Name: high-throughput dna plasmid multiplexing and transfection using acoustic nanodispensing technology
Uploaded: 2019-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology at JoVE.com

Yazarlar, bu makalenin araştırma, yazarlık ve/veya yayınlanması için aşağıdaki mali destek makbuzunu açıkladı: ınekm, Lille Üniversitesi, Lille Pasteur Enstitüsü, Conseil régional du Nord, ve PRIM-HCV1 ve 2 (Pôle de Recherche Disiplinler arası sur le médicament), Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-EQPX-04-01), Feder (12001407 (D-AL) Equipex ımaginex BioMed) ve Avrupa Topluluğu (ERC-STG ıNTRACELLTB n ° 260901). Yazarlar, Dr. S. Moureu, Dr. B. Villemagne, Dr. R. ferru-Clément ve Dr. H. Groult 'in kritik incelemelerini ve el yazmasını düzeltmeleri için teşekkür etmek istiyor.

1. önceden preparatlar
<ol><li>Peristaltik sıvı işleyici programlarının hazırlanması Not: protokolün seyreltilme ve hücre dağıtım adımları Için, dağıtım kafasının yüksekliğini kullanılan plakaya ve adım amacını dikkate alarak özel bir program hazırlanmalıdır.<ol>
<li>1 μL seyreltilme adımı için 1 μL kaset bağlayın ve 1.1.1.1 ve 1.1.1.2 adımlarında açıklandığı gibi ayarları içeren bir program hazırlayın.<ol>
<li>Akış hızı parametresini yük...

<ol>
	<li>Colin, B., Deprez, B., Couturier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+DNA+Plasmid+Transfection+Using+Acoustic+Droplet+Ejection+Technology.">High-Throughput DNA Plasmid Transfection Using Acoustic Droplet Ejection Technology.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R &#38; D. , 2472555218803064 (2018).</li><li>Mirus Bio. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optimising Transfection Performance. , (2019).</li><li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Factors Influencing Transfection Efficiency | Thermo Fisher Scientific - FR. , (2019).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).</li><li>Figueroa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanistic+investigation+exploring+the+differential+transfection+efficiencies+between+the+easy-to-transfect+SK-BR3+and+difficult-to-transfect+CT26+cell+lines.">A mechanistic investigation exploring the differential transfection efficiencies between the easy-to-transfect SK-BR3 and difficult-to-transfect CT26 cell lines.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 36 (2017).</li><li>Kirchenbuechler, I., Kirchenbuechler, D., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+cationic+lipid-based+transfection+and+cell+division.">Correlation between cationic lipid-based transfection and cell division.</a> Experimental Cell Research. 345 (1), 1-5 (2016).</li><li>Zhang, Z., Qiu, S., Zhang, X., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+DNA+electroporation+for+primary+human+T+cell+engineering.">Optimized DNA electroporation for primary human T cell engineering.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), 4 (2018).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+activity+and+the+mechanism+of+pDNA-complexes+based+on+the+hybrid+of+low-generation+PAMAM+and+branched+PEI-1.8k.">Transfection activity and the mechanism of pDNA-complexes based on the hybrid of low-generation PAMAM and branched PEI-1.8k.</a> Molecular bioSystems. 9 (12), 3175-3186 (2013).</li><li>Bos, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+semi-automated+high+throughput+transient+transfection+system.">Development of a semi-automated high throughput transient transfection system.</a> Journal of Biotechnology. 180, 10-16 (2014).</li><li>Colosimo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+and+expression+of+foreign+genes+in+mammalian+cells.">Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells.</a> BioTechniques. 29 (2), 314-318 (2000).</li><li>Villa-Diaz, L. G., Garcia-Perez, J. L., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+transfection+efficiency+of+human+embryonic+stem+cells+by+the+incorporation+of+DNA+liposomes+in+extracellular+matrix.">Enhanced transfection efficiency of human embryonic stem cells by the incorporation of DNA liposomes in extracellular matrix.</a> Stem Cells and Development. 19 (12), 1949-1957 (2010).</li><li>Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Reverse transfection method. , WO2001020015A1 (2001).</li><li>Raymond, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+polyethylenimine-mediated+transfection+process+for+large-scale+and+high-throughput+applications.">A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications.</a> Methods (San Diego, CA). 55 (1), 44-51 (2011).</li><li>Junquera, E., Aicart, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+gene+therapy+to+deliver+nucleic+acids+with+multivalent+cationic+vectors.">Recent progress in gene therapy to deliver nucleic acids with multivalent cationic vectors.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 233, 161-175 (2016).</li><li>Woodruff, K., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Microfluidic+Platform+for+Mammalian+Cell+Transfection+and+Culturing.">A High-Throughput Microfluidic Platform for Mammalian Cell Transfection and Culturing.</a> Scientific Reports. 6, 23937 (2016).</li><li>Vasileiou, T., Foresti, D., Bayram, A., Poulikakos, D., Ferrari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+Contactless+Biology:+Acoustophoretic+DNA+Transfection.">Toward Contactless Biology: Acoustophoretic DNA Transfection.</a> Scientific Reports. 6, 20023 (2016).</li><li>Hadimioglu, B., Stearns, R., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+Liquids+with+Sound:+The+Physics+of+Acoustic+Droplet+Ejection+for+Robust+Laboratory+Automation+in+Life+Sciences.">Moving Liquids with Sound: The Physics of Acoustic Droplet Ejection for Robust Laboratory Automation in Life Sciences.</a> Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 4-18 (2016).</li><li>Grant, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+accurate+compound+concentration+in+cell-based+screening:+validation+of+acoustic+droplet+ejection+technology.">Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology.</a> Journal of Biomolecular Screening. 14 (5), 452-459 (2009).</li><li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+That+Enable+Accurate+and+Precise+Nano-+to+Milliliter-Scale+Liquid+Dispensing+of+Aqueous+Reagents+Using+Acoustic+Droplet+Ejection.">Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection.</a> Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 166-177 (2016).</li><li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+protein+palette:+tools+for+cellular+imaging.">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chemical Society Reviews. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li><li>Zielinski, D., Gordon, A., Zaks, B. L., Erlich, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPipet:+sample+handling+using+a+tablet.">iPipet: sample handling using a tablet.</a> Nature Methods. 11 (8), 784-785 (2014).</li><li>Brunner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+dependence+of+gene+transfer+by+lipoplex,+polyplex+and+recombinant+adenovirus.">Cell cycle dependence of gene transfer by lipoplex, polyplex and recombinant adenovirus.</a> Gene Therapy. 7 (5), 401-407 (2000).</li><li>Nii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell-State+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Increases+Transfection+Efficiency.">Single-Cell-State Culture of Human Pluripotent Stem Cells Increases Transfection Efficiency.</a> BioResearch Open Access. 5 (1), 127-136 (2016).</li><li>Noonan, D. J., Henry, K., Twaroski, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Mammalian+Cell-Based+Transient+Transfection+Assay.">A High-Throughput Mammalian Cell-Based Transient Transfection Assay.</a> Signal Transduction Protocols. 284, 051-066 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transfection | TransIT Transfection Reagents | Mirus Bio. , (2015).</li><li>American Type Culture Collection. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> General protocol for transfection of stem cells, primary cells, and continuous cell lines with ATCC TransfeX Transfection Reagent. , (2017).</li><li>American Type Culture Collection. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transfection Reagents for Nucleic Acid Transfer into ATCC Cells. , (2017).</li><li>de Los Milagros Bassani Molinas, M., Beer, C., Hesse, F., Wirth, M., Wagner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+transient+transfection+process+of+HEK-293+suspension+cells+for+protein+production+by+nucleotide+ratio+monitoring.">Optimizing the transient transfection process of HEK-293 suspension cells for protein production by nucleotide ratio monitoring.</a> Cytotechnology. 66 (3), 493-514 (2014).</li><li>Promega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> FuGENE&#174; 6 Transfection Reagent. , (2019).</li><li>Olden, B. R., Cheng, Y., Yu, J. L., Pun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+polymers+for+non-viral+gene+delivery+to+human+T+cells.">Cationic polymers for non-viral gene delivery to human T cells.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 282, 140-147 (2018).</li><li>Park, E., Cho, H. B., Takimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+gene+delivery+into+adipose-derived+stem+cells:+transfection+of+cells+in+suspension+with+the+use+of+a+nuclear+localization+signal+peptide-conjugated+polyethylenimine.">Effective gene delivery into adipose-derived stem cells: transfection of cells in suspension with the use of a nuclear localization signal peptide-conjugated polyethylenimine.</a> Cytotherapy. 17 (5), 536-542 (2015).</li><li>Wood, R. W., Loomis, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+and+biological+effects+of+high-frequency+sound-waves+of+great+intensity.">The physical and biological effects of high-frequency sound-waves of great intensity.</a> The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 4 (22), 417-436 (1927).</li><li>Mamat, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eliminating+Endotoxin+at+the+Source+-+A+Novel+Competent+Cell+Line+with+Modified+Lipopolysaccharide+for+Low-Endotoxin+Plasmid+Production.">Eliminating Endotoxin at the Source - A Novel Competent Cell Line with Modified Lipopolysaccharide for Low-Endotoxin Plasmid Production.</a> , (2014).</li><li>Ivanova, N. V., Kuzmina, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+dry+DNA+storage+and+shipment+at+room+temperature.">Protocols for dry DNA storage and shipment at room temperature.</a> Molecular Ecology Resources. 13 (5), 890-898 (2013).</li><li>Lesnick, J., Lejeune-Dodge, A., Ruppert, N., Jarman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High-Precision Cell Dispensing with the Labcyte Echo&#174; Liquid Handler. , (2017).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+public+genome-scale+lentiviral+expression+library+of+human+ORFs.">A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs.</a> Nature Methods. 8 (8), 659-661 (2011).</li><li>Peng, J., Zhou, Y., Zhu, S., Wei, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screens+in+mammalian+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">High-throughput screens in mammalian cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> The FEBS journal. 282 (11), 2089-2096 (2015).</li></ol>

Belirli bir hücre hattı için doğru bir yüksek verimlilik transfeksiyon yönteminin kurulması ve optimizasyonu, bilim adamlarının bu bölümde açıklanan bazı anahtar parametreleri takip etmesini gerektirir. HeLa hücreleri için en iyi duruma getirilmiş bu ayarlar da HEK hücreleri için verimli olduğu kanıtlanmıştır gibi protokol boyunca önerilen değerlerle başlayarak şiddetle teşvik ediyoruz. Ancak, en iyi parametreler hücre hatları ve transfeksiyon reaktifler bağlı olabilir, optimum koşullar,...

Burada sunulan yöntem, alanda uzman olmayan kişiler için bile 384-Well plakasında akustik bazlı sıvı nanodispenser kullanarak yüksek verim ile meme hücrelerinde DNA plazmid çoğullama ve transfeksiyon gerçekleştirme konusunda ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Bu son yayınlanan Yöntem1 ' den az 1 saat içinde bir deneyde 384 bağımsız plazmid DNA çoğullama ve transfeksiyon koşulları kadar performans sağlar. tek veya kotransfection deneyler başarılı oldu, yakın bir 100% ulaşan nakledilmiş hücreler nüfusu içinde cotransfection. Bu protokol transfeksiyon kolaylaştırır çünkü sıkıcı, zaman alıcı ve hataya eğilimli adımların çoğu artık yazılımla yönetilir (genel bir bakış için bkz. Şekil 1 ). Genel süreç boyunca insan hatalarının önlenmesi ve alanda uzman olmayan kişiler için bile başarılı transfeksiyon teşvik etmek amacıyla kullanım kolaylığı geliştirmek için özel araçlar geliştirmek için daha fazla çaba yapılmıştır. Açıklanan protokol, 384 bağımsız transfeksiyon koşullarını, her bir kuyunda dört plazmid 'e kadar olan çoğullama olanaklarla yönetmek için geliştirdiğimiz "Kullanıcı dostu" bir makro elektronik tablosu içerir. Makro otomatik olarak stok çözümleri ve girilen deneysel tasarım üzerine nanodispenser yazılım sürücü için gerekli dosyaları başlayarak beklenen DNA Plasmid hacmi yüklemek için kaynak plaka (ler) şablonları oluşturur. Bir 384-iyi kaynak plaka el ile DNA dağıtımı gibi sıkıcı ve hata eğilimli, biz de şablona göre DNA çözümü dağıtma sırasında Kullanıcı rehberlik için özel bir tablet tabanlı uygulama geliştirdi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59570/59570fig1v3.jpg"> Şekil 1: deneysel iş akışı. Optimum otomatik yüksek verimlilik ters transfeksiyon protokolünün şematik gösterimi (deneysel tasarımdan özel biyolojik tahlil). Manuel adımlar el sembolüyle belirtilir ve her adım için yaklaşık süre kırmızı kutuda yazılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59570/59570fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
Birçok hücre tabanlı deneyler Plasmid DNA transfeksiyon ile başlar, ve hatta birçok adanmış reaktifler olmuştur ve hala transfeksiyon verimliliği artırmak ve/veya prosedürü kolaylaştırmak için geliştirilmiştir, çok2,3 yapılması kalır , 4. DNA plazmid hücreli transfeksiyon, ilk kompleks alımı, endosomal kaçış ve çekirdek5,6sitoplazmik taşıma gibi yüksek verimliliğe ulaşmak için birkaç adım içerir. Kalsiyum yağış veya özel cihazlar kullanarak mikroenjeksiyon gibi Elektroporasyon ya da fiziksel teknikler yanı sıra7, modern kimyasal yöntemler hücre sitoksisite azaltarak DNA hücre teslim artırılması üzerinde duruldu8, 9' a kadar. Lipozit benzeri kompleksleri oluşturan lipidler veya katyonik polimerlerin kullanımı ve daha son zamanlarda, nonliposomal polimerik Kimya sistemleri transfeksiyon daha kolay ve daha verimli hale gelmiştir10. Bu gelişmelere rağmen, hücre transfeksiyon hala bu fiziksel veya kimyasal transfeksiyon protokollerinin çoğunda bilim adamlarının her DNA transfeksiyon reaksiyonu durumunu el ile hazırlamalarına ihtiyaç duyması için belirli becerilerin doğru şekilde gerçekleştirilmesi gerekir, böylece verimliliği önler. Bu sorunu aşmak için, ters transfeksiyon protokolleri, kullanıcının birkaç plazmid 'i daha hızlı bir şekilde test etmesini veya birleştirmesini sağlayan kimyasal transfeksiyon reaktifler11,12,13kullanılarak geliştirilmiştir. Bu protokollerde, hücrelerde hücreler tohumlama yapmadan önce transfeksiyon reaktifleri ile nüklik asit kompleksler oluşur. Ancak, bu ters protokoller hala DNA çözümlerinin manuel olarak işlenmesi ve her bağımsız koşulların kombinasyonu ile sınırlıdır. Bir 96-Well plaka formatında bunları gerçekleştirmek için mümkün olmasına rağmen, DNA hazırlama ve dağıtır sıkıcı olacak ve orada büyük olasılıkla hata olacaktır. Çeşitli DNA plazmids farklı miktarlarda gerekli ve birbirleri ile Multiplexed olduğunda, hücre transfeksiyon elde etmek ve daha fazla zaman alıcı daha zor olur ve insan hataları oldukça kaçınılmaz hale gelir. Ters transfeksiyon yaklaşımında 384-Well plaka biçimine kadar ölçeklendirme, birkaç Multiplexed DNA transfeksiyon koşullarına rağmen, aşağıdaki nedenlerden dolayı imkansız bir sorun haline gelir. i) yönetmek için DNA miktarları, transfeksiyon reaksiyonu veya reaksiyon karışımı hacimleri her bir kuyu için 1 μL 'den daha düşüktür. ii) 384 için plazmids çoğullama bağımsız koşullar son derece karmaşık hale gelir. 384 kuyuların her birinde teslimat da iii) son derece zaman alıcı ve iv) hata eğilimli. Gerçekten de, beklenen kuyularda doğru çözeltinin dağıtımı, düşük hacimlerin zaten boşaltıldığından, boş ve zaten doldurulmuş kuyular arasında görsel izleme yapılmasına izin vermediğinden yönetmek zordur. v) son olarak, gerekli dağıtım adımlarını gerçekleştirmek için gereken süre nedeniyle hücreler eklenmeden önce buharlaşma ile karışımı kurutma riski yüksektir. Özetle, yüksek verimlilik sağlayan DNA plazmid transfeksiyonunun ayarlanması için sınırlama faktörü, düşük hacimli çoğullama ve el ile artık ele alınamaz ama aynı zamanda pek de ulaşılamaz bir şekilde yönetilebilen tahlil, minyatürleşme gibi görünüyor Klasik peristatik sıvı işleyicileri tarafından güvenilir bir şekilde.
Bir zorluk kanıtı olarak otomatize bu tür ve yüksek verim kazanmak için, sadece birkaç girişimi nakli otomatikleştirmek için şimdiye kadar yayınlandı: bir 96-iyi plaka formatında ticari bir sıvı taşıma cihazı ve kalsiyum fosfat yağış kullanarak14 ve, daha yakın zamanda, lipoplex reaktif ve mikroakışkan çip 280 bağımsız transfeksiyonları15 ancak bu alanda özel beceriler gerektiren sağlar. Başka bir yöntem, akustiği, sıvı Levitation izin ve sıvı manipülasyon ve karıştırma yol, 24-96-Well plaka formatları16DNA transfeksiyon gerçekleştirmek için kullanıldı. Mümkün olsa da, bu yaklaşım, DNA transfeksiyon karışımı olan hücrelerin karıştırılması gibi son derece düşük bir verim muzdarip, tohumlama öncesinde her bir nokta için 60 s inkübasyon gerektirir. Bu, tam bir 96-kuyu plakası için en az 96 dk süresi anlamına gelir. Ayrıca, bu protokol şu anda piyasada mevcut olmayan bir ev tasarımı ve üretilen cihaz ile yapılan bu iş olarak genel biyologlar ' seyirci için izin olmaktan uzak. Aksine, son birkaç yılda, kullanımı kolay bir yazılım odaklı akustik tabanlı dağıtım teknolojisi nano hacim dispenseri cihazları ile ortaya çıkmıştır. Bu cihazlar, odaklı akustik enerjiyi kullanarak, küçük sıvı hacimlerinin sıkı kontrollü şekilde çıkarılmasına 2,5 nL 'den 500 nL 'ye, kaynak plakalı bir17hedefe kadar izin verir. Akustik damlacık ejeksiyon (ADE) adı verilen bu teknolojinin sayısız avantajı vardır: tamamen otomatiktir, temassız, kesin, doğru, hassas ve son derece tekrarlanabilir ve yüksek verim18' e sahiptir. İlk olarak dimetil sulfoxid (DMSO) çözümleri sunmaya adamış, ayarlar sulu tamponlar19dağıtmak için geliştirilmiştir. Akustik nanodispensers, daha sonra, ters hücre transfeksiyon protokolleri için uygun görünüyor ve yukarıda belirtilen manuel sınırlamalar çoğunu aşmak olabilir. Hiçbir Plasmid transfeksiyon girişimleri daha önce bu teknoloji kullanılarak tanımlanmıştır olarak, son zamanlarda ters hücre transfeksiyon gerçekleştirmek için bir akustik tabanlı dağıtım sisteminin uygunluğu değerlendirilmiştir.
Nanodispenser verimi ve kullanım kolaylığı yararlanarak, biz bir 384 üzerinde DNA transfeksiyon etkileyebilecek çeşitli parametreler Cross-Testing ile HeLa hücreleri için bir ters transfeksiyon Protokolü optimize-iyi, tek plaka, yani, toplam DNA miktarı ve Kaynak DNA başlangıç konsantrasyonu, seyreltme hacmi, transfeksiyon reaktif, ve yayılma hücrelerinin sayısı. Gelişmiş protokol, hücre transfeksiyonunun yukarıda açıklanan manuel sınırlamalarını kısıtladı ve diğer otomatik transfeksiyon girişimleri üzerinde çeşitli avantajlar sunar. İlk olarak, bu minyatür, böylece DNA plazmid preparatları ve transfeksiyon reaktif tasarrufu ile maliyet-etkili transfeksiyon reaktif sağlar. İkincisi, bu çok daha yüksek verimlilik ve manuel protokol daha (yeni başlayanlar için bile), tüm 384-Well plaka transfeksiyon olarak daha az 1 saat içinde elde edilebilir daha tekrarlanabilir olduğunu. Son olarak, yazılım odaklı, dağıtılmaktadır DNA miktarı ve çeşitli plazmids çoğullama kontrol sağlar. Nitekim, nanodispenser yazılımı sayesinde (malzeme tablosu), Kullanıcı bir hedef bir tanımlanan kaynak iyi plaka dağıtılacak hacimleri kontrol etmek için bir çalışma planı ayrıntılı olabilir.
Burada sunulan protokol özellikle bir nanodispenser erişimi olanlar için tasarlanmıştır ve yüksek verim transfeksiyon deneyler kurmak istiyorum, aynı zamanda hızlı bir şekilde belirli bir hücre türü için transfeksiyon parametrelerini optimize etmek isteyenler için yüksek verimlilik çeşitli parametreler çapraz test etmek için bu protokol uygulama. Nitekim, bu nano protokolüyle tanımlanan optimize edilmiş parametrelerin daha büyük ölçekli ve manuel transfeksiyon deneylerine aktarılmasını gösteriyoruz. Son olarak, mevcut protokolde kullanılan transfeksiyon reakajının üreticiye göre DNA veya siRNA transfeksiyonuna izin vermesine bağlı olarak, protokol, gen ekspresyonu veya knockdown için dizi yaklaşımlarını amaçlayan kişilerin de ilgisini çekmekte. DNA ile önceden doldurulan hedef plakalar, bu tür bir uygulama için aşağıdaki protokolün başka bir avantajı olan, etkinlik kaybı olmaksızın transfeksiyon testinde kullanmadan önce 7 güne kadar koruyucu olabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1226px;" width="1224">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">384LDV Microplate</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;">LP-0200</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">384-well Microplate &#956;Clear Black</td>
			<td style="width:363px;">Greiner</td>
			<td style="width:202px;">781906</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:363px;">Sigma</td>
			<td style="width:202px;">A9393-5G</td>
			<td style="width:291px;">Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Android Tablet</td>
			<td style="width:363px;">Samsung</td>
			<td style="width:202px;">Galaxy Note 8</td>
			<td style="width:291px;">used to guide the user while the source plate manual dispense</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Aniospray Surf 29</td>
			<td style="width:363px;">Anios</td>
			<td style="width:202px;">2421073</td>
			<td style="width:291px;">disinfectant to clean the MicroFlo head</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Columbus software</td>
			<td style="width:363px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">image analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">10566032</td>
			<td style="width:291px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:371px;">Echo Cherry Pick 1.5.3 software</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Echo550</td>
			<td style="width:363px;">Labcyte</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">ADE-based dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">16000044</td>
			<td style="width:291px;">to add in cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:363px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:202px;">HT501128-4L</td>
			<td style="width:291px;">to fix cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:363px;">ATCC</td>
			<td style="width:202px;">HeLa (ATCC&#174; CCL-2&#8482;)</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">H3570</td>
			<td style="width:291px;">10 mg/mL Solution in Water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">INCell Analyzer 6000</td>
			<td style="width:363px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:202px;">29043323</td>
			<td style="width:291px;">automated laser-based confocal imaging platform</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:371px;">LB medium</td>
			<td style="width:363px;">Thermoischer Scientific 
			LB Broth Base (Lennox L Broth Base)&#174;, powder</td>
			<td style="width:202px;">12780052</td>
			<td style="width:291px;">culture medium for bacteria growth</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Lysis Buffer (A2)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740912.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">MicroFlo 10&#181;L cassette</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7170013</td>
			<td style="width:291px;">to use with the Microflo Dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">MicroFlo 1&#956;L cassette</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7170012</td>
			<td style="width:291px;">to use with the Microflo Dispenser</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">MicroFlo Dispenser</td>
			<td style="width:363px;">Biotek Instruments Inc</td>
			<td style="width:202px;">7171000</td>
			<td style="width:291px;">peristaltic pump-based liquid handler device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Microvolume spectrophotometer</td>
			<td style="width:363px;">Denovix</td>
			<td style="width:202px;">DS-11 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:291px;">Measure the DNA concentration of samples</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:371px;">mVenus plasmid</td>
			<td style="width:363px;">mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid</td>
			<td style="width:202px;"></td>
			<td style="width:291px;">Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Neutralization Buffer (A3)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740913.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">NucleoSpin Plasmid kit</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740588.50</td>
			<td style="width:291px;">used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">31985070</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">optional Wash bufferWash Buffer (A4)</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740914.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;">orbital shaker&#160;</td>
			<td style="width:363px;">incubated large capacity shaker</td>
			<td style="width:202px;">444-7084</td>
			<td style="width:291px;">Used to grow bacteria under gentle agitation and 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">15140122</td>
			<td style="width:291px;">10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:363px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:202px;">10010001</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Plasmid mini-columns</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740499.250</td>
			<td style="width:291px;">Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Resuspension Buffer (A1)&#160;</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740911.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">RNAse A</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740505</td>
			<td style="width:291px;">Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">tdTomato-N1 plasmid</td>
			<td style="width:363px;">Addgene</td>
			<td style="width:202px;">Plasmid #54642</td>
			<td style="width:291px;">Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">TransIT-X2 Dynamic Delivery System</td>
			<td style="width:363px;">Mirus Bio</td>
			<td style="width:202px;">MIR 6000</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:371px;">Wash Buffer (AW)</td>
			<td style="width:363px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:202px;">740916.1</td>
			<td style="width:291px;">Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">3D printer</td>
			<td style="width:363px;">Creality</td>
			<td style="width:202px;">CR10S</td>
			<td style="width:291px;">used to print the plate adapter</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:371px;">Blender Software&#160;</td>
			<td style="width:363px;">&#160;https://www.blender.org/ 
			Free software under GNU General Public License (GPL).</td>
			<td style="width:202px;">version 2.79b</td>
			<td style="width:291px;">used to design the plate adapter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput dna plasmid multiplexing and transfection using acoustic nanodispensing technology

Birçok biyolojik çalışmada vazgeçilmez olan hücre transfeksiyonu, doğru ve başarılı bir başarı için birçok parametreyi kontrol etmesini gerektirir. Çoğu zaman düşük verim olarak gerçekleştirilen, dahası zaman alıcı ve hata eğilimli, hatta daha çok zaman çeşitli plazmids çoğulma. Akustik damlacık ejeksiyon (ADE) teknolojisini kullanarak 384-kuyu plaka mizanpajında hücre transfeksiyonunu gerçekleştirmek için kolay, hızlı ve doğru bir yöntem geliştirdik. Bu çalışmada kullanılan nanodispenser cihazı, bu teknolojiye dayanmaktadır ve kaynak kuyu plakasına kadar yüksek hızda hassas nanohacim teslimatını bir hedefe sağlar. Önceden tasarlanmış bir elektronik tabloya göre, DNA ve transfeksiyon reakajlarını dağıtabilir. Burada, ADE tabanlı yüksek verim Plasmid transfeksiyonunu gerçekleştirmek için optimal bir protokol sunuyoruz ve bu da% 90 ' e kadar bir verimliliğe ve cotransfection deneylerinde yaklaşık% 100 ' lik bir kotransfeksiyona ulaşmayı mümkün kılıyor. Biz bir Kullanıcı dostu elektronik tablo tabanlı makro, en fazla dört plazmids/kuyuları 1.536 farklı plazmids ve tablet tabanlı pipetleme Kılavuzu uygulaması içeren bir kütüphaneden yönetmek mümkün teklif ederek ilk işi uzatmak. Makro, kaynak plakanın gerekli şablonunu (s) tasarlar ve nanodispenser ve tablet tabanlı uygulama için kullanıma hazır dosyaları oluşturur. Dört adımda transfeksiyon protokolü, i) klasik bir sıvı işleyici, ii) Plasmid dağılımı ve multiplexing, iii) bir transfeksiyon reakajının nanodispenser tarafından dağıtılması ve iv) ön doldurulmuş kuyularda hücre kaplamasını içerir. Ade Plasmid çoğullama ve transfeksiyon açıklanan yazılım tabanlı kontrol, hızlı ve güvenli bir şekilde güvenilir bir hücre transfeksiyon gerçekleştirmek için alanında bile uzman olmayan sağlar. Bu yöntem, belirli bir hücre türü için en iyi ayarların hızlı tanımlanması sağlar ve daha yüksek ölçekli ve el ile yaklaşımlar aktarılabilir. Protokol, insan ORFeome proteini (genom açık okuma çerçeveleri [ORFs] seti) ifadesi veya CRISPR-Cas9 tabanlı gen fonksiyon doğrulama gibi uygulamaları, havuzlu tarama stratejilerinde kolaylaştırır.

ADE teknolojisi otomatik bir ters transfeksiyon protokolü için kullanılabilir olup olmadığını belirlemek için fIn sipariş, biz floresan microkopi ile hücre transfeksiyon verimliliği izlenen, kırmızı floresan tdTomato plazmid ifade kullanarak. İlk olarak en iyi transfeksiyon parametrelerinin belirlenmesine yönelik olarak, farklı seyreltme hacimleri ve toplam DNA miktarı çapraz test edildi. Seyreltme hacmi, bir kez dispensed DNA damlacıkları izin için kullanılan, ön ...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology at JoVE.com

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Akustik Nanodispensing teknolojisini kullanarak yüksek verim DNA Plasmid multiplexing ve transfeksiyon

Bu protokol, akustik damlacık fırlatma teknolojisini kullanarak 384-Well plakasında memelinin hücrelerinin yüksek verim Plasmid transfeksiyonunu açıklar. Zaman alıcı, hataya eğilimli DNA dağıtımı ve çoğullama, aynı zamanda transfeksiyon reaktif dispenpleme, yazılım odaklı ve bir nanodispenser cihaz tarafından gerçekleştirilir. Hücreler daha sonra bu önceden doldurulmuş kuyuların içinde tohumlandı.

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

NanoDispenser tabanlı transfeksiyon protokolü bu videoda açıklamak için geliştirilen ilk kullanıcı dostu, yüksek iş lenme transfeksiyon yöntemi alanında bile yeni başlayanlar başarılı olmasını sağlar temsil eder. Bu yüksek iş yapma tekniği kolaydır 384 bağımsız durum ile hücre transfeksiyon sağlar. Şu andan itibaren, yöntem gerekli reaktif nano hacmi nedeniyle düşük maliyetlidir.Tüm hücre tipi için en iyi transfeksiyon parametrelerini tanımlamak için, kaynak DNA konsantrasyonu sabit tutmak öneririz, ve transfected DNA değişen miktarlarda kullanarak, transfeksiyon reagent, ve hücre sayısı. 40 mikrolitrelik hücre süspansiyonunu dağıtmak için peristaltik sıvı işleyici cihazına 10 mikrolitrelik bir kaset monte edin ve uygun bir program hazırlayın. İlk olarak, akış hızı parametresini düşük hızda hücreleri dağıtmak için ayarlayın ve kuyuların alt kısmında ki aşırı stres ve yüksek etki yle hücrelere olası zararı teşvik edin.Daha sonra, dağıtım yüksekliğini 11,43 milimetreye ayarlayın. Yükseklik dağıtım işlemi sırasında kuyuların altındaki hücre etkisini azaltmak için yeterince yüksek olmalıdır, ancak dağıtım başında damlacıkların tutulmasını önlemek için yeterince düşük. Daha sonra, her satırı dağıttıktan sonra dağıtım kafasının plaka üzerinde serbest çeşnisi olmasını sağlamak için plaka net liğini 16 milimetreye ayarlayın.Peristaltik sıvı işleyici kafa yüksekliğinin uygun ayarlarını görsel olarak kontrol edin. Dağıtım sırasında dağıtım uçlarında damla tutulmadığından emin olun. Ayrıca, başın her satırı dağıttıktan sonra başın yer değiştirmesine izin verecek kadar yüksek olduğunu da doğrulayın.ADE dağıtımını sağlamak için picklists oluşturmak için, DNA miktarlarını yönetmek ve 384 kuyu plaka biçiminde dört plazmidi karıştırmak için kullanıcı dostu bir elektronik tablo makrosu geliştirilmiştir. En iyi birimler elektronik tablonun bazı hücrelerinde önceden doldurulur, ancak değiştirilebilir. Pembe alanlarda transfeksiyon reaktifi veya TR karışım değeri 500 nanolitre olarak ayarlanır.Kaynak plaka kuyularında minimum hacim değeri dört mikrolitreye, kaynak plakadaki maksimum hacim ise 11,25 mikrolitreye ayarlanır. Altta yatan DNA'ya karşılık gelen mavi alanlarda mikrolitre DNA'sı başına 100 nanogram girin. Daha sonra, plakanın 384 kuyuya karşılık gelen gri ve yeşil alanlara istenilen DNA miktarını girin.Miktarları ve plazmid adlarını girin ve aynı plazmidin birkaç kuyuda transfekteritedilmesi gerekiyorsa aynı yazımın kullanıldığından emin olun. Girilen değerleri doğrulamak için picklists oluştur'a tıklayın ve istenirse, NanoDispenser tarafından işlenemeyen hataları veya birimleri belirten turuncu dolu hücreleri düzeltin. Hiçbiri algılanmazsa, makro 384 iyi dağıtım kılavuzu, DNA toplama listesi dosyası ve ilgili sayfalarda toplanan verilerden TR toplama listesi dosyası oluşturur.Dağıtımdan önce doldurulacak kuyuları görselleştirmek için şablonu kaynak plaka sayfasından yazdırın. Plazmid adları ve minimum dolgu hacimleri belirtilir. Aşağıdaki kuyularda doldurulacak transfeksiyon reaktif karışım hacimleri TR olarak gösterilir ve yeşil renkte vurgulanır.DNA kaynak plakasını hazırlamak için, distile su kullanarak mikrolitre başına 100 nanograma kadar depolanan DNA plazmidini seyreltin. Şimdi, 384 kuyu ızgarasını plaka boyutlarına göre ayarla. Tablette 384 Kuyu Pipetleme Kılavuzu Uygulamasını açın.Kaynak yeri alt ekrana ızgaraya yerleştirin. Sol üst kalibrasyon menüsünde, yeşil kuyuları plakanın dört köşekuyularına ayarlamak için ızgara ve kuyuların boyutunu geliştirmek veya azaltmak için artı veya eksi'yi tıklatın. Çift taraflı bant kullanarak, dağıtım sırasında kaynak plaka hareketlerini önlemek için ekrana 3D baskılı plaka adaptörü monte edin.Gerekirse, kılavuz okları ve yukarı, aşağı, sağ, sol düğmeleri kullanarak kalibre ızgarayı plaka konumuna ayarlamak için hareket ettirin. Izgara ve kuyu boyutları düzgün kalibre edildikten ve bulunduğunda, kilit kalibrasyon kutusunu işaretleyin. Dosyaya tıklayın ve 384-Wells-Pipetting-Guide'ı açın.csv dosyası. Belirtilen konsantrasyonda belirtilen plazmid hacmini, beklenen plakanın uygun hedef hedefine karşılık gelen beyaz vurgulu kuyuya manuel olarak dağıtmak için ekran yönergelerini izleyin. DNA dağıtım işleminde geri veya daha ileri gitmek için eksi veya artı oklar kullanın.Yüklemek için ilk transfeksiyon reaktif çözeltisi ulaştıktan sonra dağıtım durdurun. DNA dağıtımı tamamlandıktan sonra, kaynak plakayı bağdaştırıcıdan çıkarın. Birkaç kaynak plakası doldurulacaksa, bağdaştırıcıya yeni bir kaynak plakası yerleştirin ve dağıtım yönergelerini uygulayın.Uygun sıvı tesviyesini sağlamak ve ADE baz transferlerinde hataya yol açan kabarcıkları temizlemek için DNA dolu kaynak plakaları santrifüj edin. Şimdi, el ile dağıtılan hacimleri kontrol etmek için bir anket çalıştırın. NanoDispenser PC'de NanoDispenser programını çalıştırın.Tanı sekmesine gidin, kaynak plaka çıkış kutusunu işaretleyin, kaynak plakayı plaka tutucuya yükleyin ve plakaya girmek için işaretleyin. İstendiğinde, NanoDispenser'ı sulu arabellek dağıtım moduna ayarlamak için 384LDV_AQ_B2 seçin ve Tamam tuşuna basın. Çeşitli menüde anket seçin. Ve başlatmak için tıklayın.Analiz etmek için önceden doldurulmuş kuyuları seçin ve git düğmesine tıklayın. Ölçülen birimlerin beklenenlerle eşleşip, 12 mikrolitreden fazla hacimle kuyu yüklenmediğinden emin olun. 10 mililitre önceden ısıtılmış serumsuz ortam la yeni bir steril kap doldurarak ve tüp organizatörü ne batmış serum suz orta ile tüp prime.Peristaltik sıvı işleyicisinin ana düğmesine yaklaşık 10 saniye basın. Dağıtım başlığından gelen akışı görsel olarak inceleyerek ucun tıkanmamış olduğundan emin olun. Peristaltik sıvı işleyici plaka taşıyıcıüzerine steril 384 kuyu kültür plakası yerleştirin ve kapağını çıkarın.384 kuyu plakasının her bir kuyununda bir mikrolitre dağıtmak için önceden kalibre edilmiş programı çalıştırın. Dağıtım süresi yaklaşık sekiz saniyedir. Sonra 384 iyi plaka kapağını değiştirin.ADE güdümlü DNA dağıtımını kurmak için seçici yazılımı çalıştırın. 384LDV kaynaklı 384 kuyu ayarlayın. 384LDV_AQ_B2 seçerek aygıtı sulu arabellek dağıtım moduna ayarlayın.Ve hedef plaka türleri Greiner_384PS_781096. Onay işaretini yok etmek için en iyi leştirilmiş aktarım iş bakışını. Liste seç sekmesini seçin.Alma'ya tıklayın. Ve DNA_Picklist_CSV dosyasını seçin. Sonra, play tıklayın ve protokolü kaydedin.Seçim listesinin beklenen deneysel tasarımla eşleştiğinden emin olmak için program dağıtımlarının simülasyonunu gerçekleştirmek için benzetme'ye tıklayın. Çalıştır düğmesine tıklayın ve dağıtım programını başlatın. Sorulduğunda, istenen kaynak plakayı takın.Ve sonra NanoDispenser'daki hedef plaka. Transfeksiyon reaktif idamasını ayarlamak için, serumsuz ortamdalipopoplyplex transfeksiyon reaktifini 1 x son konsantrasyona ve tüpü girdap haline getirmek için bir biyogüvenlik kabininde çalışın. TR karışımını, makro tarafından önceden tanımlanmış kaynak plakasına göre ve önceden kalibre edilmiş 384 kuyu borulama kılavuzu uygulamasını kullanarak hemen dağıtın.TR dağıtımını takiben, yüklü DNA için daha önce yapıldığı gibi TR yüklü hacimleri kontrol etmek için bir anket yapın. Analiz etmek için transfeksiyon reaksiyonu karışımı önceden doldurulmuş kuyuları seçin. Ve git düğmesine tıklayın.Ölçülen birimlerin beklenen hacimle eşleşin. Ve hiçbir kuyunun 12 mikrolitreden fazla hacimle yüklenmediğinden emin olun. Şimdi seçim listesi yazılımında DNA toplama listesinin sıfırını gerçekleştirin.Aygıt parametrelerinin hala sulu arabelleklere ayarlı olduğundan doğrulayın. Doğru kaynak ve hedef plaka türlerini girin. Seçim listesi sekmesinde, örnek listeyi temizlemek için sıfırla'yı tıklatın.Sonra içe aktarma tıklayın ve TR_Picklist seçin. CSV dosyası. Oyuna tıklayın.İstenirse protokolü kaydedin ve simüle düğmesine tıklayarak uygun tasarımı sağlamak için program transfection reagent karışım dağıtımlarının bir simülasyonunu gerçekleştirin. Daha önce olduğu gibi, çalıştır düğmesine tıklayıp dağıtım programına başladıktan sonra kaynak plakayı ve varış plakasını istediğiniz gibi NanoDipsenser'e yerleştirin. Hücreleri dağıtmak için, hazırlanan hücre süspansiyon ile yeni bir steril damar doldurun ve yanlışlıklar ve hücre yoğunluğuna yol açan sedimantasyon önlemek için karıştırın.Tüp düzenleyiciyi çözeltiye takın. Ardından, hücre süspansiyonu dağıtım başlığından sifonu çekmeye başlayana kadar asal düğmeye basın. Yıkama sırasında dağıtım kafasının akışını görsel olarak inceleyerek ucun tıkanmamış olduğundan emin olun ve her tüpün hücre süspansiyonuyla yüklendiğinden emin olun.Şimdi, PERistaltic sıvı işleyici plaka taşıyıcı üzerinde DNA ve TR dolu 384 iyi hedef plaka yükleyin ve kapağını çıkarın. Tam 384 kuyu plaka üzerinde hücre süspansiyon 40 mikrolitre dağıtmak için önceden kalibre programı çalıştırın. Dağıtım süresi yaklaşık 45 saniyedir.Son olarak, 384 kuyu plakakapağını değiştirin. Lipopoplyplex reaktif kullanarak HeLa hücrelerinin transfeksiyonu başarılı oldu. Beş ila 30 nanogram arasında değişen DNA miktarları aynı verimi ve bir mikrolitre dilüent hacminde %90'a kadar hücre transfeksiyonu gösterdi.Buna karşılık, daha yüksek miktarlarda transfected hücrelerin yüzdesinde ani bir azalmaya neden oldu. 15 nanolitreile dört mikrolitre arasında değişen çeşitli dilüent hacimleri test edildi ve bir mikrolitre en iyi koşul olarak tanımlandı. Bu protokolün verimini daha da artırmak için iki verimli DNA depolama yöntemi test edildi yani plaka veya dondurulmuş depolama kuru depolama.Her iki depolama yöntemi de yedi güne kadar saklanan yeni dağıtılan DNA çözeltisinden önemli ölçüde farklı sonuçlara yol açmadı. Plazma transfeksiyonu genellikle en az iki farklı plazmid kullandığından, bu protokolün DNA çoklama yeteneği en iyi tanımlanmış koşullar kullanılarak incelendi. Daha önce kullanılan tdTomato kırmızı floresan protein plazmid ifade mVenus parlak sarı floresan protein ifade etmek için modifiye edildi ve her ikisi de daha sonra kotransfection girişimleri nde kullanılmıştır.Kırmızı veya yeşil floresan pozitif hücre analizi transfeksiyon veriminin yaklaşık %80 olduğunu göstermiştir Ancak kırmızı hücrelerin yaklaşık %100'ü temsili yazılım tabanlı görüntü analizinde görülebileceği gibi plazmidifade eden mVenus ile birlikte transtransekted edilmiştir. Kaynak plakaya DNA dağıtıldıktan sonra. Beklenen birimlerin yüklendiğinden ve 12 mikrolitreyi geçmediğinden emin olmak için bir anket yapın.Kaynak plakada transfeksiyon reaktifi dağıtırken, santrifüj alt plakaları transfeksiyon etkinliği tam bir kaybına neden olacak gibi kabarcıklar önlemek için deneyin. Bu yöntem biyolojik deney, suçlar ve transfection uygulanabilir ve çoğunlukla 384 iyi plaka formatında yapılabilir için uygundur. Tam geçirmez transfeksiyon, şu anda kötü stratejilerde sıralanamayan aralıklı etkilerin izlenmesini sağlayan daha net döküm tarama dışı yaklaşımlarla bilinen plazmid bazlı yeni uygulamaların önünü açmaktadır.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

İrritabl Bağırsak Sendromu içinde miRNA&#39;lar Sirkülasyon tedirginlikler bir Çoklanmış Yüksek verim Gen İfadesi Platformu Kullanma Algılanan

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Yüksek yağlı diyet beslenme ve yüksek işlem hacmi Triacylglyceride tahlil Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Sağlam DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak numuneler için

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Sinerjik uyuşturucu kombinasyonları örtüşme2 yöntemi tarafından yüksek üretilen iş tanımlaması

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Yineleme kümesi yöntemi: Bir yüksek-den geçerek yaklaşım kantitatif ölçü Caenorhabditis elegans ömrü

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Salmonella Fitness yüksek verimlilik analizi için dijital PCR tabanlı rekabetçi endeksi

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...