Name: enrichment of native lipoprotein particles with microrna and subsequent determination of their absolute/relative microrna content and their cellular transfer rate
Uploaded: 2019-05-09T15:00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer

وقد حظي هذا العمل بدعم مشروع صندوق العلوم النمساوي P29110-B21 ، وهو مشروع "هوخشوليومبوسستيفتونغ دير شتات فيينا تسور فورستر دير ويسنشافت" 3065/2011 ، الصندوق الأوروبي للتنمية الاقليميه (EFRE, IWB2020) ، الدولة الاتحادية لأعالي النمسا ، و "الأرض OÖ Basisfinanzierung".

<ol>
	<li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins.">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 423-435 (2011).</li><li>Tabet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-transferred+microRNA-223+regulates+ICAM-1+expression+in+endothelial+cells.">HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Wahid, F., Shehzad, A., Khan, T., Kim, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Synthesis,+mechanism,+function,+and+recent+clinical+trials.">MicroRNAs: Synthesis, mechanism, function, and recent clinical trials.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1803 (11), 1231-1243 (2010).</li><li>Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+Mechanisms+of+miRNAs+and+siRNAs.">Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs.</a> Cell. 136 (4), 642-655 (2009).</li><li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+Translation+and+Stability+by+microRNAs.">Regulation of mRNA Translation and Stability by microRNAs.</a> Annual Review of Biochemistry. 79 (1), 351-379 (2010).</li><li>Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+post-transcriptional+regulation+by+microRNAs:+Are+the+answers+in+sight?.">Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: Are the answers in sight?.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).</li><li>Jonas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+High-Density+Lipoproteins.">Reconstitution of High-Density Lipoproteins.</a> Methods in Enzymology. , 553-582 (1986).</li><li>Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+AFM+and+Applications+to+Biomolecular+Systems.">High-Speed AFM and Applications to Biomolecular Systems.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 393-414 (2013).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments.">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Patsch, J. R., Patsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonal+ultracentrifugation.">Zonal ultracentrifugation.</a> Methods in Enzymology. 129 (1966), 3-26 (1986).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Yamamoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Techniques+for+Observing+Dynamic+Biomolecular+Processes.">High-Speed Atomic Force Microscopy Techniques for Observing Dynamic Biomolecular Processes.</a> Methods in Enzymology. 475, 541-564 (2010).</li><li>Stangl, H., Cao, G., Wyne, K. L., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+receptor,+class+B,+type+I-dependent+stimulation+of+cholesterol+esterification+by+high+density+lipoproteins,+low+density+lipoproteins,+and+nonlipoprotein+cholesterol.">Scavenger receptor, class B, type I-dependent stimulation of cholesterol esterification by high density lipoproteins, low density lipoproteins, and nonlipoprotein cholesterol.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (47), 31002-31008 (1998).</li><li>Hochberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+a+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: a Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. 57 (1), 289-300 (1995).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization.">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biology. 10 (6), (2009).</li><li>Schumaker, V. N., Puppione, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=6]+Sequential+Flotation+Ultracentrifugation.">6] Sequential Flotation Ultracentrifugation.</a> Methods in Enzymology. 128 (C), 155-170 (1986).</li><li>Wagner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+levels+and+cellular+transfer+of+circulating+lipoprotein-bound+microRNAs.">Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1392-1400 (2013).</li><li>Meier, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+chronic+kidney+disease+on+macrophage+cholesterol+efflux.">Effect of chronic kidney disease on macrophage cholesterol efflux.</a> Life Sciences. 136, 1-6 (2015).</li><li>Axmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+and+Lipoprotein+Particle+miRNA+Profile+in+Uremia+Patients.">Serum and Lipoprotein Particle miRNA Profile in Uremia Patients.</a> Genes. 9 (11), 533 (2018).</li></ol>

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

هنا ، يتم وصف العزلة من الجزيئات البروتين الدهني من الدم البشري وتحديد محتواها ميرنا الفردية خطوه بخطوه. من المهم للعمل في بيئة خاليه من RNase في حين التعامل مع معزولة وتوليفها ميرنا-الجسيمات المضمنة ميرنا من الواضح محمية من تدهور الانزيميه. كما نسبه ميرنا/الجسيمات من جزيئات البروتين الدهني الأصلي منخفضه نوعا ما ، والإثراء الاصطناعي مع ميرنا مطلوب لدراسة امتصاص الجسيمات هولو من الخلايا. التالي ، فان أعاده تشكيل جزيئات HDL كما هو موضح سابقا7 يتم تعديلها لدمج خيوط ميرنا. بالاضافه إلى ذلك ، فان فصل الدهون وكسر البروتين خلال هذا الاجراء يسمح للعلماء بفحص المكونات المرتبطة بالدهن والبروتين في جسيمات البروتين الدهني19. بطريقه مماثله ، يتم تكييف الاجراء الوسم من جزيئات LDL. ومن المثير للاهتمام ، ان أضافه النطاف-المثبت الطبيعي للالنيوبوتيدات-لم يؤثر علي نسبه ميرنا/الجسيمات. وتجدر الاشاره إلى ان الطريقة ، من حيث المبدا ، تسمح بعدم الطي من المواد الأخرى من ميرنا داخل جسيمات البروتين الدهني. وبطبيعة الحال ، هناك حد فيما يتعلق بالحجم المادي للمادة استنادا إلى الحجم الكلي لل HDL (القطر: 5-12 نانومتر) وجزيئات LDL (القطر: 18-25 نانومتر).
وفيما يتعلق بمراقبه الجودة من الجزيئات الدهنية المعاد تشكيلها/المسمي, HS-فؤاد هو طريقه قابله للتطبيق لتوصيف الجسيمات HDL/LDL علي مستوي الجسيمات واحد. بالمقارنة مع EM ، فانه يسمح لأوقات التحضير أقصر والظروف شبه الفسيولوجية (الرطب ، درجه حرارة الغرفة).
نظرا لحساسيته المتاصله والتضخيم ، qPCR هو الأسلوب المفضل للكشف عن تركيزات ميرنا منخفضه. بدلا من ذلك ، واحد جزيء المجهر المجهري الحساسة ، والتي هي قادره علي الكشف عن جزيئات الفردية حتى ، لن تكون مناسبه بسبب تركيزات منخفضه ، علي سبيل المثال ، فلوريسسينتلي المسمي ميرنا خيوط لكل الجسيمات. وهكذا ، تم العثور علي نسبه خيوط ميرنا لكل الجسيمات الدهنية الاصليه لتكون 10-8. الإثراء الاصطناعي يزيد من نسبه بمعامل 10,000 ، مما يسهل تقدير معدل امتصاص البروتين الدهني الخلوي (لم يتم الكشف عن اي فرق كبير باستخدام جزيئات البروتين الدهني الأصلي 19). الحساسية العالية من qPCR يجعل من الممكن تحديد معدل الامتصاص هذا عن طريق قياس عدد خيوط ميرنا بعد وقت الحضانة ونسبه ميرنا/الجسيمات. وتجدر الاشاره إلى ان القيمة المحسوبة تتجاهل تدهور الخلوية والإفراج عن ميرنا ، التالي ، يمثل علي الأقل حدا ادني لنسبه امتصاص جزيئات البروتين الدهني.
في المستقبل ، يمكن تكييف هذه الطريقة لنقل المواد الصيدلانية (ولا سيما أيضا محبه للدهون منها) في الخلايا وربط تاثيرها البيولوجي علي تركيز داخل الخلية (تحديد من خلال معدل امتصاص جزيئات البروتين الدهني).

تتكون جزيئات البروتين الدهني من طبقه أحاديه من الدهون البرمائية والكوليسترول الذي يضم نواه من استرات الكوليستيرول ودهون الدهون الثلاثية. يتم تثبيت الجسيمات بأكملها بواسطة شحمي الاغشيه المضمنة ، والتي تحدد الوظائف البيولوجية للجسيمات. يمكن تمييز جزيئات البروتين الدهني وفقا لكثافتها المتزايدة ، التالي ، إنقاص الحجم ، وهي بروتين دهني منخفض الكثافة جدا (VLDL) ، وبروتين دهني متوسط الكثافة (IDL) ، و LDL ، وجسيمات HDL. علي الرغم من نقل مكونات المياه غير القابلة للذوبان في مجري الدم ، فقد ثبت ان الجسيمات HDL تحمل خيوط غير الترميز من ميرنا1،2. [ميكرو-رناس] صنف من قصيرة (عاده اثنان اثنا عشر [نوبوتيدس]) [رنا] فروع, اي يتحلل اينتراسيلولارلي متممه [مرنا] خيوط و, بذلك, يغير التعبير تشكيل من بعض بروتينات3,4,5, 6- وعلاوة علي ذلك ، تم العثور علي تعديلات الملف الشخصي ميرنا في مجموعه متنوعة من الامراض ، التالي ، يتم تطبيق الشخصية كمؤشر حيوي للتشخيص والتشخيص. النقل خارج الخلية من miRNAs بين الخلايا عن طريق جزيئات البروتين الدهني قد تكون بمثابه اليه اضافيه لتحوير مستوي mRNA البينية. للتقدير الكمي للتاثير البيولوجي ، هناك حاجه إلى المعرفة فيما يتعلق بمحتوي ميرنا المطلق والنسبي لجزيئات البروتين الدهني.
الكمية PCR في الوقت الحقيقي هو وسيله مناسبه وسريعة نسبيا للحصول علي هذه المعلومات. التالي ، يمكن حساب قيمه القياس الكمي النسبي (RQ) ، والاختلافات النسبية بين العينات المختلفة وكسور البروتين الدهني التي تقدر بثمن. بطاقات صفيف ميكروفلويدريك المتعددة هي طريقه سريعة وسهله الاستخدام لتحديد الوجود النسبي (يعادل قيمه RQ) miRNAs في عينه. Multiwell بطاقات صفيف ميكروفلويديك تتكون من 96 أو 384 غرف التفاعل الفردية لردود الفعل الفردية qpcr جزءا لا يتجزا من جهاز ميكروفلويديك. تحتوي كل غرفه علي مسبار التحلل المائي المطلوب والإشعال الخاصة qPCR لواحد ميرنا الفردية. المزايا هي وقت المناولة القصيرة بسبب التوحيد القياسي ، وسير العمل بسيطه ، وانخفاض عدد الخطوات الأنابيب. وعلاوة علي ذلك ، يتم تصغير حجم العينة المطلوبة. وعلي النقيض من القياس الكمي النسبي ، فان محتوي ميرنا المطلق يتطلب مقارنه لنتائج عينه qPCR مع المنحنيات القياسية للأرقام المطلقة المعروفة لخيوط ميرنا. وتجدر الاشاره إلى انه نظرا لمحتوي ميرنا منخفض نسبيا ، ومعيار ، وعلاوة علي ذلك ، حتى واحده جزيء تقنيات التصوير الحساسة ليست ممكنة-الإثراء الاصطناعي لجزيئات البروتين الدهني مع ميرنا أمر حتمي لدراسة الخلوية تفاعل جسيمات البروتين الدهني ونقل ميرنا. وفيما يتعلق بهذا الأمر ، فان الفصل بين الجسيمات الحميدة يتبع مع البعد اللاحق7 يسمح بإدماج و ، التالي ، إثراء مع خيوط ميرنا. إثراء مماثله للجسيمات LDL مع ميرنا غير ممكن بسبب هيدروفوبيسيتي من البروتين apoB-100 ، وهو المكون الرئيسي للجسيمات LDL. ومع ذلك ، بالاضافه إلى القطب المذيب ثنائي ميثيل سولفوكسيد (DMSO) ، والتي هي قادره علي اختراق اغشيه الدهون ، يمكن تحميل جزيئات LDL بشكل مصطنع مع خيوط ميرنا كذلك.
عاليه السرعة المجهرية القوه الذرية (HS-فؤاد) هو أداه قويه لتوصيف العينات البيولوجية التي تقدم subnanometer المكانية والقرار الزمانيه subsecond8. التالي ، فانه هو تقنيه مناسبه تماما لمراقبه الجودة من جزيئات البروتين الدهني المعدلة كما الأصلي/المعاد تشكيلها/المسمية جزيئات البروتين الدهني يمكن ان تكون ناقصه تحت بيئة شبه فسيولوجية.
هنا ، يتم تقديم بروتوكول المستندة إلى qPCR خطوه بخطوه لتحديد محتوي ميرنا المطلق/النسبي من جزيئات البروتين الدهني وعينات الخلية ، والذي يسمح بتقدير معدل امتصاص جزيئات البروتين الدهني الخلوي. وعلاوة علي ذلك ، يتم إظهار طريقه لإثراء جزيئات البروتين الدهني مع ميرنا. قد يتم تكييف هذه الطريقة للتلاعب العام لمحتوي البروتين الدهني ، التالي ، ويوضح انطباق جزيئات البروتين الدهني كاهداف لتسليم المخدرات.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>TI 55.2</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer (EDTA)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366643</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaliumbromid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2110</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342414</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube sealer</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342428</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P029.2</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D/0650/50</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubes, MWCO 12 - 14k</td>
			<td>Spectra</td>
			<td>132700</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synthetic miRNA</td>
			<td>microSynth</td>
			<td>-</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 7</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 8</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile tubes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>ENE8.1</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf Biophotometer</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>XK20</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G-250 Stain</td>
			<td>BioRad GmbH</td>
			<td>161-0786</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3957.1</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>AustrAlco</td>
			<td>Ethanol Absolut 99.9%</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3942.1</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Multifuge X3R</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3313.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4627.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>P3556-25mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol oleate</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>C-9253-250mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>C8667-500mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass tubes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>K226.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spermine</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>S3256-1G</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>3097-25G</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>0955.2</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#181;L micropipettes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>A762.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9143.2</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amberlite XAD-2 beads</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>10357</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer casette (cut-off 20 kDa)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66003</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>465 76 83</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3054.2</td>
			<td>Labeling of LDL particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Labeling of LDL particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope</td>
			<td>RIBM</td>
			<td>SS-NEX</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscovite Mica (V-1 Grade)</td>
			<td>Christine Gr&#246;pl</td>
			<td>G250-1/V1</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Cantilever</td>
			<td>Nanoworld</td>
			<td>USC-F1.2-k0.15</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gwyddion 2.49</td>
			<td>Czech Metrology Institute</td>
			<td>http://gwyddion.net</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slides, Nunc Lab-Tek</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9117.1</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Omni Life Science GmbH</td>
			<td>Casy</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>217004</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Sterican 465 75 19</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309050</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cabinet</td>
			<td>Esco</td>
			<td>PCR-3A1</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4366596</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free water</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T143</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 ml tubes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781305</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>Microcentrifuge AL</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Sensoquest</td>
			<td>Labcycler</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Primer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal probe supermix</td>
			<td>BioRad GmbH</td>
			<td>1725131</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Corbett</td>
			<td>Rotor-Gene RG-6000</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366596</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4399966</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4391128</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4399933</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal Master Mix II, no UNG</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4440040</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA Human A Cards</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A31805</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0581</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (25mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0971</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9849</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7900HT Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4351405</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Array Card Sealer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>-</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native lipoprotein particles with microrna and subsequent determination of their absolute/relative microrna content and their cellular transfer rate

جزيئات البروتين الدهني هي في الغالب ناقلات الدهون والكوليسترول في مجري الدم. وعلاوة علي ذلك ، فانها تحتوي علي كميات صغيره من خيوط الميكرورنا غير الترميز (ميرنا). بشكل عام ، ميرنا يغير الملف الشخصي التعبير عن البروتين بسبب التفاعلات مع رسول الحمض الريبي النيبالي (mRNA). التالي ، فان معرفه محتوي ميرنا النسبي والمطلق لجزيئات البروتين الدهني ضرورية لتقدير التاثير البيولوجي لامتصاص الجسيمات الخلوية. وهنا ، يتم تقديم البروتوكول القائم علي تفاعل البلمره المتسلسل في الوقت الحقيقي (qPCR) لتحديد محتوي ميرنا المطلق لجزيئات البروتين الدهني — الذي يظهر لجزيئات البروتين الدهني الاصليه والمخصبة من ميرنا. يتم قياس محتوي ميرنا النسبي باستخدام بطاقات صفيف ميكروفلويدريك متعددة الآبار. وعلاوة علي ذلك ، يسمح هذا البروتوكول العلماء لتقدير ميرنا الخلوية ، التالي ، معدل امتصاص جزيئات البروتين الدهني. وهناك زيادة كبيره في مستوي ميرنا الخلوية يمكن ملاحظتها عند استخدام البروتينات الدهنية عاليه الكثافة (HDL) جزيئات محمله بشكل مصطنع مع ميرنا ، في حين ان الحضانة مع جزيئات HDL الاصليه لا تعطي تاثيرا كبيرا بسبب محتواها منخفضه نسبيا ميرنا. وعلي النقيض من ذلك ، فان الامتصاص الخلوي لجزيئات البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL)-لا مع ميرنا الاصليه ولا محمله بشكل مصطنع معها-لم يغير مستوي ميرنا الخلوي.

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer 

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

هنا ، يتم تقديم الكمية في الوقت الحقيقي البلمره سلسله البروتوكول القائم علي رد الفعل لتحديد محتوي الحمض الريبي الصغير الأصلي (المطلق/النسبي) من جزيئات البروتين الدهني. الاضافه إلى ذلك ، يتم إثبات طريقه لزيادة مستوي الحمض الريبي الصغير ، فضلا عن طريقه لتحديد معدل امتصاص جزيئات الخلايا الدهنية.

إثراء جزيئات البروتين الدهني الأصلي مع ميكرورنا والتحديد اللاحق لمحتوياتها المطلقة/النسبية ميكرورنا ومعدل نقلها الخلوي

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

جسيمات البروتين الدهني هي مركبات النقل المحلية. وييسر تخصيب المواد الأجنبية استخدامها كناقل مسار. وضع علامات محددة من الجزيئات أو الجسيمات كلها يجعل من الممكن قياس امتصاص الخلوية.طريقتان للإثراء سريعة وسهلة الاستخدام، ويمكن تكييفها لمجموعة واسعة من المواد. إثبات الإجراء سيكون ماركوس أكسمان و أندرياس كارنر، وهما بعد الدوّات من مختبري. لبدء delipidation في غطاء الدخان، مزيج من 1 إلى 2 ملليلتر من حل HDL المعدة التي تحتوي على خمسة ملليغرام من جزيئات HDL مع 50 ملليلتر من قبل تبريد ثلاثة إلى اثنين خليط من الإثير الإيثانول ديثيل في أنبوب الطرد المركزي مخروطي.احتضان لمدة ساعتين في درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية. أجهزة الطرد المركزي في 2500 مرات ز لمدة 10 دقائق في درجة مئوية سلبية 10. تجاهل supernatant، resuspend بيليه في 50 ملليلتر من قبل تبريد الإيثانول ديثيل الأثير خليط، ودوامة لفترة وجيزة.احتضان للمرة الثانية لمدة ساعتين في درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 2500 مرة ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة سالبة 10 مئوية. ثم إدراج الأنابيب توريد تدفق غاز النيتروجين لتجفيف بيليه.و resuspend في 250 ميكرولترات من العازلة A.Determine تركيز البروتين باستخدام تحليل البروتين برادفورد أو آخر واحد مناسب. ومن الأهمية بمكان إزالة أي بقايا من خليط الإثير الإيثانول، لأن هذه المذيبات من شأنها أن تمنع إعادة استعمال البروتينات الإبوليسية. بعد ذلك ، تمييع إلى تركيز نهائي من ملليغرام واحد من البروتين لكل 250 ميكرولترات من المخزن المؤقت A.Insert a.Insert أنبوب توريد الغاز الخامل في جزء الحل في الأنبوب.إذا لزم الأمر، قم بتخزين المحلل بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية تحت الغلاف الجوي للغاز الخامل. لبدء إعادة تشكيل، في أنبوب زجاجي نظيف، مزيج 100 ميكرولترات من CO، 13.5 ميكرولترات من C، و 500 ميكرولترات من أجهزة الكمبيوتر. ثم تدوير أنبوب زجاجي في حين طرد غاز النيتروجين داخل الأنبوب لتجفيف الخليط من أجل إنتاج طبقة سطحية متجانسة. في أنبوب تفاعل 0.5 ملليلتر ، قم بإعداد محلول منوي جديد 30 ملليمولر في المخزن المؤقت A.Then مزيج 100 ميكرولتر من 10 ميكرولار الاصطناعية الحمض النووي الريبي مع 100 ميكرولترات من الحل المنوي في أنبوب تفاعل ميليلتر اثنين.واحتضان لمدة 30 دقيقة في 30 درجة مئوية. بعد ذلك، نقل المحتضنة 200-microliter حل في أنبوب زجاجي لإعادة الترطيب على استعداد PC-CO-C mastermix طبقة السطح. ثم إضافة 50 ميكرولترات من محلول ديوكسيكولات الصوديوم 30 ملليغرام لكل ملليلتر.يُحرّك المزيج عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين. بعد ذلك، إضافة 250 ميكرولترات من حل HDL delipidated في أنبوب زجاجي. ويحرك عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.لبدء غسيل الكلى، أولا إضافة 50 غراما من الخرز الماص إلى 800 ملليلتر من الماء المقطر مزدوجة. واستخدمي مُحرك مغناطيسياً ليُحرّك لمدة دقيقة واحدة. انتظر 15 دقيقة للخرز لتسوية، وdedeant فائقة.كرر الإجراء مع برنامج تلفزيوني مبرد مسبقاً. أشرطة غسيل الكلى قبل الرطب في برنامج تلفزيوني. استخدام حقنة لإضافة الخليط المعد مسبقا في الكاسيت وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.إضافة الخرز الممزخرة التي يعامل برنامج تلفزيوني إلى ثلاثة لترات من برنامج تلفزيوني، ووضع أشرطة في برنامج تلفزيوني لsededyze في أربع درجات مئوية. تبقي الخرز تدرج الكثافة على طول غشاء غسيل الكلى ثابت. تغيير المخزن المؤقت والخرز بعد ساعة وساعتين.بعد 24 ساعة، مع حقنة، استخراج الحل من الكاسيت في أنبوب تفاعل 1.5 ملليلتر لاستعادة حل الجسيمات HDL المعاد تشكيلها. تحديد تركيز البروتين باستخدام فحص برادفورد. توريد الغاز الخامل إلى أنبوب التفاعل، وختم عليه، وتخزين حل الجسيمات HDL المعاد تشكيلها تحت الغلاف الجوي الغاز الخامل في أربع درجات مئوية.أولاً، أعد محلول حني حيواني 30 ميلي ميل في الماء الخالي من الرناز. مزيج 100 ميكرولترات من 10 ميكرومولار من الحمض النووي الصغير الاصطناعية مع 100 ميكرولترات من حل الحيوانات المنوية في أنبوب تفاعل ملليلتر اثنين. واحتضان لمدة 30 دقيقة في 30 درجة مئوية.ثم إضافة 100 ميكرولترات من DMSO و 1.2 ملليلتر من 1X LDL العازلة لمحلول الحيوانات المنوية microRNA المعدة. تمييع محلول جسيمات LDL المعدة مسبقًا مع PBS إلى تركيز نهائي يبلغ حوالي أربعة ملليجرامات لكل ملليلتر. ثم رسم 450 ميكرولترات من الحل المخفف في أنبوب تفاعل 1.5 ملليلتر، ومزيج مع 50 ميكرولترات من 10X LDL العازلة.احتضانه لمدة 10 دقائق على الجليد. بعد الحضانة، والجمع بين 500 ميكرولتر حل الجسيمات LDL و1.5 ملليلتر ميكرورنا-الحيوانات المنوية-DMSO، واحتضانه لمدة ساعتين في 40 درجة مئوية. قم بإجراء غسيل الكلى على غرار ما سبق وصفه، وتخزين محلول الجسيمات LDL المسمى تحت غلاف الغاز الخامل عند أربع درجات مئوية.للبدء، تمييع محلول جسيمات HDL أو LDL في PBS بين واحد إلى 100 و واحد إلى 1، 000. كليف ميكا عن طريق الضغط على شريط لاصق ضد الركيزة الميكا، وسحب الشريط قبالة لإزالة طبقات الميكا العليا. استخدام ماصة لإيداع اثنين من microliters على الميكا مشقوق حديثا لاحتضان لمدة خمس دقائق.تميل جزيئات البروتين الدهني إلى تشكيل أغشية رابطة مستمرة على الأسطح. وبالتالي، من المهم ضبط تركيز الجسيمات على سطح الميكا للحصول على تلك الفردية. بعد الحضانة، شطف العينة مع برنامج تلفزيوني.املأ الخلية السائلة عالية السرعة AFM مع برنامج تلفزيوني، واحمل الماسح الضوئي الحامل للميكا إلى مرحلة AFM عالية السرعة. في برامج التحكم، بدء عملية نهج من cantilever إلى سطح الميكا. استخدم أحجام المسح الضوئي أقل من ميكرومتر مربع واحد، وإبقاء قوى التصوير منخفضة قدر الإمكان.صورة العينة في وضع التنصت. قم بتحميل البيانات في Gwyddion، والكشف عن الجسيمات عبر الحبوب علامة بواسطة الدالة عتبة. اضبط قيمة عتبة الارتفاع لإخفاء الجسيمات الفردية.عادة، مستوى حوالي 50٪هو نقطة انطلاق جيدة. إزالة الخلفية متعددة الحدود لتسطيح الصورة، وتنشيط استبعاد منطقة ملثمة الخيار. تصدير قيم الارتفاع القصوى للجسيمات المكتشفة باستخدام توزيع مختلف خصائص الحبوب وظيفة، وتكرار هذه الخطوات لجميع الصور المسجلة.وفي هذه التجربة، تم إعادة تشكيل جسيمات HDL من خلال إزالة الجزيئات من الجزيئات الحميدة، ثم إعادة الغسل الكلوي. ويمكن تحقيق غلة 50٪ من جسيمات HDL المعاد تشكيلها. ومع ذلك، لم يكن وضع العلامات نفسها مع ميكرورنا ممكنا لوضع العلامات على جزيئات LDL، وذلك بسبب الرهاب المائي للبروتين Apolipoprotein B100.وهكذا، تم استخدام DMSO لاختراق أحادية الدهون من جزيئات LDL، مع العائد على ما يقرب من 100٪ أثناء مراقبة الجودة، وتخفيف أمر بالغ الأهمية للتحليل. الصورة العلوية تُظهر كثافة جسيمات عالية جداً. الصورة السفلية مناسبة للتحليل.تم حساب وظائف كثافة الاحتمالية لارتفاعات الجسيمات للمقارنة بين توزيعات الحجم لجسيمات البروتين الدهني الأصلية، المسماة، والسيطرة عليها. التغيير النسبي قبل وبعد إجراء وضع العلامات مهمل. عند التعامل مع الحمض النووي الريبي oligonucleotides، والعمل RNAse خالية.استخدام المواد الاستهلاكية البلاستيكية الطازجة المتاح، وارتداء دائما قفازات. استخدم فقط الحلول الخالية من النوى. AFM عالية السرعة هو مجرد طريقة واحدة لتحديد الشكل العام للبروتينات الدهنية.وهناك طريقة بديلة هي المجهر الإلكتروني. ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة، والعمل في غطاء محرك الدخان أثناء التعامل مع الإثير ديثيل.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

وسيلة فعالة لتخليق Peptoids مع مونمرات مختلط ليسين من نوع / ارجينين من نوع وتقييم نشاطهم مكافحة يشماني

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

توليف 1،2-Azaborines وإعداد مجمعات البروتين مع T4 الليزوزيم المسوخ

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

تحديد محتوى الجليكوجين في البكتيريا الزرقاء

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

كشف حساسة للغاية وكمية من البروتينات وعلى إيسوفورمس بطريقة تركز Isoelectric الشعرية

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

تشكيل التساهمية الحمض النووي Adducts بالمواد المسرطنة انزيماتيكالي المنشط والمخدرات في المختبر وتصميمها من 32فبوستلابيلينج

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

سبليت-بيويد-تحليل البروتين مجمعات البروتين محددة السياق في بيئتها الخلوية الأصلية

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

تحديد المحتوى فيكوبيليبروتين في سيانوباكتيريوم سينيتشوسيستيس سبيكتروفوتوميتريك

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

عزل ثيلاكويدس النشطة فسيولوجيا واستخدامها في فحوصات البروتين الطاقة تعتمد على النقل

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

الهجين واضح/الأزرق الكهربائي الأصلي للفصل وتحليل المجمعات التنفسية الميتوكوندريا السلسلة الفائقة

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

عزل جزيئات البروتين الدهني من صفار بيض الدجاج لدراسة دمج الأحماض الدهنية المسببة للأمراض البكتيرية في الدهون الفوسفاتية الغشاء

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...