Name: enrichment of native lipoprotein particles with microrna and subsequent determination of their absolute/relative microrna content and their cellular transfer rate
Uploaded: 2019-05-09T15:00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer

Dette arbejde blev støttet af Østrigs videnskabs fonds projekt P29110-B21, "Hochschuljubiläumsstiftung der Stadt Wien Zur Förderung der Wissenschaft", projekt H-3065/2011, den europæiske fond for regional udvikling (EFRE, IWB2020), den føderale stat i øvre Østrig og "land OÖ Basisfinanzierung".

<ol>
	<li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins.">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 423-435 (2011).</li><li>Tabet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-transferred+microRNA-223+regulates+ICAM-1+expression+in+endothelial+cells.">HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Wahid, F., Shehzad, A., Khan, T., Kim, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Synthesis,+mechanism,+function,+and+recent+clinical+trials.">MicroRNAs: Synthesis, mechanism, function, and recent clinical trials.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1803 (11), 1231-1243 (2010).</li><li>Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+Mechanisms+of+miRNAs+and+siRNAs.">Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs.</a> Cell. 136 (4), 642-655 (2009).</li><li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+Translation+and+Stability+by+microRNAs.">Regulation of mRNA Translation and Stability by microRNAs.</a> Annual Review of Biochemistry. 79 (1), 351-379 (2010).</li><li>Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+post-transcriptional+regulation+by+microRNAs:+Are+the+answers+in+sight?.">Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: Are the answers in sight?.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).</li><li>Jonas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+High-Density+Lipoproteins.">Reconstitution of High-Density Lipoproteins.</a> Methods in Enzymology. , 553-582 (1986).</li><li>Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+AFM+and+Applications+to+Biomolecular+Systems.">High-Speed AFM and Applications to Biomolecular Systems.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 393-414 (2013).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments.">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Patsch, J. R., Patsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonal+ultracentrifugation.">Zonal ultracentrifugation.</a> Methods in Enzymology. 129 (1966), 3-26 (1986).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Yamamoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Techniques+for+Observing+Dynamic+Biomolecular+Processes.">High-Speed Atomic Force Microscopy Techniques for Observing Dynamic Biomolecular Processes.</a> Methods in Enzymology. 475, 541-564 (2010).</li><li>Stangl, H., Cao, G., Wyne, K. L., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+receptor,+class+B,+type+I-dependent+stimulation+of+cholesterol+esterification+by+high+density+lipoproteins,+low+density+lipoproteins,+and+nonlipoprotein+cholesterol.">Scavenger receptor, class B, type I-dependent stimulation of cholesterol esterification by high density lipoproteins, low density lipoproteins, and nonlipoprotein cholesterol.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (47), 31002-31008 (1998).</li><li>Hochberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+a+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: a Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. 57 (1), 289-300 (1995).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization.">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biology. 10 (6), (2009).</li><li>Schumaker, V. N., Puppione, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=6]+Sequential+Flotation+Ultracentrifugation.">6] Sequential Flotation Ultracentrifugation.</a> Methods in Enzymology. 128 (C), 155-170 (1986).</li><li>Wagner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+levels+and+cellular+transfer+of+circulating+lipoprotein-bound+microRNAs.">Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1392-1400 (2013).</li><li>Meier, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+chronic+kidney+disease+on+macrophage+cholesterol+efflux.">Effect of chronic kidney disease on macrophage cholesterol efflux.</a> Life Sciences. 136, 1-6 (2015).</li><li>Axmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+and+Lipoprotein+Particle+miRNA+Profile+in+Uremia+Patients.">Serum and Lipoprotein Particle miRNA Profile in Uremia Patients.</a> Genes. 9 (11), 533 (2018).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Her er isoleringen af lipoprotein partikel fraktioner fra humant blod og bestemmelse af deres individuelle miRNA indhold beskrevet trin for trin. Det er afgørende at arbejde i et RNase-frit miljø, mens håndtering af isolerede og syntetiserede miRNA-partikel-Embedded miRNA er naturligvis beskyttet mod Enzymatisk nedbrydning. Da miRNA/partikel forholdet mellem Native lipoprotein partikler er temmelig lav, kunstig berigelse med miRNA er forpligtet til at studere Holo partikel optagelse af celler. Dermed, rekonstitution af HDL-partikler som beskrevet tidligere7 er modificeret til at indarbejde Mirna tråde. Desuden, adskillelsen af lipid og protein fraktion under denne procedure giver forskerne til at undersøge lipid-og protein-associerede komponenter i lipoprotein partikel19. På en lignende måde, mærkning procedure af LDL-partikler er tilpasset. Interessant, tilsætning af spermine-en naturlig stabilisator af nukleotider-påvirkede ikke miRNA/partikel forholdet. Det skal bemærkes, at metoden i princippet gør det muligt at indfolde andre stoffer end miRNA inden for en lipoprotein-partikel. Der er naturligvis en grænse med hensyn til stoffets fysiske størrelse baseret på den samlede størrelse af HDL (diameter: 5-12 nm) og LDL-partikler (diameter: 18-25 nm).
Med hensyn til kvalitetskontrol af rekonstituerede/mærkede lipoprotein partikler, HS-AFM er en anvendelig metode til at karakterisere HDL/LDL-partikler på enkelt partikel niveau. I sammenligning med EM, det giver mulighed for kortere tilberedningstider og nær-fysiologiske forhold (våd, stuetemperatur).
På grund af sin iboende følsomhed og forstærkning, qPCR er den metode til valg til at detektere lav miRNA koncentrationer. Alternativt, enkelt-molekyle følsom Fluorescens mikroskopi, som er i stand til at detektere selv individuelle molekyler, ville ikke være egnet på grund af de lave koncentrationer af, for eksempel, fluorescerende mærket miRNA tråde per partikel. Således er forholdet mellem miRNA tråde pr Native lipoprotein partikel har vist sig at være 10-8. Kunstig berigelse forøger forholdet med en faktor på 10.000, hvilket letter skønnet af optagelsen af cellulære lipoprotein (der påvises ingen signifikant forskel ved brug af Native lipoprotein-partikler 19). Den høje følsomhed af qPCR gør det muligt at bestemme denne optagelseshastighed ved at måle antallet af miRNA tråde efter inkubationstid og miRNA/partikel-forholdet. Det skal bemærkes, at den beregnede værdi ignorerer cellulære nedbrydning og frigivelse af miRNA og dermed udgør mindst en nedre grænse for lipoprotein partikel optagelses forholdet.
I fremtiden kan metoden tilpasses til at overføre farmaceutiske stoffer (især også lipofile) i celler og korrelere deres biologiske virkning til den intracellulære koncentration (bestemt via Optagelseshastigheden af lipoprotein-partikler).

Lipoprotein partikler er sammensat af en enkeltlags af amfifile lipider og kolesterol omsluttende en kerne af kolesterylestere estere og triglycerid fedtstoffer. Hele partiklen stabiliseres af membran indlejrede apolipoproteiner, som definerer partiklens biologiske funktionalitet. Lipoprotein partikler kan skelnes i henhold til deres respektive stigende tæthed og dermed faldende størrelse, nemlig som meget lav densitet lipoprotein (VLDL), intermediær-density lipoprotein (IDL), LDL, og HDL-partikler. På trods af transport af vanduopløselige komponenter i blodbanen, det er blevet påvist, at HDL-partikler bære Noncoding tråde af Mirna1,2. Micro-RNAs er en klasse af korte (sædvanligvis to dusin nukleotider) RNA-tråde, som nedbryder intracellulære komplementære mRNA-tråde og derved ændrer udtryks profilen for visse proteiner3,4,5, 6. det er Desuden er der fundet ændringer af miRNA profilen i en række forskellige sygdomme, og profilen kan således anvendes som en biomarkør til diagnose og prognose. Den ekstracellulære transport af Mirnas mellem celler via lipoprotein partikler kan tjene som en supplerende mekanisme for intercellulære mRNA-niveau modulation. For kvantitativt at anslå den biologiske effekt, viden om det absolutte og relative miRNA indhold af lipoprotein partikler er nødvendig.
Kvantitativ real-time PCR er en passende og relativt hurtig metode til at få disse oplysninger. Derfor kan den relative kvantificerings værdi (RQ) beregnes, og relative forskelle mellem forskellige prøver og lipoprotein fraktioner er skønelige. Multiwell mikrofluidisk kapllærelektroforese array kort er en hurtig og nem at bruge metode til at bestemme den relative tilstedeværelse (svarer til RQ-værdien) af Mirnas i en prøve. Multiwell mikrofluidisk kapllærelektroforese array kort består af 96 eller 384 individuelle reaktions kamre til individuelle qPCR-reaktioner indlejret i en mikrofluidic enhed. Hvert kammer indeholder den påkrævede hydrolyse sonde og specifikke qPCR-primere til én enkelt miRNA. Fordelene er en kort ekspeditionstid på grund af standardisering, en enkel arbejdsgang og et reduceret antal pipette Rings trin. Desuden minimeres den påkrævede prøvemængde. I modsætning til den relative kvantificering, kræver absolut miRNA indhold en sammenligning af qPCR prøveresultater med standard kurver af kendte absolutte tal af miRNA tråde. Det skal bemærkes, at på grund af deres relativt lave miRNA indhold, standard og i øvrigt, selv enkelt-molekyle følsomme billedbehandlings teknikker er ikke muligt-den kunstige berigelse af lipoprotein partikler med miRNA er uundgåelig at studere cellulære lipoprotein partikel interaktion og miRNA Transfer. Med hensyn til dette, delipidation af HDL-partiklen fulgt med efterfølgende relipidation7 tillader inkorporering af og dermed berigelse med Mirna tråde. Lignende berigelse af LDL-partikler med miRNA er ikke muligt på grund af hydrofobicitet af apoB-100 protein, som er den vigtigste bestanddel af LDL-partiklen. Men, ved tilsætning af Polar solvent dimethylsulfoxid (DMSO), som er i stand til at trænge ind i lipid membraner, kan LDL-partikler være kunstigt lastet med miRNA tråde samt.
High-Speed atomkraft mikroskopi (HS-AFM) er et kraftfuldt værktøj til karakterisering af biologiske prøver, der tilbyder subnanometer rumlig og subsecond tidsmæssig opløsning8. Derfor er det en velegnet teknik til kvalitetskontrol af modificerede lipoprotein partikler som indfødte/rekonstituerede/mærkede lipoprotein partikler kan være indlagret under en nær-fysiologiske miljø.
Her præsenteres en qPCR-baseret protokol trin for trin for at bestemme den absolutte/relative miRNA indhold af lipoprotein partikler og celleprøver, som giver mulighed for en vurdering af cellulære lipoprotein partikel Optagelseshastigheden. Desuden er der påvist en metode til berigelse af lipoprotein-partikler med miRNA. Denne metode kan tilpasses til den generelle manipulation af lipoprotein indhold og, dermed, viser anvendeligheden af lipoprotein partikler som mål for lægemiddel levering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>TI 55.2</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer (EDTA)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366643</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaliumbromid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2110</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342414</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube sealer</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342428</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P029.2</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D/0650/50</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubes, MWCO 12 - 14k</td>
			<td>Spectra</td>
			<td>132700</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synthetic miRNA</td>
			<td>microSynth</td>
			<td>-</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 7</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 8</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile tubes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>ENE8.1</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf Biophotometer</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>XK20</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G-250 Stain</td>
			<td>BioRad GmbH</td>
			<td>161-0786</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3957.1</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>AustrAlco</td>
			<td>Ethanol Absolut 99.9%</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3942.1</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Multifuge X3R</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3313.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4627.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>P3556-25mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol oleate</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>C-9253-250mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>C8667-500mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass tubes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>K226.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spermine</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>S3256-1G</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>3097-25G</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>0955.2</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#181;L micropipettes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>A762.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9143.2</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amberlite XAD-2 beads</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>10357</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer casette (cut-off 20 kDa)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66003</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>465 76 83</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3054.2</td>
			<td>Labeling of LDL particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Labeling of LDL particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope</td>
			<td>RIBM</td>
			<td>SS-NEX</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscovite Mica (V-1 Grade)</td>
			<td>Christine Gr&#246;pl</td>
			<td>G250-1/V1</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Cantilever</td>
			<td>Nanoworld</td>
			<td>USC-F1.2-k0.15</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gwyddion 2.49</td>
			<td>Czech Metrology Institute</td>
			<td>http://gwyddion.net</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slides, Nunc Lab-Tek</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9117.1</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Omni Life Science GmbH</td>
			<td>Casy</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>217004</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Sterican 465 75 19</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309050</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cabinet</td>
			<td>Esco</td>
			<td>PCR-3A1</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4366596</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free water</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T143</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 ml tubes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781305</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>Microcentrifuge AL</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Sensoquest</td>
			<td>Labcycler</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Primer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal probe supermix</td>
			<td>BioRad GmbH</td>
			<td>1725131</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Corbett</td>
			<td>Rotor-Gene RG-6000</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366596</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4399966</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4391128</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4399933</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal Master Mix II, no UNG</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4440040</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA Human A Cards</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A31805</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0581</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (25mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0971</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9849</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7900HT Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4351405</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Array Card Sealer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>-</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native lipoprotein particles with microrna and subsequent determination of their absolute/relative microrna content and their cellular transfer rate

Lipoprotein partikler er overvejende transportører af lipider og kolesterol i blodbanen. Desuden, de indeholder små mængder af tråde af Noncoding microRNA (miRNA). Generelt ændrer miRNA protein udtryks profilen på grund af interaktioner med Messenger-RNA (mRNA). Således, viden om det relative og absolutte miRNA indhold af lipoprotein partikler er afgørende for at anslå den biologiske effekt af cellulære partikel optagelse. Her, en kvantitativ real-time polymerase kædereaktion (qPCR)-baseret protokol er præsenteret for at bestemme det absolutte miRNA indhold af lipoprotein partikler-eksemplificeret vist for indfødte og miRNA-beriget lipoprotein partikler. Det relative Mirna-indhold kvantificeres ved hjælp af flerhulsplader mikrofluidisk kapllærelektroforese array-kort. Endvidere, denne protokol giver forskerne mulighed for at estimere cellulære miRNA og dermed lipoprotein partikel Optagelseshastigheden. En signifikant stigning i cellulære miRNA niveau er observerbare, når du bruger high-density lipoprotein (HDL) partikler kunstigt lastet med miRNA, hvorimod inkubation med indfødte HDL-partikler ikke giver nogen signifikant effekt på grund af deres temmelig lav miRNA indhold. I modsætning hertil ændrede cellulære optagelse af lav-density lipoprotein (LDL) partikler-hverken med indfødte miRNA eller kunstigt lastet med det-ikke ændre det cellulære miRNA niveau.

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer 

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Her præsenteres en kvantitativ real-time polymerase kæde reaktions baseret protokol til bestemmelse af det oprindelige Micro-RNA indhold (absolutte/relative) af lipoprotein partikler. Desuden er en metode til at øge mikro-RNA-niveauet, samt en metode til bestemmelse af cellulære optagelse sats af lipoprotein partikler, påvist.

Berigelse af Native lipoprotein partikler med microRNA og efterfølgende bestemmelse af deres absolutte/relative microRNA indhold og deres cellulære overførselshastighed

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Lipoprotein partikler er indfødte transportkøretøjer. Berigelse af fremmede stoffer gør det lettere at anvende dem som sporbærer. Specifik mærkning af molekyler eller hele partikler gør det muligt at måle den cellulære optagelse.De to metoder til berigelse er hurtige og nemme at anvende og kan tilpasses til en lang række stoffer. Demonstration af proceduren vil være Markus Axmann og Andreas Karner, to postdocs fra mit laboratorium. Til at begynde afdædning i en røghætte blandes en til to milliliter forberedt HDL-opløsning, der indeholder fem milligram HDL-partikler, med 50 milliliter forkølet tre-til-to blanding af ethanoldiethylether i et konisk centrifugeringsrør.Inkubere i to timer ved negative 20 grader Celsius. Centrifuge ved 2500 gange g i 10 minutter ved negative 10 grader Celsius. Kassér supernatanten, opslæmp pellet i 50 milliliter forkølet ethanol diethyl ether blanding, og vortex kort.Inkuber en anden gang i to timer ved negative 20 grader Celsius. Centrifuge igen ved 2500 gange g i 10 minutter ved negative 10 grader Celsius. Derefter indsætte slanger leverer kvælstof gas flow til at tørre pellet.Og resuspend det i 250 mikroliter af buffer A.Determine proteinkoncentrationen ved hjælp af Bradford protein assay eller en anden passende. Det er afgørende at fjerne eventuelle rester af ethanol diethyl ether blandingen, da disse opløsningsmidler ville hæmme relipidation af apolipoproteiner. Dernæst fortyndes til en endelig koncentration af en milligram protein pr 250 mikroliter buffer A.Indsæt en slange, der leverer inert gas i opløsningsdelen i røret.Hvis det er nødvendigt, opbevares opløsningen natten over ved fire grader Celsius under den inerte gasatmosfære. For at begynde rekonstitution, i et rent glasrør, bland 100 mikroliter CO, 13,5 mikroliter C, og 500 mikroliter pc. Drej derefter glasrøret, mens nitrogengassen skylles inde i røret for at tørre blandingen for at give et homogent overfladelag. I et 0,5 milliliter reaktionsrør fremstilles en frisk 30-millimolar spermineopløsning i buffer A.Bland derefter 100 mikroliter af 10-mikromolar syntetisk mikroRNA med 100 mikroliter sperminopløsning i et to milliliter reaktionsrør.Og inkubere i 30 minutter ved 30 grader Celsius. Dernæst overføres den inkuberede 200-mikroliteropløsning til glasrøret for at rehydrere det forberedte PC-CO-C mastermix overfladelag. Og derefter tilføje 50 mikroliter af en 30 milligram per milliliter natrium deoxycholate opløsning.Rør ved fire grader Celsius i to timer. Derefter tilsættes 250 mikroliter af den afvængede HDL-opløsning i glasrøret. Og rør ved fire grader Celsius natten over.For at begynde dialyse, først tilføje 50 gram adsorbent perler til 800 milliliter dobbelt-destilleret vand. Og brug en magnetisk omrører til at røre i et minut. Vent 15 minutter for perlerne at bosætte sig, og dekantere supernatant.Gentag proceduren med forkølet PBS. Fortætte dialysekassetter i PBS. Brug en sprøjte til at lægge den tidligere forberedte blanding i kassetterne i overensstemmelse med producentens anvisninger.Tilsæt PBS-behandlede adsorbent perler til tre liter PBS, og læg kassetterne i PBS til dialyze ved fire grader Celsius. Perlerne holder tætheden gradient langs dialyse membran konstant. Skift buffer og perlerne efter en time og to timer.Efter 24 timer, med en sprøjte, skal opløsningen trækkes ud af kassetten i et 1,5 milliliter reaktionsrør for at genvinde den rekonstituerede HDL-partikelopløsning. Proteinkoncentrationen bestemmes ved hjælp af Bradford-analysen. Der leveres inert gas til reaktionsrøret, forsegles og den rekonstituerede HDL-partikelopløsning opbevares under inert gasatmosfære ved fire grader Celsius.Først forberede en frisk 30-millimolar spermine opløsning i RNAse-fri vand. Bland 100 mikroliter af 10 mikromolar syntetisk mikroRNA med 100 mikroliter spermineopløsning i et to milliliter reaktionsrør. Og inkubere i 30 minutter ved 30 grader Celsius.Derefter tilsættes 100 mikroliter DMSO og 1,2 milliliter 1X LDL buffer til den forberedte microRNA spermine opløsning. Fortyndes tidligere fremstillet LDL partikelopløsning med PBS til en endelig koncentration på ca. 4 mg/ml. Træk derefter 450 mikroliter af den fortyndede opløsning ind i et 1,5 milliliter reaktionsrør, og bland med 50 mikroliter af 10X LDL buffer.Inkuber den i 10 minutter på is. Efter inkubationen kombineres 500-mikroliter LDL-partikelopløsningen og 1,5-milliliter microRNA-spermine-DMSO-opløsningen, og den inkuberes i to timer ved 40 grader Celsius. Udfør dialyse lignende som tidligere beskrevet, og opbevar den mærkede LDL partikelopløsning under inert gasatmosfære ved fire grader Celsius.Til at begynde, fortyndes HDL eller LDL partikelopløsning i PBS mellem en-til-100 og en-til-1, 000. Kløve glimmer ved at trykke tape mod glimmer substrat, og trække båndet ud for at fjerne de øverste glimmer lag. Brug en pipette til at deponere to mikroliter på nykløveret glimmer til at inkubere i fem minutter.Lipoprotein partikler tendens til at danne kontinuerlig binding membraner på overflader. Derfor er det vigtigt at justere partikelkoncentrationen på glimmeroverfladen for at få individuelle. Efter inkubation skylles prøven med PBS.Fyld højhastigheds-AFM-væskecellen med PBS, og monter den glimmerbærende scanner til højhastigheds-AFM-fasen. I kontrol-software, starte tilgangsprocessen af cantilever til glimmer overflade. Brug scanningsstørrelser mindre end et kvadratisk mikrometer, og hold billedkræfterne så lave som muligt.Billede eksemplet i trykketilstand. Indlæs dataene i Gwyddion, og detekter partiklerne via mærkekornene ved tærskelfunktion. Juster højdetærsklensværdien for at maskere de enkelte partikler.Normalt er et niveau på omkring 50% et godt udgangspunkt. Fjern polynomial baggrund for at samkopiere billedet, og aktivér indstillingen Udeluk maskeret område. Eksporter de maksimale højdeværdier for de fundne partikler ved hjælp af fordelingen af forskellige kornegenskaber funktion, og gentag disse trin for alle optagede billeder.I dette eksperiment blev rekonstitution af HDL-partikler udført gennem afdæbning af HDL-partikler efterfulgt af relipidation og dialyse. Der kan opnås et udbytte på 50 % rekonstituerede HDL-partikler. Den samme mærkning med microRNA var imidlertid ikke mulig for mærkning af LDL-partikler på grund af hydrofomboliiteten af apolipoprotein B100-proteinet.DMSO blev således anvendt til indtrængning af lipidmonstræber af LDL-partiklerne, med et udbytte tæt på 100% Under kvalitetskontrol er fortyndingen afgørende for analyse. Det øverste billede viser en for høj partikeltæthed. Det nederste billede er egnet til analyse.Sandsynlighedstæthedsfunktioner af partikelhøjder blev beregnet til sammenligning af størrelsesfordelinger af de oprindelige, mærkede og mærkede kontrol lipoproteinpartikler. Den relative ændring før og efter mærkningsproceduren kan forsømmes. Ved håndtering af RNA oligonukleotider skal du arbejde RNAse-fri.Brug friske engangsplastforbrugsstoffer, og brug altid handsker. Brug kun nukleasefri løsninger. High-speed AFM er blot én metode til at bestemme den generelle form af lipoproteiner.En alternativ metode ville være elektronmikroskopi. Bær passende personligt beskyttelsesudstyr, og arbejd i en røghætte, mens du håndterer diethylether.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

En effektiv metode til syntese af Peptoider med Blandet lysin-type / Arginin-type monomerer og evaluering af deres anti-Leishmania aktivitet

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Syntese af 1,2-Azaborines og udarbejdelsen af ​​deres proteinkomplekser med T4 lysozym Mutants

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestemmelse af glycogenindholdet i cyanobakterier

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Meget følsom og kvantitativ påvisning af proteiner og deres isoformer af kapillar isoelektrisk fokusering metode

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Dannelsen af kovalent DNA adukter af enzymatisk aktiveret kræftfremkaldende stoffer og narkotika In Vitro og deres bestemmelse af 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteom analyse af kontekst-specifik proteinkomplekser i deres Native cellulære miljø

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spektrofotometrisk bestemmelse af Phycobiliprotein indhold i Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering af fysiologisk aktive tylakoiderne og deres anvendelse i energiafhængige Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Hybrid Clear/blå Native elektroforese til separation og analyse af Mitokondrial respirations kæde Superkomplekser

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolering af lipoprotein partikler fra hønseæg æggeblomme til undersøgelse af bakteriel Patogenchlorid fedtsyre inkorporering i membran Fosfolipids

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...