DNA estejam terminadas, remova a placa de origem do adaptador. Se várias placas de origem forem preenchidas, coloque uma nova placa de origem no adaptador e siga as instruções de dispensação.Centrifugar as placas de origem preenchidas com DNA para garantir o nivelamento líquido adequado e remover bolhas que levem à imprecisão nas transferências de base ADE. Agora, execute uma pesquisa para controlar os volumes manualmente dispensados. No PC NanoDispenser, execute o programa NanoDispenser.Vá para a guia de diagnóstico, marque a caixa de saída da placa de origem, carregue a placa de origem no suporte da placa e marque para entrar na placa. Quando solicitado, selecione 384LDV_AQ_B2 para definir o NanoDispenser no modo de dispensação de buffer aquoso e pressione OK. Selecione o levantamento no menu diversos. E clique no lançamento.Selecione os poços pré-preenchidos para analisar e clique no botão go. Verifique se os volumes medidos correspondem aos esperados e certifique-se de que nenhum poço tenha sido carregado com volumes de mais de 12 microliters. Prime a tubulação com meio livre de soro preenchendo um novo vaso estéril com 10 mililitros de meio de soro pré-aquecido livre e submergindo o organizador do tubo nele.Pressione o botão prime do manipulador de líquido peristáltico por cerca de 10 segundos. Certifique-se de que a ponta não está entupida inspecionando visualmente o fluxo da cabeça de distribuição. Coloque uma placa de cultura 384 estéril no porta-placas de manipulador de líquido peristáltico e remova sua tampa.Execute o programa pré-calibrado para dispensar um microliter em cada poço da placa 384. O tempo de dispensação é de aproximadamente oito segundos. Em seguida, substitua a tampa da placa 384.Para configurar a dispensação de DNA orientada pelo ADE, execute o software picklist. Defina os 384 poços originários de 384LDV. Defina o dispositivo para o modo de distribuição de buffer aquoso, selecionando 384LDV_AQ_B2.E os tipos de placas de destino para Greiner_384PS_781096. Throughput de transferência otimizado un-tick. Selecione a guia de lista de escolhas.Clique na importação. E selecione o arquivo DNA_Picklist_CSV. Em seguida, clique em jogar e salve o protocolo.Clique em simular para realizar uma simulação das dispensas do programa para garantir que a lista de escolhas corresponda ao design experimental esperado. Clique no botão executar e inicie o programa de dispensação. Quando solicitado, insira a placa de origem solicitada.E então a placa de destino no NanoDispenser. Para configurar a dispensação do reagente transfecção, trabalhe em um armário de biossegurança para diluir reagente de transfecção lipopoliplex em meio livre de soro para uma concentração final de um x e vórtice do tubo. Dispense imediatamente a mistura TR de acordo com a placa de origem predefinida digna pela macro e usando a aplicação da guia de pipetação de poços pré-calibrada 384.Após a dispensação de TR, realize uma pesquisa para controlar os volumes carregados de TR como feito antes para o DNA carregado. Selecione a mistura de reação de transfecção pré-preenchido poços para analisar. E clique no botão go.Verifique se os volumes medidos correspondem aos esperados. E garantir que nenhum poço tenha sido carregado com volumes de mais de 12 microliters. Agora realize uma redefinição da lista de coleta de DNA no software picklist.Verifique se os parâmetros do dispositivo ainda estão definidos como buffers aquosos. Digite os tipos corretos de placas de origem e destino. Na guia lista de escolhas, clique em redefinir para limpar a lista de amostras.Em seguida, clique em importar e escolha o TR_Picklist. Arquivo CSV. Clique em play.Salve o protocolo se solicitado e realize uma simulação das dispensações da mistura de reagentes de transfecção do programa para garantir o design adequado clicando no botão simular. Como feito anteriormente, depois de clicar no botão executar e iniciar o programa de dispensação coloque a placa de origem e, em seguida, a placa de destino no NanoDipsenser como solicitado. Para dispensar as células, encha um novo vaso estéril com a suspensão celular preparada e mexa-a para evitar sedimentação levando à imprecisão e densidade celular.Insira o organizador do tubo na solução. Em seguida, pressione o botão primo até que a suspensão da célula comece a sair da cabeça de distribuição. Certifique-se de que a ponta não está entupida inspecionando visualmente o fluxo da cabeça de distribuição durante a descarga e certifique-se de que cada tubo esteja carregado com suspensão celular.Agora, carregue o DNA e tr encheu 384 placa de destino bem no porta-placas de líquido peristáltico e remova sua tampa. Execute o programa pré-calibrado para dispensar 40 microliters da suspensão celular na placa completa 384. O tempo de dispensação é de cerca de 45 segundos.Por fim, substitua a tampa da placa 384. A transfecção de células HeLa usando reagente lipopoliplex foi bem sucedida. As quantidades de DNA que variavam de cinco a 30 nanogramas mostraram a mesma eficiência e até 90% de transfecção celular em um volume diluído de microliteres.Em contrapartida, os valores mais elevados resultaram em uma redução abrupta no percentual de células transfeinadas. Vários volumes diluídos que variavam de 15 nanoliteiros a quatro microlitres foram testados e um microliter foi identificado como a melhor condição. Para aumentar ainda mais o rendimento deste protocolo, dois métodos eficientes de armazenamento de DNA foram testados, ou seja, o armazenamento seco da placa ou do armazenamento congelado.Ambos os métodos de armazenamento não levaram a resultados significativamente diferentes da solução de DNA recém-dispensada armazenada por até sete dias. Como a transfecção plasmática geralmente emprega pelo menos dois plasmídeos diferentes, a capacidade de multiplexagem de DNA deste protocolo foi examinada usando as melhores condições identificadas. A proteína fluorescente vermelha tdTomato anteriormente utilizada expressando plasmídeo foi modificada para expressar mVenus uma proteína fluorescente amarela brilhante e ambos foram então usados em tentativas de cotransfecção.Análise de células fluorescentes vermelhas ou verdes mostrou que a eficiência da transfecção era de cerca de 80% No entanto, quase 100% das células vermelhas também foram cotransfectadas com o mVenus expressando plasmídeo como pode ser visto na análise de imagem baseada em software representativo. Uma vez que os DNAs tenham sido dispensados na placa de origem. Realize uma pesquisa para garantir que os volumes esperados tenham sido carregados e não excedam 12 microliters.Ao dispensar o reagente de transfecção na placa de origem, tente evitar bolhas, pois a centrifugação de subplacas resultará em uma perda completa da eficácia da transfecção. Este método pode ser aplicado a experimentos biológicos, crimes e transfecção e é adequado para a maioria que pode ser realizado em um formato de placa 384 bem. Uma transfecção à prova completa abre caminho para novas aplicações, como a base de plasmídeos conhecidas por abordagens não-triagem de gesso mais nítidas que permitem o monitoramento do afeto intermitente atualmente incapaz de ser classificado em estratégias ruins.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

A plataforma robótica de alta capacidade de protoplastos Isolamento e Transformação

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Genética

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Perturbações de circulação miRNAs na Síndrome do Cólon Irritável detectada usando um multiplexado de alta capacidade: Plataforma Gene Expression

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Dieta de alta gordura alimentar e ensaio de triacilglicerol alto Throughput em Drosophila Melanogaster.

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Geração de imunoprecipitação da cromatina nativa sequenciamento de bibliotecas para análise da densidade nucleossoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Isolamento do DNA robusto e construção de biblioteca de sequenciamento de alto rendimento para espécimes de herbário

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Identificação de alta produtividade de combinações de drogas sinérgica pelo método de sobreposição2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

O método de conjunto de réplica: Uma abordagem de alto rendimento para quantitativamente medida Caenorhabditis elegans expectativa de vida

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Extração de DNA do elevado-throughput e genotipagem de larvas de Zebrafish 3dpf por Fin recorte

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Índice competitivo baseado em PCR digital para análise de alta produtividade de aptidão em Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...