Name: high-throughput dna plasmid multiplexing and transfection using acoustic nanodispensing technology
Uploaded: 2019-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology at JoVE.com

Los autores revelaron un recibo del siguiente apoyo financiero para la investigación, autoría y/o publicación de este artículo: Inserm, Lille University, Lille Pasteur Institute, Conseil Régional du Nord, y PRIM-HCV1 y 2 (Péle de Recherche Interdisciplinaire sur le Médicament), Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-EQPX-04-01), el Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) y la Comunidad Europea (ERC-STG INTRACELLTB no 260901). Los autores desean dar las gracias al Dr. S. Moureu, al Dr. B. Villemagne, al Dr. R. Ferru-Clément y al Dr. H. Groult por su revisión crítica y correcciones del manuscrito.

1. Preparaciones anticipadas
<ol><li>Preparación de los programas de manipulación de líquidos peristálticos NOTA: Para los pasos de dosificación de diluyentes y células del protocolo, se debe preparar un programa dedicado, teniendo en cuenta la altura del cabezal dispensador a la placa utilizada y la intención del paso.<ol>
<li>Para el paso de dispensación de diluyente de 1 l, monte un cassette de 1 l y prepare un programa con los ajustes descritos en los pasos 1.1.1.1 y 1.1.1.2.<ol>
<li>Aju...

<ol>
	<li>Colin, B., Deprez, B., Couturier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+DNA+Plasmid+Transfection+Using+Acoustic+Droplet+Ejection+Technology.">High-Throughput DNA Plasmid Transfection Using Acoustic Droplet Ejection Technology.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R &#38; D. , 2472555218803064 (2018).</li><li>Mirus Bio. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optimising Transfection Performance. , (2019).</li><li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Factors Influencing Transfection Efficiency | Thermo Fisher Scientific - FR. , (2019).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).</li><li>Figueroa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanistic+investigation+exploring+the+differential+transfection+efficiencies+between+the+easy-to-transfect+SK-BR3+and+difficult-to-transfect+CT26+cell+lines.">A mechanistic investigation exploring the differential transfection efficiencies between the easy-to-transfect SK-BR3 and difficult-to-transfect CT26 cell lines.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 36 (2017).</li><li>Kirchenbuechler, I., Kirchenbuechler, D., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+cationic+lipid-based+transfection+and+cell+division.">Correlation between cationic lipid-based transfection and cell division.</a> Experimental Cell Research. 345 (1), 1-5 (2016).</li><li>Zhang, Z., Qiu, S., Zhang, X., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+DNA+electroporation+for+primary+human+T+cell+engineering.">Optimized DNA electroporation for primary human T cell engineering.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), 4 (2018).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+activity+and+the+mechanism+of+pDNA-complexes+based+on+the+hybrid+of+low-generation+PAMAM+and+branched+PEI-1.8k.">Transfection activity and the mechanism of pDNA-complexes based on the hybrid of low-generation PAMAM and branched PEI-1.8k.</a> Molecular bioSystems. 9 (12), 3175-3186 (2013).</li><li>Bos, A. 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El establecimiento y la optimización de un método preciso de transfección de alto rendimiento para una línea celular determinada requieren que los científicos sigan algunos parámetros clave descritos en esta sección. Recomendamos encarecidamente comenzar con los valores recomendados en todo el protocolo, ya que estos ajustes optimizados para las células HeLa también demostraron ser eficientes para las células HEK. Sin embargo, como los mejores parámetros pueden depender de las líneas celulares y los reactivos...

El método presentado aquí describe en detalle cómo realizar multiplexación y transfección de plásmido de ADN en células de mamíferos a alto rendimiento utilizando un nanodispensador líquido de base acústica en una placa de 384 pocillos, incluso para no especialistas en el campo. Este método publicado recientemente1 permite realizar hasta 384 condiciones independientes de multiplexación y transfección de ADN plásmido en un experimento, en menos de 1 h. Los experimentos individuales o de cotransfección tuvieron éxito, alcanzando un cotransfección dentro de la población de células transtrinfectadas. Este protocolo facilita la transfección porque la mayoría de los pasos tediosos, lentos y propensos a errores ahora son controlados por software (consulte la figura 1 para obtener una visión general). Se han hecho más esfuerzos para desarrollar herramientas específicas para mejorar la facilidad de uso evitando al mismo tiempo errores humanos durante el proceso general y para promover la transfección exitosa incluso para los no especialistas en la materia. El protocolo descrito incluye una hoja de cálculo macro "fácil de usar" que hemos desarrollado con el fin de gestionar 384 condiciones de transfección independientes con posibilidades de multiplexación de hasta cuatro plásmidos en cada pozo. La macro genera automáticamente plantillas de las placas de origen para cargar el volumen de plásmido de ADN esperado desde el inicio de las soluciones de stock y los archivos necesarios para conducir el software nanodispensador sobre el diseño experimental que se ha introducido. Como la dosificación manual del ADN en una placa fuente de 384 pocillos es tediosa y propensa a errores, también desarrollamos una aplicación dedicada a la tableta para guiar al usuario mientras dispensamos la solución de ADN de acuerdo con la plantilla.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59570/59570fig1v3.jpg"> Figura 1: Flujo de trabajo experimental. Representación esquemática del protocolo automatizado óptimo de transfección inversa de alto rendimiento (desde el diseño experimental hasta el ensayo biológico personalizado). Los pasos manuales se indican mediante el símbolo de la mano y la hora aproximada de cada paso se escribe en un cuadro rojo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59570/59570fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Muchos experimentos basados en células comienzan con la transfección de ADN de plásmido, e incluso si muchos reactivos dedicados han sido y todavía se están desarrollando para mejorar la eficiencia de la transfección y / o facilitar el procedimiento, queda mucho por hacer2,3 , 4. La transfección celular de plásmido de ADN implica varios pasos para alcanzar una alta eficiencia, como una toma compleja inicial, escape endosomal y transporte citoplasmático al núcleo5,6. Además de la precipitación de calcio o técnicas físicas como la electroporación o la microinyección utilizando dispositivos dedicados7, los métodos químicos modernos se han centrado en mejorar la entrega de células de ADN mientras se reduce la toxicidad celular8, 9. El uso de lípidos o polímeros catiónicos que forman complejos liposomas y, más recientemente, sistemas de química polimérica no liposómica ha hecho que la transfección sea más fácil y eficiente10. A pesar de estos avances, la transfección celular todavía requiere habilidades específicas para ser realizadas con precisión, ya que la mayoría de estos protocolos de transfección física o química requieren que los científicos preparen manualmente cada condición de reacción de transfección de ADN, por lo tanto deteriorando el rendimiento. Para evitar este problema, se han desarrollado protocolos de transfección inversa utilizando reactivos de transfección química11,12,13,lo que permite al usuario probar o combinar varios plásmidos de una manera más rápida. En estos protocolos, se forman complejos de ácido nucleico con reactivos de transfección antes de sembrar las células en los complejos. Sin embargo, estos protocolos inversos siguen estando limitados por el manejo manual de las soluciones de ADN y por la combinación de cada una de las condiciones independientes. Aunque es factible realizarlos en un formato de placa de 96 pocillos, la preparación del ADN y los dispensadores serán tediosos, y es probable que haya errores. Cuando se requieren diferentes cantidades de varios plásmidos de ADN y se multiplexan entre sí, la transfección celular se vuelve aún más difícil de lograr y consume más tiempo, y los errores humanos se vuelven bastante inevitables. Escalar hasta el formato de placa de 384 pocillos en un enfoque de transfección inversa, a pesar de las pocas condiciones de transfección de ADN multiplexado, se convierte en un desafío imposible debido a las siguientes razones. i) Las cantidades de ADN, el reactivo de transfección o los volúmenes de mezcla de reacción que se deben manejar son inferiores a 1 l para cada poca. ii) La multiplexación de plásmidos para 384 condiciones independientes se vuelve extremadamente complicada. La entrega en cada uno de los 384 pozos también es iii) muy lento y iv) propenso a errores. De hecho, la dispensación de la solución correcta en los pozos esperados es difícil de gestionar porque los volúmenes bajos ya dispensados no permiten la supervisión visual entre los pozos vacíos y ya llenos. v) Por último, existe un alto riesgo de secado de la mezcla por evaporación antes de que se añadan las células debido al tiempo necesario para realizar los pasos de dosificación necesarios. En resumen, el factor limitante para configurar ensayos de transfección de plaños de ADN de alto rendimiento parece ser la miniaturización del ensayo, lo que implica multiplexación y gestión de bajo volumen que ya no se puede manejar manualmente, pero que tampoco se pueden lograr en un forma fiable por los manipuladores de líquidos peristáticos clásicos.
Como prueba de dificultad para automatizar tales ensayos y obtener un alto rendimiento, sólo unos pocos intentos de automatizar la transfección se han publicado hasta ahora: un formato de placa de 96 pocillos utilizando un dispositivo comercial de manipulación de líquidos y precipitación de fosfato cálcico14 y, más recientemente, un reactivo lipoplex, y un chip microfluídico que permite 280 transfecciones independientes15 pero que requieren habilidades especializadas en este campo. Otro método, la acoustopforesis, que permitía la levitación de líquidos y que conducía a la manipulación y mezcla de fluidos, se utilizó para realizar la transfección de ADN en formatos de placa de 24 a 96 pocillos16. Aunque es factible, este enfoque sufre de un rendimiento extremadamente bajo, ya que la mezcla de células con mezcla de transfección de ADN requiere una incubación de 60 s para cada punto antes de la sembración. Esto implica una duración de al menos 96 minutos para una placa completa de 96 pocillos. Además, este protocolo está lejos de ser susceptible de la audiencia general de los biólogos, ya que este trabajo se realizó con un dispositivo interno diseñado y fabricado que actualmente no está disponible en el mercado. Por el contrario, en los últimos años, una tecnología de dosificación basada en acústica basada en software fácil de usar ha surgido con dispositivos dispensadores de nanovolúmenes. Utilizando energía acústica enfocada, estos dispositivos permiten la expulsión estrechamente controlada de pequeños volúmenes de líquido de 2,5 nL a 500 nL desde una placa de origen hasta un destinode 17. Esta tecnología, llamada eyección de gotas acústicas (ADE), tiene numerosas ventajas: es totalmente automatizada, sin contacto, sin puntas, precisa, precisa y altamente reproducible, y tiene un alto rendimiento18. Primero dedicado a la entrega de soluciones de dimetilsulfóxido (DMSO), los ajustes se han mejorado para dispensar tampones acuosos19. Los nanodispensadores acústicos, entonces, parecen adecuados para los protocolos de transfección de células inversas y podrían eludir la mayoría de las limitaciones manuales antes mencionadas. Como no se describieron previamente los intentos de transfección de plásmidos utilizando esta tecnología, recientemente evaluamos la idoneidad de un sistema de dosificación basado en acústica para realizar la transfección de células inversas.
Aprovechando el rendimiento del nanodispensador y la facilidad de uso, optimizamos un protocolo de transfección inversa para las células HeLa mediante pruebas cruzadas de varios parámetros que pueden influir en la transfección del ADN en una placa única de 384 pocillos, a saber, la cantidad total de ADN y concentración inicial del ADN fuente, volumen diluyente, reactivo de transfección y número de células diseminados. El protocolo desarrollado elude las limitaciones manuales de transfección celular antes descritas y presenta varias ventajas sobre otros intentos de transfección automatizados. En primer lugar, se miniaturiza, lo que permite un reactivo de transfección rentable al ahorrar preparaciones de plásmido de ADN y reactivo de transfección. En segundo lugar, es mucho más alto rendimiento y reproducible que el protocolo manual (incluso para principiantes), ya que la transfección de toda una placa de 384 pocillos se puede lograr en menos de 1 h. Por último, está impulsado por software, permitiendo el control de la cantidad de ADN dispensado y la multiplexación de varios plásmidos. De hecho, gracias al software nanodispenser (Tablade Materiales),el usuario puede elaborar un plan de estudio para controlar los volúmenes a dispensar desde una placa de pozo de origen definida a una placa de destino.
El protocolo presentado aquí está destinado principalmente a aquellos que tienen acceso a un nanodispensador y les gustaría establecer experimentos de transfección a alto rendimiento, pero también para aquellos que quieren optimizar rápidamente sus parámetros de transfección para un tipo de celda dado por aplicando este protocolo para probar varios parámetros a un alto rendimiento. De hecho, hemos demostrado que los parámetros optimizados identificados con este protocolo a nanoescala se pueden transponer a experimentos de transfección manuales y a mayor escala. Por último, dado que el reactivo de transfección utilizado en el presente protocolo permite la transfección de ADN o siRNA según el fabricante, el protocolo también es de interés para aquellos que tienen como objetivo realizar enfoques de matriz para la sobreexpresión genética o derribo. Las placas de destino precargadas con ADN se pueden conservar hasta 7 días antes de su uso en un ensayo de transfección sin pérdida de eficacia, que es otra ventaja del siguiente protocolo para este tipo de aplicación.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1226px;" width="1224">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">384LDV Microplate</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;">LP-0200</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">384-well Microplate &#956;Clear Black</td>
			<td style="width:363px;">Greiner</td>
			<td style="width:202px;">781906</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:363px;">Sigma</td>
			<td style="width:202px;">A9393-5G</td>
			<td style="width:291px;">Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Android Tablet</td>
			<td style="width:363px;">Samsung</td>
			<td style="width:202px;">Galaxy Note 8</td>
			<td style="width:291px;">used to guide the user while the source plate manual dispense</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Aniospray Surf 29</td>
			<td style="width:363px;">Anios</td>
			<td style="width:202px;">2421073</td>
			<td style="width:291px;">disinfectant to clean the MicroFlo head</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Columbus software</td>
			<td style="width:363px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">image analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">10566032</td>
			<td style="width:291px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:371px;">Echo Cherry Pick 1.5.3 software</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Echo550</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">ADE-based dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">16000044</td>
			<td style="width:291px;">to add in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:363px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:202px;">HT501128-4L</td>
			<td style="width:291px;">to fix cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:363px;">ATCC</td>
			<td style="width:202px;">HeLa (ATCC&#174; CCL-2&#8482;)</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">H3570</td>
			<td style="width:291px;">10 mg/mL Solution in Water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">INCell Analyzer 6000</td>
			<td style="width:363px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:202px;">29043323</td>
			<td style="width:291px;">automated laser-based confocal imaging platform</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:371px;">LB medium</td>
			<td style="width:363px;">Thermoischer Scientific 
			LB Broth Base (Lennox L Broth Base)&#174;, powder</td>
			<td style="width:202px;">12780052</td>
			<td style="width:291px;">culture medium for bacteria growth</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Lysis Buffer (A2)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740912.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">MicroFlo 10&#181;L cassette</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7170013</td>
			<td style="width:291px;">to use with the Microflo Dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">MicroFlo 1&#956;L cassette</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7170012</td>
			<td style="width:291px;">to use with the Microflo Dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">MicroFlo Dispenser</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7171000</td>
			<td style="width:291px;">peristaltic pump-based liquid handler device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Microvolume spectrophotometer</td>
			<td style="width:363px;">Denovix</td>
			<td style="width:202px;">DS-11 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:291px;">Measure the DNA concentration of samples</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:371px;">mVenus plasmid</td>
			<td style="width:363px;">mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Neutralization Buffer (A3)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740913.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">NucleoSpin Plasmid kit</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740588.50</td>
			<td style="width:291px;">used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">31985070</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">optional Wash bufferWash Buffer (A4)</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740914.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;">orbital shaker&#160;</td>
			<td style="width:363px;">incubated large capacity shaker</td>
			<td style="width:202px;">444-7084</td>
			<td style="width:291px;">Used to grow bacteria under gentle agitation and 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">15140122</td>
			<td style="width:291px;">10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">10010001</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Plasmid mini-columns</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740499.250</td>
			<td style="width:291px;">Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Resuspension Buffer (A1)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740911.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">RNAse A</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740505</td>
			<td style="width:291px;">Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">tdTomato-N1 plasmid</td>
			<td style="width:363px;">Addgene</td>
			<td style="width:202px;">Plasmid #54642</td>
			<td style="width:291px;">Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">TransIT-X2 Dynamic Delivery System</td>
			<td style="width:363px;">Mirus Bio</td>
			<td style="width:202px;">MIR 6000</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Wash Buffer (AW)</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740916.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">3D printer</td>
			<td style="width:363px;">Creality</td>
			<td style="width:202px;">CR10S</td>
			<td style="width:291px;">used to print the plate adapter</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:371px;">Blender Software&#160;</td>
			<td style="width:363px;">&#160;https://www.blender.org/ 
			Free software under GNU General Public License (GPL).</td>
			<td style="width:202px;">version 2.79b</td>
			<td style="width:291px;">used to design the plate adapter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput dna plasmid multiplexing and transfection using acoustic nanodispensing technology

La transfección celular, indispensable para muchos estudios biológicos, requiere controlar muchos parámetros para un logro preciso y exitoso. La mayoría de las veces se realiza a bajo rendimiento, además es lento y propenso a errores, aún más cuando multiplexa varios plásmidos. Hemos desarrollado un método fácil, rápido y preciso para realizar la transfección celular en un diseño de placa de 384 pocillos utilizando la tecnología de eyección de gotas acústicas (ADE). El dispositivo de nanodispensador utilizado en este estudio se basa en esta tecnología y permite la entrega precisa de nanovolúmenes a alta velocidad desde una placa de pozo de origen a una placa de destino. Puede dispensar y multiplexar ADN y reactivo de transfección de acuerdo con una hoja de cálculo prediseñada. Aquí presentamos un protocolo óptimo para realizar la transfección de plásmido de alto rendimiento basada en ADE que permite alcanzar una eficiencia de hasta el 90% y una cotransfección de casi el 100% en experimentos de cotransfección. Ampliamos el trabajo inicial proponiendo una macro basada en hojas de cálculo fácil de usar, capaz de administrar hasta cuatro plásmidos/pozos de una biblioteca que contiene hasta 1.536 plásmidos diferentes, y una aplicación de guía de pipeteo basada en tabletas. La macro diseña las plantillas necesarias de las placas de origen y genera los archivos listos para usar para la aplicación basada en nanodispensador y tableta. El protocolo de transfección de cuatro pasos implica i) un diluyente dispense con un manipulador de líquidos clásico, ii) distribución y multiplexación de plásmidos, iii) un reactivo de transfección dispensando por el nanodispensador, y iv) chapado celular en los pozos precargados. El control basado en software descrito de multiplexación y transfección de plástidos ADE permite incluso a los no especialistas en el campo realizar una transfección celular confiable de una manera rápida y segura. Este método permite una rápida identificación de la configuración óptima para un tipo de celda determinado y se puede transponer a enfoques manuales y de mayor escala. El protocolo facilita aplicaciones, como la proteína ORFeome humana (conjunto de marcos de lectura abiertos [ORF] en un genoma) o la validación de la función génica basada en CRISPR-Cas9, en estrategias de cribado no agrupadas.

fPara determinar si la tecnología ADE podría utilizarse para un protocolo automatizado de transfección inversa, monitoreamos la eficiencia de la transfección celular mediante microscopía de fluorescencia, utilizando un plásmido de expresión tdTomato fluorescente rojo. En primer lugar con el objetivo de determinar los mejores parámetros de transfección, diferentes volúmenes de diluyente y cantidades totales de ADN fueron probados en crucigé. El volumen diluyente se utilizó para...

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High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Multiplexación y transfección de plasmión de ADN de alto rendimiento mediante tecnología de nanodispensación acústica

Este protocolo describe la transfección de plásmido de alto rendimiento de células de mamíferos en una placa de 384 pocillos utilizando tecnología de eyección de gotas acústicas. La dispensación y multiplexación de ADN, que consume mucho tiempo y propensa a errores, pero también la dosificación del reactivo de transfección, son impulsadas por software y realizadas por un dispositivo de nanodispensador. Las células son sembradas en estos pozos precargados.

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

El protocolo de transfección basado en NanoDispenser desarrollado para describir en este video representa el primer método de transfección fácil de usar y de alto rendimiento que permite que incluso los principiantes en el campo tengan éxito. Esto es fácil en la técnica de alto rendimiento permite la transfección de la célula con 384 condición independiente. A partir de ahora, el método es de bajo costo debido al nano volumen de reactivo necesario.Para definir los mejores parámetros de transfección para todo el tipo de célula, sugerimos mantener constante la concentración de ADN de origen y utilizar cantidades variables de ADN trans infectado, reactivo de transfección y número de células. Para dispensar la suspensión de 40 celdas de microlitro, monte un casete de 10 microlitrotros en el dispositivo de manipulación de líquido peristáltico y prepare un programa adecuado. En primer lugar, ajuste el parámetro de caudal a bajo para dispensar células con una velocidad baja para evitar promover el daño potencial a las células por estrés total y alto impacto en la parte inferior de los pozos.A continuación, ajuste la altura de dispensación a 11,43 milímetros. La altura debe ser lo suficientemente alta como para reducir el impacto celular en la parte inferior de los pozos durante el proceso de dosificación, pero lo suficientemente baja como para evitar la retención de las gotas en el cabezal dispensador. A continuación, ajuste la altura clara de la placa a 16 milímetros para permitir el desplazamiento libre del cabezal dispensador sobre la placa después de dispensar cada fila.Controle visualmente los ajustes adecuados de la altura del cabezal del manipulador de líquido peristáltico. Asegúrese de que no se retienen gotas en las puntas de dosificación durante la dispensación. Compruebe también que el cabezal es lo suficientemente alto como para permitir el desplazamiento de la cabeza después de dispensar cada fila.Para generar listas de selección para impulsar la ade-dispensación, se desarrolló una macro de hoja de cálculo fácil de usar para gestionar las cantidades de ADN y mezclar hasta cuatro plásmidos en un formato de placa de 384 pozos. Los volúmenes óptimos se rellenan previamente en algunas celdas de la hoja de cálculo, pero se pueden cambiar. En los campos rosados, el reactivo de transfección, o valor de mezcla TR, se establece en 500 nanolitros.El valor de volumen mínimo en los pozos de placa de origen se establece en cuatro microlitros, y el volumen máximo en los pozos de placa de origen a 11,25 microlitros. Introduzca 100 nanogramos por MICROlitro DE ADN iniciando concentraciones en los campos azules correspondientes al ADN subyacente. A continuación, introduzca la cantidad de ADN deseada en los campos gris y verde correspondientes a los 384 pozos de la placa.Introduzca las cantidades y los nombres de plásmido y asegúrese de que se utiliza la misma ortografía si el mismo plásmido tiene que ser trans infectado en varios pozos. Haga clic en generar listas de selección para verificar los valores introducidos y, si se solicita, corrija las celdas rellenas de naranja indicando errores o volúmenes que NanoDispenser no puede controlar. Si no se detecta ninguno, la macro generará la guía de dispensación de pozos 384, el archivo de lista de selección de ADN y el archivo de lista desplegable TR a partir de los datos recopilados en las hojas correspondientes.Imprima la plantilla desde la hoja de placa de origen para visualizar los pozos que se deben rellenar antes de dispensar. Se indican los nombres de plásmido y los volúmenes de relleno mínimos. Los volúmenes de mezcla de reactivos de transfección que se rellenarán en los siguientes pomos, se indican como TR y se resaltan en verde.Para preparar la placa de origen de ADN, diluya el plásmido de ADN almacenado a 100 nanogramos por microlitro utilizando agua destilada. Ahora, calibre la rejilla del pozo 384 a las dimensiones de la placa. Abra la aplicación 384 Well Pipetting Guide en una tableta.Coloque el lugar de origen en la cuadrícula de la pantalla inferior. En el menú de calibración superior izquierdo, haga clic en más o menos para mejorar o reducir el tamaño de la cuadrícula y los pozos con el fin de ajustar los pozos verdes a los cuatro pozos de esquina de la placa. Con cinta adhesiva de doble cara, monte el adaptador de placa impresa 3D en la pantalla para evitar movimientos de la placa de origen durante la dosificación.Si es necesario, mueva la rejilla calibrada con las flechas de rotación y los botones hacia arriba, abajo, derecha y izquierdo para ajustar la cuadrícula a la posición de la placa. Una vez que la rejilla y los tamaños de los pozos estén correctamente calibrados y localizados, marque la caja de calibración de bloqueo. Haga clic en el archivo y abra la guía 384-Wells-Pipetting.csv. Siga las instrucciones de la pantalla para dispensar manualmente el volumen indicado de plásmido en la concentración especificada en el pozo resaltado en blanco que corresponda al destino objetivo adecuado de la placa esperada. Utilice flechas menos o más para retroceder o más en el proceso de dosificación de ADN.Deje de dispensar al llegar a la primera solución de reactivo de transfección para cargar. Una vez finalizadas las dispensaciones de ADN, retire la placa de origen del adaptador. Si se van a llenar varias placas de origen, coloque una nueva placa de origen en el adaptador y siga las instrucciones de dosificación.Centrifugar las placas de origen llenas de ADN para asegurar una nivelación adecuada del líquido y para eliminar las burbujas que conducen a la imprecisión en las transferencias de base ade. Ahora, ejecute una encuesta para controlar los volúmenes dispensados manualmente. En el PC NanoDispenser, ejecute el programa NanoDispenser.Vaya a la pestaña de diagnóstico, marque la bandeja de salida de la placa de origen, cargue la placa de origen en el soporte de la placa y marque para entrar en la placa. Cuando se le solicite, seleccione 384LDV_AQ_B2 para establecer nanoDispenser en el modo de dosificación de búfer acuoso y pulse OK. Seleccione la encuesta en el menú varios. Y haga clic en el lanzamiento.Seleccione los pozos precargados para analizar y haga clic en el botón ir. Compruebe que los volúmenes medidos coincidan con los esperados y asegúrese de que no se han cargado pozos con volúmenes de más de 12 microlitros. Preparar el tubo con medio libre de suero llenando un nuevo recipiente estéril con 10 mililitros de medio libre de suero precalentado y sumergiendo el organizador del tubo en él.Pulse el botón primo del manipulador de líquido peristáltico durante unos 10 segundos. Asegúrese de que la punta no esté obstruida inspeccionando visualmente el flujo del cabezal dispensador. Coloque una placa de cultivo estéril de 384 pozos en el soporte de placa de manipulador de líquido peristáltico y retire su tapa.Ejecute el programa precalibrado para dispensar un microlitro en cada pozo de la placa de 384 pozos. El tiempo de dosificación es de aproximadamente ocho segundos. A continuación, reemplace la tapa de la placa de pozo 384.Para configurar la dispensación de ADN impulsada por ADE, ejecute el software de lista de selección. Establezca los pozos 384 en 384LDV. Ajuste el dispositivo al modo de dispensación de búfer acuoso seleccionando 384LDV_AQ_B2.Y los tipos de placa de destino para Greiner_384PS_781096. Un-tick optimizado el rendimiento de la transferencia. Seleccione la pestaña Lista de selección.Haga clic en importar. Y seleccione el archivo DNA_Picklist_CSV. A continuación, haga clic en reproducir y guarde el protocolo.Haga clic en simular para realizar una simulación de las dispensaciones del programa para asegurarse de que la lista de selección coincide con el diseño experimental esperado. Haga clic en el botón de ejecución e inicie el programa de dispensación. Cuando se le pregunte, inserte la placa de origen solicitada.Y luego la placa de destino en el NanoDispenser. Para configurar la dispensación del reactivo de transfección, trabaje en un gabinete de bioseguridad para diluir el reactivo de transfección lipopolíplex en un medio libre de suero a una concentración final de una x y vórtice el tubo. Dispensar inmediatamente la mezcla TR de acuerdo con la placa de origen predefinida digna de la macro y utilizando la aplicación de guía de pipeteo de 384 pozos precalibrada.Después de la dosificación de TR, realice una encuesta para controlar los volúmenes cargados TR como se hizo antes para el ADN cargado. Seleccione la mezcla de reacción de transfección de pozos precaridos para analizar. Y haga clic en el botón ir.Compruebe que los volúmenes medidos coincidan con los esperados. Y asegúrese de que no se han cargado pozos con volúmenes de más de 12 microlitros. Ahora realice un restablecimiento de la lista de selección de ADN en el software de la lista de selección.Verifique que los parámetros del dispositivo todavía estén fijados a los buffers acuosos. Introduzca los tipos de placa de origen y de destino correctos. En la pestaña lista de selección, haga clic en Restablecer para borrar la lista de muestra.A continuación, haga clic en importar y elija el TR_Picklist. CSV. Haga clic en jugar.Guarde el protocolo si se le solicita y realice una simulación de las dispensaciones de mezcla de reactivos de transfección del programa para garantizar un diseño adecuado haciendo clic en el botón simular. Como se hizo anteriormente, después de hacer clic en el botón de ejecución e iniciar el programa de dosificación coloque la placa de origen y luego la placa de destino en el NanoDipsenser según lo solicitado. Para dispensar las células, llene un nuevo recipiente estéril con la suspensión celular preparada y revuelva para evitar la sedimentación que conduce a la imprecisión y la densidad celular.Inserte el organizador del tubo en la solución. Luego, presione el botón primo hasta que la suspensión de la célula comience a enjuagar desde el cabezal dispensador. Asegúrese de que la punta no esté obstruida inspeccionando visualmente el flujo del cabezal dispensador mientras se vacía y asegúrese de que cada tubo esté cargado con suspensión celular.Ahora, cargue el ADN y la placa de destino de 384 pozos llenos de TR en el portador de placa de manipulador de líquido peristáltico y retire su tapa. Ejecute el programa precalibrado para dispensar 40 microlitros de la suspensión celular en la placa completa de 384 pozos. El tiempo de dosificación es de unos 45 segundos.Por último, reemplace la tapa de la placa de 384 pozos. La transfección de las células de HeLa usando reactivo lipopolyplex fue exitosa. Las cantidades de ADN que oscilaban entre cinco y 30 nanogramos mostraron la misma eficiencia y hasta un 90% de transfección de células a un volumen diluyente de microlitro.Por el contrario, cantidades más altas resultaron en una disminución abrupta en el porcentaje de células trans infectadas. Se probaron varios volúmenes diluyentes que van desde 15 nanolitros hasta cuatro microlitros y se identificó un microlitro como la mejor condición. Para mejorar aún más el rendimiento de este protocolo se probaron dos métodos eficientes de almacenamiento de ADN, a saber, el almacenamiento en seco de la placa o el almacenamiento congelado.Ambos métodos de almacenamiento no dieron lugar a resultados significativamente diferentes a la solución de ADN recién dispensada almacenada durante un máximo de siete días. Como la transfección plasmática suele emplear al menos dos plásmidos diferentes, la capacidad de multiplexación de ADN de este protocolo se examinó utilizando las condiciones mejor identificadas. La proteína fluorescente roja tdTomato utilizada anteriormente que expresa el plásmido fue modificada para expresar mVenus una proteína fluorescente de color amarillo brillante y ambas fueron utilizadas en intentos de cotransfección.El análisis de células positivas fluorescentes rojas o verdes mostró que la eficiencia de la transfección era de alrededor del 80%Sin embargo, casi el 100% de los glóbulos rojos también fueron cotrans infectados con el mVenus expresando plásmido como se puede ver en el análisis de imagen basado en software representativo. Una vez que los DNAs han sido dispensados en la placa de origen. Realice una encuesta para asegurarse de que los volúmenes esperados se han cargado y no superan los 12 microlitros.Durante la dosificación del reactivo de transfección en la placa de origen, trate de evitar burbujas, ya que las subplagas centrifugadoras darán lugar a una pérdida completa de la eficacia de la transfección. Este método se puede aplicar a experimentos biológicos, crímenes y transfección y es adecuado para la mayoría de los que se pueden realizar en un formato de placa de 384 pozos. Una transfección a prueba de fuego allana el camino para nuevas aplicaciones, como el plásmido basado en plásmido conocido por enfoques de no cribado de fundición más nítidos, lo que permite la supervisión del efecto intermitente que actualmente no puede clasificarse en estrategias deficientes.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Una plataforma robótica para de alto rendimiento de protoplastos aislamiento y Transformación

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Investigación

Genética

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Las perturbaciones de circulación miRNAs en el Síndrome del Intestino Irritable detectó utilizando una plataforma de expresión de genes de multiplexado de alto rendimiento

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Alimentación dieta alta en grasas y alto rendimiento Triacylglyceride ensayo en Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generación de inmunoprecipitación de la cromatina nativa secuenciación bibliotecas para el análisis de densidad de nucleosoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robusto de ADN y la secuenciación de alto rendimiento biblioteca construcción de especímenes de herbario

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Alto rendimiento identificación de combinaciones de fármacos sinérgicos por el método de superposición2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

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El método de conjunto de réplica: Un enfoque de alto rendimiento para cuantitativamente medida Caenorhabditis elegans vida útil

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Extracción de ADN de alto rendimiento y genotipificación de 3dpf larvas de pez cebra por recorte de aleta

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Captura de alto rendimiento identificación de secuencias reguladoras de genes utilizando secuenciación de próxima generación de conformación Circular cromosoma (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Indice competitivo basado en PCR digital para el análisis de alta producción de la aptitud en Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...