Name: isolation and purification of murine cardiac pericytes
Uploaded: 2019-08-16T12:30:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Amgen Flow Cytometry Core за их помощь в разработке флюорофорных панелей, устранении неполадок и сортировке клеток.

<ol>
	<li>Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial/pericyte+interactions.">Endothelial/pericyte interactions.</a> Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).</li><li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+developmental,+physiological,+and+pathological+perspectives,+problems,+and+promises.">Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li><li>Sengillo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+in+mural+vascular+cells+coincides+with+blood-brain+barrier+disruption+in+Alzheimer's+disease.">Deficiency in mural vascular cells coincides with blood-brain barrier disruption in Alzheimer's disease.</a> Brain Pathology. 23 (3), 303-310 (2013).</li><li>Avolio, E., Madeddu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+cardiac+pericyte+biology:+From+physiopathological+mechanisms+to+potential+therapeutic+applications+in+ischemic+heart+disease.">Discovering cardiac pericyte biology: From physiopathological mechanisms to potential therapeutic applications in ischemic heart disease.</a> Vascular Pharmacology. 86, 53-63 (2016).</li><li>Dore-Duffy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+cerebral+microvascular+pericytes.">Isolation and characterization of cerebral microvascular pericytes.</a> Methods in Molecular Medicine. 89, 375-382 (2003).</li><li>Bryan, B. A., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericyte+isolation+and+use+in+endothelial/pericyte+coculture+models.">Pericyte isolation and use in endothelial/pericyte coculture models.</a> Methods in Enzymology. 443, 315-331 (2008).</li><li>Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+outgrowth,+propagation+and+characterization+of+human+pericytes.">Explant outgrowth, propagation and characterization of human pericytes.</a> Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).</li><li>Crisan, M., Corselli, M., Chen, W. C., Peault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+cells+for+regenerative+medicine.">Perivascular cells for regenerative medicine.</a> Journal of Cellular Molecular Medicine. 16 (12), 2851-2860 (2012).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+long-term+culture+of+multipotent+progenitor+cells+affiliated+with+the+walls+of+human+blood+vessels:+myoendothelial+cells+and+pericytes.">Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes.</a> Methods in Cellular Biology. 86, 295-309 (2008).</li><li>Nees, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+bulk+cultivation,+and+characterization+of+coronary+microvascular+pericytes:+the+second+most+frequent+myocardial+cell+type+in+vitro.">Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro.</a> American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).</li><li>Avolio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+characterization+of+neonatal+cardiac+pericytes+provides+a+novel+cellular+option+for+tissue+engineering+in+congenital+heart+disease.">Expansion and characterization of neonatal cardiac pericytes provides a novel cellular option for tissue engineering in congenital heart disease.</a> Journal of the American Heart Association. 4 (6), e002043 (2015).</li><li>Chen, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+myocardial+pericytes:+multipotent+mesodermal+precursors+exhibiting+cardiac+specificity.">Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity.</a> Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).</li><li>Baily, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Perivascular+Multipotent+Precursor+Cell+Populations+from+Human+Cardiac+Tissue.">Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54252 (2016).</li><li>Murray, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+and+cardiac+muscle+pericytes:+Functions+and+therapeutic+potential.">Skeletal and cardiac muscle pericytes: Functions and therapeutic potential.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 171, 65-74 (2017).</li><li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+pericytes+in+skeletal+muscle+regeneration+and+fat+accumulation.">Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation.</a> Stem Cells Development. 22 (16), 2298-2314 (2013).</li><li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential.">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Поскольку исследования на сердечных перицитах являются относительно новыми, роль перицитов в сердечно-сосудистой физиологии и патофизиологии еще предстоит определить. В других органах, они были показаны, чтобы играть ключевую роль в гомеостаза сосуда и перфузии1,2. По сравнению с литературой перицитов из других органов, таких как мозг, Есть значительно меньше публикаций на сердечных перицитов. Изоляция сердечных перицитов имеет решающее значение для понимания их функциональных характеристик и сигнальных механизмов. Таким образом, этот протокол предоставит следователям более простой способ получить доступ к сердечным перицитам из более легкодоступного источника ткани и продвигать исследования по их биологии. Это поможет ответить на вопросы о том, как сердечные перициты способствуют сердечного гомеостаза и патофизиологии, а также исследовать их терапевтический потенциал.
Популяция перицитов, изолированная от сердца мурина и характеризующаяся CD31-CD34-CD45-CD140b-NG2иCD146, была пройдена несколько раз (до P12 и все еще шла сильна), что не снижение жизнеспособности и распространяется быстро(Дополнительная рисунок 2). Клетки также были криозаморожены и восстановлены с по крайней мере 95% жизнеспособности. Тем не менее, мы предпочитаем использовать клетки P7 или моложе для наших экспериментов. Сравнивая яркие изображения наших перицитов с перицитами человеческого мозга, две клеточные линии имеют сопоставимую морфологию клеток(рисунок 4A),в то время как они отличаются в морфологии от гладких мышечных клеток (рисунок4A). Наши клетки P7 были охарактеризованы иммуноцитохимией для перицитных маркеров, некоторые из нашей панели FACS (NG2 и CD140b), а некоторые не в панели (vimentin, desmin, ЗСМА), и мы обнаружили, что клетки выразили перицитные маркеры гомогенно(рисунок 4B). Кроме того, наши p7 клетки были проанализированы поток цитометрии снова с той же маркерной панели для оценки изменений в выражении маркера из-за прохождения, и мы обнаружили, что не было никаких изменений (Рисунок 4C). Поэтому, как фенотипически, так и морфологически, наши клетки являются перицитами.
Исследования Nees et al.10,Avolio et al.11,Chen et al.12,и Baily et al.13 показали успешные изоляции сердечного перицита. Тем не менее, использование в доме пользовательских построенное оборудование, чтобы отделить перицитов от микросудов Nees et al.10 участие двух камер с насосами, которые проникнуты protease решение туда и обратно через сетку сетки стек, который было трудно повторить, как они не предоставили схематику и/или картину аппарата и того, как он был построен. Хотя Nees et al.10 успешно изолировали сердечные перициты многих видов, мы так и не смогли воспроизвести их метод. Наш шаг отряда перицитов в нашем протоколе просто использует орбитальный шейкер (чтобы разъединить все клетки), который доступен в большинстве, если не во всех лабораториях, с тканью и ферментным раствором в конической трубке, за которым следует механический шаг диссоциации. Существует не требуется пользовательский аппарат. Во-вторых, остальные протоколы включают в себя использование человеческих тканей и, таким образом, закупка человеческих тканей ограничивает следователей. Наш протокол представляет собой модификацию иоптимизацию текущих протоколов 9,12 с использованием моделей мыши (дикий тип, генетически модифицированные, больные) и материалов, которые легко доступны для всех исследователей.
Поскольку периваскулярные клетки в целом чувствительны, жизнеспособность клеток имеет решающее значение для получения хорошей урожайности. Во время закупок сердечной ткани и окрашивания клеток, ткани / клетки должны быть сохранены ледяной. Во-вторых, ферментативное пищеварение тканей может потребовать оптимизации на индивидуальной основе. В зависимости от единиц активности на флаконах ферментов, концентрация и время пищеварения, возможно, потребуется оптимизировать. Убедитесь, что ферментативное решение готовится свежим каждый раз, иначе урожайность будет уменьшаться. В-третьих, сырая смесь содержит много клеток, некоторые мертвые и / или умирают, лучше всего снизить концентрацию FBS в окрашивание буфера от 5% до 2%. Если у вас возникли проблемы с клетками засорения сопла во время рода, обогатить клетки сначала с помощью комплекта удаления мертвых клеток. Вы также можете добавить буфер EDTA/HEPES или лечение DNase к предварительной сортировке клетки, чтобы предотвратить слипание клеток. Наконец, потому что наша панель антител довольно велика и использует много флюорофоров, убедитесь, что ваши fMO контроля и компенсации контроля сделано правильно.
Одним из ограничений этого метода является количество сердечных перицитов, которые могут быть получены на сердце. В нашем случае, только 1,1% нашей сырой смеси из одной мыши сердце были перициты, которые сопоставимы с процентом в изоляции человеческого сердца, но количество клеток значительно меньше из-за количества сердечной ткани мыши обеспечивает. Поскольку начальное число клеток настолько низко после FACS, было бы лучше, чтобы изолировать от нескольких сердец одновременно. Тем не менее, проблема заключается в огромном количестве ячеек, которые необходимо разобрать за один день. Если у вас есть более 30 миллионов клеток, это будет трудно пройти через сорт, не влияя на жизнеспособность клеток. Если бы у следователя было несколько сортчиков клеток, изоляция от нескольких сердец в день была бы выполнима. Другое ограничение заключается в том, что, поскольку мы не знаем, если Есть субпопуляции перицитов в сердце, как есть скелетные мышцы15,16, мы не знаем, если мы устраняем подтип в нашей стратегии gating. Мы находимся в процессе характеристики наших сердечных перицитов и до сих пор в наших неопубликованных данных, они функционально, как и другие перициты в литературе.
Наш протокол позволит следователям ответить на вопросы о сердечных свойствах перицита, характеристиках, функциональности и других аспектах, которые помогут определить их вклад в сердечный гомеостаз и гемодинамику. Эти клетки могут иметь терапевтический потенциал для сердечно-сосудистых заболеваний, как только их биология лучше понять.

Перисосудистые клетки, известные как перициты, окружаютмикрососуды и капилляры сосудистого дерева 1,2. Физиологически, они, как известно, содействовать и играть роль в ангиогенезе, увеличение барьер целостности из-за их тесной связи с эндотелиальными клетками, а также стабилизации и зрелых сосудов1,2. Кроме того, дисфункция и / или потеря этих клеток были вовлечены в таких заболеваниях, как болезнь Альцгеймера2,3 и различных сердечно-сосудистых заболеваний4. Эти клетки находятся по всему телу, но номера клеток зависят от тканей. Перициты наиболее заметно изучены в головном мозге из-за высокой васкуляризации гематоэнцефалического барьера1,2. Однако в сердце недостаточно изучена биология перицитов.
В последнее время, Есть повышенный интерес в области сердечных перицитов, но в настоящее время нет обтекаемого протокола для их изоляции от одного из наиболее часто используемых инструментов в биологии - мыши. Есть протоколы в литературе по изоляции перицитов из мозга5,сетчатки6,плаценты7,и скелетной мышцы8,9; однако, несколько протоколов находятся на изоляции перицитов от сердца. Есть несколько групп, которые изолировали сердечные перициты. Nees et al. смогли изолировать обильное количество сердечных перицитов от нескольких видов, включая мышь; однако, их методы использовали специфическое встроенное оборудование которое уменьшает reproducibility10. Avolio et al.11, Chen et al.12, и Baily et al.13 также успешно изолировали сердечные перициты из тканей сердца человека, но человеческие ткани не всегда доступны и трудно получить для некоторых исследователей. Здесь мы разработали метод изоляции для получения сердечных перицитов от моделей мыши для исследователей для дальнейшего изучения их биологии с легкодоступными материалами.
Используя ферментативное пищеварение и флуоресценцию активированной сортировки клеток (FACS) с известными ключевыми маркерами перицита14, наш протокол позволяет изолировать и очистить популяцию перицитов, которые характеризуются CD31-CD34-CD45- CD140b-NG2-CD146. Наша панель маркеров содержит как маркеры включения, так и исключения. CD45 используется в качестве маркера для исключения гематопоитических клеток. CD31 используется в качестве маркера для исключения эндотелиальных клеток. CD34 используется в качестве маркера для исключения как гематопоитических, так и эндотелиальных клеток-прародителей. CD146 является маркером периваскулярных клеток. Наконец, NG2 и CD140b (также известный как тромбоциты производных рецепторов роста рецепторбета бета - PDGFR) оба приняты маркеры для перицитов14. Полученная первичная культура может быть культивирована и пронизана несколько раз без каких-либо изменений в морфологии или выражении маркера. Кроме того, эти клетки могут быть совместно культивированы с эндотелиальными клетками для изучения их взаимодействия и перекрестного разговора друг с другом. Этот метод изоляции клеток позволит следователям изучить биологию и патофизиологию сердечных перицитов от дикого типа, болезни и генетически вариант мыши моделей.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:988px;" width="986">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:106px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">25-053-Cl</td>
			<td style="width:506px;">dilute with 1x DPBS to get 0.1%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">100 &#956;M Cell strainer</td>
			<td style="width:106px;">FisherSci</td>
			<td style="width:155px;">22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">15 mL Falcon conical tubes</td>
			<td style="width:106px;">BD</td>
			<td style="width:155px;">352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">24-well plate</td>
			<td style="width:106px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">CLS3527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">25 gauge butterfly needle</td>
			<td style="width:106px;">FisherSci</td>
			<td style="width:155px;">22-253-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">31 gauge needle syringe</td>
			<td style="width:106px;">FisherSci</td>
			<td style="width:155px;">B328446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">50 mL Falcon conical tubes</td>
			<td style="width:106px;">BD</td>
			<td style="width:155px;">352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">6-well plate</td>
			<td style="width:106px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">CLS3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">anti-alpha smooth muscle actin rabbit mAb</td>
			<td style="width:106px;">abcam</td>
			<td style="width:155px;">ab32575</td>
			<td style="width:506px;">Antibody used in ICC 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">anti-CD140b rabbit mAb</td>
			<td style="width:106px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:155px;">28E1</td>
			<td style="width:506px;">Antibody used in ICC 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">anti-CD31 rabbit pAb</td>
			<td style="width:106px;">abcam</td>
			<td style="width:155px;">ab28364</td>
			<td style="width:506px;">Antibody used in ICC 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">anti-desmin rabbit pAb</td>
			<td style="width:106px;">abcam</td>
			<td style="width:155px;">ab8592</td>
			<td style="width:506px;">Antibody used in ICC 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">anti-NG2 conjugated to AF488</td>
			<td style="width:106px;">Millipore</td>
			<td style="width:155px;">MAB5384A4</td>
			<td style="width:506px;">Antibody used in ICC 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">anti-vimentin rabbit mAb</td>
			<td style="width:106px;">abcam</td>
			<td style="width:155px;">ab92547</td>
			<td style="width:506px;">Antibody used in ICC 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">ArC Amine Reactive Compensation bead kit</td>
			<td style="width:106px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:155px;">A10346</td>
			<td>compensation beads for Live/Dead Near IR dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Brightfield Microscope</td>
			<td style="width:106px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>camera attached</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">CD140b-PE (clone APB5)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td style="width:155px;">12-1402-81</td>
			<td>Antibody used in FACS 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">CD146-BV605 (clone ME-9F1)</td>
			<td style="width:106px;">BD</td>
			<td style="width:155px;">740434</td>
			<td>Antibody used in FACS 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">CD31-APC (clone MEC 13.3)</td>
			<td style="width:106px;">BD</td>
			<td style="width:155px;">551262</td>
			<td>Antibody used in FACS 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">CD34-BV421 (clone RAM 34)</td>
			<td style="width:106px;">BD</td>
			<td style="width:155px;">56268</td>
			<td>Antibody used in FACS 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">CD45-PE-Cy7 (clone 30-F11)</td>
			<td style="width:106px;">BD</td>
			<td style="width:155px;">552848</td>
			<td>Antibody used in FACS 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:106px;">eppendorf</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Collagenase B</td>
			<td style="width:106px;">Roche</td>
			<td style="width:155px;">11088815001</td>
			<td>0.226 U/mg lyo.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:106px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DAPI</td>
			<td style="width:106px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:155px;">D1306</td>
			<td>nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">DMEM with 4.5 g/L glucose, L-glutamine &#38; sodium pyruvate</td>
			<td style="width:106px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">10-013-CV</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Dowell scissors</td>
			<td style="width:106px;">FST</td>
			<td style="width:155px;">15040-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:106px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">21-030-CV</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline without Ca and Mg (CMF-DPBS)</td>
			<td style="width:106px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">21-031-CV</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Dumont #5 Fine Forceps</td>
			<td style="width:106px;">FST</td>
			<td style="width:155px;">11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FACSAria cell sorter</td>
			<td style="width:106px;">BD</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FACSAria software</td>
			<td style="width:106px;">BD</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Falcon tube round-bottom polypropylene, 5 mL</td>
			<td style="width:106px;">BD</td>
			<td style="width:155px;">38057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Falcon tube with cell strainer cap, 5 mL</td>
			<td style="width:106px;">BD</td>
			<td style="width:155px;">08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:106px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">35-015-CV</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:106px;">FST</td>
			<td style="width:155px;">14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FlowJo software</td>
			<td style="width:106px;">FlowJo LLC</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fortessa LSR flow cytometer</td>
			<td style="width:106px;">BD</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Gelatin-based coating</td>
			<td style="width:106px;">Cell Biologics</td>
			<td style="width:155px;">6950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:223px;">Goat anti-rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:106px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:155px;">A-11008</td>
			<td style="width:506px;">Antibody used in ICC 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Graefe Forceps</td>
			<td style="width:106px;">FST</td>
			<td style="width:155px;">11049-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Heparin sodium solution</td>
			<td style="width:106px;">Hospira</td>
			<td style="width:155px;">NDC 0409-2720-02</td>
			<td style="width:506px;">10,000 USP units/10 mL; from porcine intestines</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Incubator</td>
			<td style="width:106px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>set at 37 &#176;C, 5% CO2, 95% O2&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Live/Dead-Near IR</td>
			<td style="width:106px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:155px;">L10119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:106px;">FisherSci</td>
			<td style="width:155px;">12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NG2-FITC</td>
			<td style="width:106px;">Millipore</td>
			<td style="width:155px;">AB5320A4</td>
			<td>Antibody used in FACS 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Oribital shaker</td>
			<td style="width:106px;">VWR</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>Inside 37 &#176;C incubator or room</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:106px;">FisherSci</td>
			<td style="width:155px;">50-980-487</td>
			<td>dilute with 1x DPBS to get 4%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:106px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">&#160;Petri dish</td>
			<td style="width:106px;">FisherSci</td>
			<td style="width:155px;">FB0875714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Pipette and tips</td>
			<td style="width:106px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">ProLong Diamond</td>
			<td style="width:106px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:155px;">P36965</td>
			<td>mounting media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Propidum Iodide</td>
			<td style="width:106px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>cell viability dye for supplemental figure 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Rabbit IgG FITC</td>
			<td style="width:106px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:155px;">11-4614-80</td>
			<td style="width:506px;">Isotype control antibody - FITC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Rat IgG2a APC</td>
			<td style="width:106px;">Biolegend</td>
			<td style="width:155px;">400512</td>
			<td style="width:506px;">Isotype control antibody - APC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Rat IgG2a BV421</td>
			<td style="width:106px;">Biolegend</td>
			<td style="width:155px;">400536</td>
			<td style="width:506px;">Isotype control antibody - BV421</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Rat IgG2a BV605</td>
			<td style="width:106px;">BD</td>
			<td style="width:155px;">563144</td>
			<td style="width:506px;">Isotype control antibody - BV605</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Rat IgG2a PE</td>
			<td style="width:106px;">Biolegend</td>
			<td style="width:155px;">400308</td>
			<td style="width:506px;">Isotype control antibody - PE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Rat IgG2b PE-Cy7</td>
			<td style="width:106px;">Biolegend</td>
			<td style="width:155px;">400617</td>
			<td style="width:506px;">Isotype control antibody - PE-Cy7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">SuperBlock</td>
			<td style="width:106px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:155px;">37515</td>
			<td>blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">T75</td>
			<td style="width:106px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:155px;">156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:106px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">X100</td>
			<td>detergent, dilute with x DPBS to get 0.1%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">UltraComp beads</td>
			<td style="width:106px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:155px;">01-2222-42</td>
			<td>compensation beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Variable-Flow Peristaltic Pump</td>
			<td style="width:106px;">FisherSci</td>
			<td style="width:155px;">13-876-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">ViCell Cell counter</td>
			<td style="width:106px;">Beckman</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Wash buffer</td>
			<td style="width:106px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>1:10 dilution of Superblock in 1x DPBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and purification of murine cardiac pericytes

Перициты, периваскулярные клетки микрососудов и капилляров, как известно, играют определенную роль в ангиогенезе, стабилизации сосудов и эндотелиальной барьерной целостности. Тем не менее, их ткани конкретных функций в сердце не очень хорошо понимают. Кроме того, в настоящее время нет протокола, в который используются легкодоступные материалы для изоляции и очистки перицитов сердечного происхождения. Наш протокол фокусируется на использовании широко используемой модели млекопитающих, мыши, в качестве нашего источника клеток. Используя ферментативное пищеварение и механическую диссоциацию тканей сердца, мы получили сырую клеточную смесь, которая была дополнительно очищена флуоресценцией активации клеточной сортировки (FACS) множеством маркеров. Поскольку нет единого однозначного маркера для перицитов, мы закрыты для клеток, которые были CD31-CD34-CD45-CD140bиNG2иCD146. После очистки, эти первичные клетки были культивированы и проходили несколько раз без каких-либо изменений в морфологии и выражении маркера. С возможностью регулярно получать первичные перициты сердца морин с помощью нашего протокола, мы надеемся еще больше понять роль перицитов в сердечно-сосудистой физиологии и их терапевтический потенциал.

После ферментативного пищеварения и диссоциации всего сердца и до FACS очистки клеток, клетки сырой смеси, которая содержит много различных типов клеток от сердца (Рисунок 1A). После очистки и культивирования FACS клетки однородны. Они одноядерные, довольно плоские, и имеют типичный перицит ромбоидной морфологии(рисунок 1B).
Используя FACS, клетки очищаются до однородства. Неокрашенный образец контрольной ячейки используется для отображения стратегии gating(рисунок 2). Во-первых, мусор и дублеты были закрыты на основе передних и боковых распределений рассеяния. Затем мертвые клетки были закрыты из-за их амин реакции с красителем, который производит сигнал больше и более интенсивным, чем живые клетки. Из живых клеток, гематопоиэтики были закрыты, будучи CD45. Для дальнейшего удаления гематопогетических и эндотелиальных клеток, клеткиCD34 и CD31 были закрыты. Наконец, были выбраныклетки NG2и CD140b/CD146 для того, чтобы быть периваскулярными клетками с выражением типичных перицитных маркеров (рисунок3). Маркерпанели также тестировали на коронарных эндотелиальных клетках мыши в качестве элемента управления(Дополнительная диаграмма 1). Только около 1% сырой клеточной смеси состояло из перицитов после сортировки.
Чтобы подтвердить, что клетки действительно перициты, мы прошли клетки для дальнейшей характеристики. Клетки быстро росли, как только они достигли P3 в Т-75 колбы без изменений в жизнеспособности, как они стали старше(Дополнительный рисунок 2). По сравнению с перицитами человеческого мозга, клетки имели аналогичную морфологию(рисунок 4A). По сравнению с мышью и человеческими гладкими мышечными клетками, клетки имели различную морфологию(рисунок 4A). Существовали также не наблюдается изменений в морфологии или маркер выражения на P7, когда immunostained или по потоку цитометрии анализа после прохождения(Рисунок 4B,C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59571/59571fig1.jpg"> Рисунок 1 : Сырые клетки против очищенных клеток. (A) Яркое поле изображение сырой смеси клеток после всего сердца ферментативного пищеварения и диссоциации, которая была культивируется в t25 колбу в течение 14 дней. (B) Яркое поле изображение однородной популяции сердечных перицитов после сортировки и культивирования после 14 дней. Шкала бар 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59571/59571fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59571/59571fig2v2.jpg"> Рисунок 2 : Репрезентативные изображения АНАЛИЗА FACS неокрашенных клеток. Схематическое представление стратегии gating, используемой для очистки сырой клеточной смеси. Ворота для ячеек, которые являются однозначными, жить, CD45-, CD31-, CD34-, NG2,CD146 , и CD140b. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59571/59571fig2v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59571/59571fig3.jpg"> Рисунок 3 : Репрезентативные изображения FACS анализа сырых клеток. Схематическое представление сортировки, используемой для получения однородной популяции сердечных перицитов. Примерно 1% сырых клеток CD31-CD34-CD45-CD140b-NG2иCD146. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59571/59571fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59571/59571fig4.jpg"> Рисунок 4 : Характеристика первичных изолированных сердечных перицитов (A) Брайтфилд изображения культивированных клеток из человеческого мозга (hPC) и мыши сердца (mPC) показывают аналогичные морфологии перицитных клеток, но различные морфологии от человека гладкие мышечные клетки hSMC) и мыши гладкие мышечные клетки (mSMC). Шкала бар 100 мкм. (B) Фенотипическая характеристика клеток на P7 иммуноцитохимии для перицитных маркеров. Шкала бар 100 мкм. (C) Анализ потока цитометрии перицитов на P7, где они были закрыты для отрицательных маркеров CD31, CD34, CD45 и положительные маркеры NG2, CD140b, и CD146. Население остается однородным. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59571/59571fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Дополнительная рисунок 1: Репрезентативные изображения цитометрии потока анализа эндотелиальных клеток с помощью маркерной панели. В качестве контроля для связывающей специфичности маркеров использовалась коронарная эндотелиальная клеточная линия мыши. Используя ту же стратегию gating, которая была использована в сорте, за исключением положительных ворот для CD31 вместо отрицательных ворот, эндотелиальные клетки были отрицательными для CD45, CD34, NG2, CD140b и CD146, но положительные для CD31, как ожидалось. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59571/JOVE_Suppl_Figure_1.tif" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.</a>
Дополнительная рисунок 2: Репрезентативные изображения цитометрии потока анализа различных проходов mPC. Первичные изолированные сердечные перициты были культивированы и проходили до прохода 12. Клетки были окрашены йодидом пропидий и проанализированы на цитометр потока. Контроль наячки представляет собой смесь мертвых клеток и живых клеток. Существенных различий в количестве жизнеспособных клеток между проходами не наблюдалось. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59571/JOVE_Suppl_Figure_2.tif" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes at JoVE.com

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Мы оптимизировали протокол для изоляции и очистки курино-сердечных перицитов для фундаментальных исследований и исследования их биологии и терапевтического потенциала.

Изоляция и очищение моринских кардиологических перицитов

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Наш протокол оптимизирован для мышиной модели и использует материалы, которые легко доступны для всех исследователей. Этот метод может быть применен к здоровым, болезни, или генетически измененные модели мыши. Наш протокол позволит следователям ответить на любые вопросы о сердечной перицитной биологии от любой мышиной модели заболевания или генетической вариации.Эта процедура даст представление о сердечной перицит биологии и поможет нам понять их вклад в сердечный гомеостаз и гемодинамику как в области здравоохранения, так и болезни. Поместите анестезированую мышь в положение на спине и заклеите ее конечности скотчем. Аккуратно откройте грудную полость и с помощью 25-го калибра иглы-бабочки можете жеть нисходящую аорту.Сделайте ник в правом атриуме. Затем, perfuse сердце, по крайней мере 20 миллилитров 250 единиц на миллилитр гепаринизированных, кальция магния свободных фосфатов Dulbecco буферизированных солевой раствор на два миллилитров в минуту с переменным потоком перисталитического насоса. Perfusion является полным, когда чистый PBS выходит из правой атрии.Вырежьте сердце на аорте, и поместите его в ледяной кальций-магний-бесплатно DPBS. Затем перенесите сердце в чашку Петри 15 на 15 сантиметров. Разрежьте сердце на мелкие кусочки с помощью весенних ножниц и тонкой точки типсов с достаточным ферментного раствора для покрытия частей.Теперь перенесите кусочки и раствор в 50-миллилитровую коническую трубку и запечатав парафиновой пластиковой пленкой. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию на орбитальном шейкере при 120 об/мин в течение 75 минут. После переваривания коллагеназы с ферментным раствором, декант жидкости через 100-микрон-клеточный ситечко в новую 50-миллилитровую трубку, оставляя достаточно раствора, чтобы куски не высохли.Используя точечные миппы, возьмите ткань из трубки и поместите несколько кусочков на слайд микроскопа. Затем измельчите ткань между двумя слайдами микроскопа, чтобы разбить ткань. Промыть слайды с ферментом свободной культуры средств массовой информации в новую 50-миллилитровую коническую трубку.Повторите этот шаг до тех пор, пока все части ткани не будут разобщены. Объедините натянутый раствор и ткани заземления в одну трубку. Процедить полученную подвеску через 100-микрон-клеточный ситечко в новую 50-миллилитровую коническую трубку.Центрифуга образца в 220 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут. Аспирировать от предыдущего решения, и осторожно повторно клеточной гранулы в холодном facS окрашивания буфера, содержащего DPBS и бычьей сыворотки альбумин. Подсчитайте ячейки и проверьте жизнеспособность с помощью счетчика ячейки.Разбавить клетки до одного миллиона клеток на миллилитр с холодным facS окрашивания буфера, содержащего DPBS и бычьей сыворотки альбумин. Клетки теперь готовы быть окрашены и отсортированы. Подготовка и маркировка пятими миллилитров FACS труб для всех элементов управления и образцов клеток.Aliquot один миллилитр клеток на трубку для необлященного образца, флуоресценция минус один элемент управления, и изотип-соответствует контроля. Используйте оставшиеся ячейки для сортировки. Все элементы управления и образцы могут быть подготовлены и окрашены в то же время.Кроме того, подготовить и этикетки пятими миллилитров FACS труб в общей сложности девять компенсации контроля, два вида необлищенных бусин плюс семь различных фторхромов от маркерной панели. Для оптимизации контроля компенсации флуоресценции добавьте одну каплю компенсационных бусинок из флакона сжатия в каждую трубку. Затем добавьте один микролитер антител к бисеру.Повторите для каждого антитела от панели маркера. Используйте элементы управления FMO для оптимизации фонового окрашивания из-за спектрального перекрытия. К клеткам в трубках управления FMO, добавьте все антитела от панели маркера на разбавлении от одного до 100, но исключите одно антитело.Повторите для каждого антитела в общей сложности семь элементов управления. Используйте изотип-соответствует контрольные антитела для неспецифического окрашивания. К клеткам в изотип-соединенных маркировании трубок, добавьте isotype-соединенное антитело управления на разбавлении от одного до 100.Затем подготовьте клетки к сортировке. К свежеисположенным клеткам добавьте коктейль антител при разбавлении от одного до 100. Кроме того, добавить краситель жизнеспособности клеток при разбавлении от одного до 1000.Энергично смешивайте контроль компенсации путем вихревого импульса. Инкубировать в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия, защищенных от света, за исключением клеточной жизнеспособности бисера, который можно оставить при комнатной температуре, защищенной от света. Аккуратно смешайте элементы управления FMO, элементы управления, которые соответствуют изотипу, и клетки, которые будут отсортированы по вихрю импульса.Инкубировать в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия, защищенных от света. Добавьте три миллилитров буфера окрашивания FACS в каждый контроль компенсации, контроль FMO и контроль изотипа. Центрифуга труб при 300 раз g в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.Аспирировать от раствора, и повторно каждого гранулы в 400 микролитров FACS окрашивания буфера. Контроль компенсации, контроль FMO и элементы управления изотипом теперь готовы к использованию. После окрашивания, мыть клетки с FACS окрашивания буфера центрифугации в 300 раз г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию.Аспирировать раствор и повторно использовать клеточные гранулы в буфере окрашивания FACS до 0,5 миллиона клеток на миллилитр. Использование новых facS трубки, которые имеют 35-микрон фильтр вершины, пипетки окрашенных образцов клеток на крышках и гравитации фильтрат для получения одноклеточных суспензий. Держись на льду.Используйте сортер клеток для очистки клеток. Запустите необличные ячейки на сортере ячейки, чтобы установить напряжение и исправить для фонового сигнала. Вы запустите каждый одноцветный компенсационный образец шарика по одному, чтобы регулировать напряжение для каждого канала и регулировать ворота для положительного сигнала.Сбор данных. Используйте программное обеспечение для расчета спектрального перекрытия путем расчета матрицы компенсации. Все напряжения готовы и установлены.Вы запустите каждый изотип управления по одному. Эти данные могут быть использованы для регулировки ворот для неспецифического связывания, если таковые имеются. Вы запустите каждый образец FMO по одному.Отрегулируйте напряжение для каждого канала, чтобы исправить спектральное кровотечение через из-за многоцветной панели. Вы запустите образцы окрашенных клеток в сортаторе клеток. Соберите клетки в 10-миллилитровых ферментов свободной культуры средств массовой информации в 15-миллилитровой конической трубки сбора.Используйте следующую стратегию закрытого использования. Во-первых, ворота для одиночных ячеек. Затем ворота для живых клеток.Далее, ворота для CD45-отрицательных ячеек. Ворота для CD34 и CD31-отрицательных ячеек. Затем ворота для NG2-положительных ячеек.И, наконец, ворота для CD146 и CD140b-положительных ячеек. Для культуры перицитов, семена свежеприготовленных клеток в фермент-свободной культуры средств массовой информации на покрытием 24-хорошо пластины. Культура клетки в клеточном инкубаторе установлен на 37 градусов по Цельсию, 5%углекислого газа, и 95%кислорода.После энзиматической пищеварения и диссоциации всего сердца и до очистки FACS клеток, клетки сырой смеси, которые содержат много различных типов клеток от сердца. После очистки и культивирования FACS клетки однородны. Они одноядерные, довольно плоские, и имеют типичную перицитовую ромбоидную морфологию.Используя FACS, клетки очищаются от однородности. Во-первых, мусор и дублеты были закрыты на основе распределения вперед и стороны рассеяния. Затем, мертвые клетки были закрыты из-за их реакции амина с красителем, который производит сигнал больше и интенсивнее, чем живые клетки.Из живых клеток, гематопоэтические клетки были закрыты, будучи CD45-положительным. Для дальнейшего удаления гематопоэтических и эндотелиальных клеток были закрыты CD34-положительные и CD31-положительные клетки. Наконец, NG2-положительные и CD140b/CD146-положительные клетки были отобраны для того, чтобы быть периваскулярными клетками с выражением типичных перицитовых маркеров.По сравнению с перицитами человеческого мозга, клетки имели аналогичную морфологию. По сравнению с мышью и человека гладкие мышечные клетки, клетки имели различные морфологии фенотипической характеристики клеток при прохождении семь иммуноцитохимии для перицитных маркеров показали никаких наблюдаемых изменений в морфологии или маркер выражения. Аналогичным образом, анализ цитометрии потока перицитов при прохождении семи подтвердил, что популяция остается однородной.Жизнеспособность клеток имеет решающее значение для получения хорошей урожайности. Держите ткани холодной во время закупок, и держать клетки холодными во время окрашивания клеток. Кроме того, убедитесь, что энзиматические решения готовятся свежие каждый раз.Для обеспечения изоляции правильных клеток после культивирования, характеризуют их с потоком цитометрии и иммунофлуоресцентного окрашивания. Эти клетки могут быть использованы в кокультурных экспериментах с эндотелиальными клетками для функциональных барьерных исследований, а также анализов для изучения их биологической и физиологической функции и характеристик. Сердечные перициты играют основополагающую роль в целостности и стабильности сосудов, и их дисфункция имеет последствия для глобальной сердечной функции.С помощью нашей техники исследователи могут исследовать терапевтический потенциал сердечных перицитов.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Метод мышей Изоляция Островок и субкапсулярной трансплантации почек

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Direct Pressure Monitoring Accurately Predicts Pulmonary Vein Occlusion During Cryoballoon Ablation

Прямая контроля давления в легочной точно предсказывает окклюзии вены во время Cryoballoon аблации

Cryoballoon  ablation (CBA) is an established therapy for atrial fibrillation (AF).  Pulmonary vein (PV) occlusion is essential for achieving antral ...

Isolation and Excision of Murine Aorta; A Versatile Technique in the Study of Cardiovascular Disease

Выделение и Удаление мышиной аорты; Универсальный Техника в исследовании сердечно-сосудистых заболеваний

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Визуализация<em&gt; Пневмококк</em&gt; В сердечной микроповреждениям и последующих ремоделирования сердца

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery

Выделение эндотелиальных клеток-предшественников от здоровых добровольцев и их миграционном потенциал Под влиянием Образцы сыворотки после кардиохирургии

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

подготовки и<em&gt; In Vitro</em&gt; Характеристика замагниченного MIR-модифицированная эндотелиальные клетки

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Cardiac Magnetic Resonance for the Evaluation of Suspected Cardiac Thrombus: Conventional and Emerging Techniques

Сердечный магнитный резонанс для оценки предполагаемого сердечного тромба: обычные и новые методы

We present the conventional cardiac magnetic resonance (CMR) protocol for evaluating a suspected thrombus and highlight emerging techniques.&#160;The ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Изоляция предсердий миоцитов от взрослых мышей

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Динамическое измерение и визуализация капилляров, артериол и перицитов в сердце мыши

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion

Расположение, рассечение и анализ мышиного звездчатого ганглия

The autonomic nervous system is a substantial driver of cardiac electrophysiology. Especially&#160;the role of its sympathetic branch is an ongoing matter ...