Name: enrichment of native lipoprotein particles with microrna and subsequent determination of their absolute/relative microrna content and their cellular transfer rate
Uploaded: 2019-05-09T15:00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer

Ce travail a été appuyé par le projet du Fonds scientifique autrichien P29110-B21, le projet «Hochschuljubiläumsstiftung der Stadt Wien zur Förderung der Wissenschaft» H-3065/2011, le Fonds européen pour le développement régional (EFRE, IWB2020), l’État fédéral de la haute L’Autriche, et le «Land OÖ Basisfinanzierung».

<ol>
	<li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins.">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 423-435 (2011).</li><li>Tabet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-transferred+microRNA-223+regulates+ICAM-1+expression+in+endothelial+cells.">HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Wahid, F., Shehzad, A., Khan, T., Kim, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Synthesis,+mechanism,+function,+and+recent+clinical+trials.">MicroRNAs: Synthesis, mechanism, function, and recent clinical trials.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1803 (11), 1231-1243 (2010).</li><li>Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+Mechanisms+of+miRNAs+and+siRNAs.">Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs.</a> Cell. 136 (4), 642-655 (2009).</li><li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+Translation+and+Stability+by+microRNAs.">Regulation of mRNA Translation and Stability by microRNAs.</a> Annual Review of Biochemistry. 79 (1), 351-379 (2010).</li><li>Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+post-transcriptional+regulation+by+microRNAs:+Are+the+answers+in+sight?.">Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: Are the answers in sight?.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).</li><li>Jonas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+High-Density+Lipoproteins.">Reconstitution of High-Density Lipoproteins.</a> Methods in Enzymology. , 553-582 (1986).</li><li>Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+AFM+and+Applications+to+Biomolecular+Systems.">High-Speed AFM and Applications to Biomolecular Systems.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 393-414 (2013).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments.">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Patsch, J. R., Patsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonal+ultracentrifugation.">Zonal ultracentrifugation.</a> Methods in Enzymology. 129 (1966), 3-26 (1986).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Yamamoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Techniques+for+Observing+Dynamic+Biomolecular+Processes.">High-Speed Atomic Force Microscopy Techniques for Observing Dynamic Biomolecular Processes.</a> Methods in Enzymology. 475, 541-564 (2010).</li><li>Stangl, H., Cao, G., Wyne, K. L., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+receptor,+class+B,+type+I-dependent+stimulation+of+cholesterol+esterification+by+high+density+lipoproteins,+low+density+lipoproteins,+and+nonlipoprotein+cholesterol.">Scavenger receptor, class B, type I-dependent stimulation of cholesterol esterification by high density lipoproteins, low density lipoproteins, and nonlipoprotein cholesterol.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (47), 31002-31008 (1998).</li><li>Hochberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+a+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: a Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. 57 (1), 289-300 (1995).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization.">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biology. 10 (6), (2009).</li><li>Schumaker, V. N., Puppione, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=6]+Sequential+Flotation+Ultracentrifugation.">6] Sequential Flotation Ultracentrifugation.</a> Methods in Enzymology. 128 (C), 155-170 (1986).</li><li>Wagner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+levels+and+cellular+transfer+of+circulating+lipoprotein-bound+microRNAs.">Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1392-1400 (2013).</li><li>Meier, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+chronic+kidney+disease+on+macrophage+cholesterol+efflux.">Effect of chronic kidney disease on macrophage cholesterol efflux.</a> Life Sciences. 136, 1-6 (2015).</li><li>Axmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+and+Lipoprotein+Particle+miRNA+Profile+in+Uremia+Patients.">Serum and Lipoprotein Particle miRNA Profile in Uremia Patients.</a> Genes. 9 (11), 533 (2018).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, l’isolement des fractions de particules de lipoprotéine du sang humain et la détermination de leur contenu individuel de miRNA est décrit étape par étape. Il est essentiel de travailler dans un environnement exempt de RNase tout en manipulant le miRNA isolé et synthétisé — le miRNA incorporé aux particules est manifestement à l’abri de la dégradation enzymatique. Comme le rapport miRNA/particule des particules de lipoprotéines indigènes est assez faible, l’enrichissement artificiel avec miRNA est nécessaire pour étudier l’absorption des particules Holo des cellules. Ainsi, la reconstitution des particules de HDL comme décrit précédemment7 est modifiée pour incorporer les brins de mirna. En outre, la séparation de la fraction lipidique et protéique au cours de cette procédure permet aux scientifiques d’examiner les composants associés aux lipides et aux protéines de la particule de lipoprotéine19. De la même manière, la procédure d’étiquetage des particules de LDL est adaptée. Il est intéressant de noter que l’addition de spermine — un stabilisateur naturel des nucléotides — n’a pas influencé le rapport miRNA/particule. Il convient de noter que, en principe, la méthode permet l’inpliage d’autres substances que le miRNA dans une particule de lipoprotéine. Bien sûr, il y a une limite en ce qui concerne la taille physique de la substance en fonction de la taille globale du HDL (diamètre: 5-12 nm) et des particules de LDL (diamètre: 18-25 nm).
En ce qui concerne le contrôle de la qualité des particules de lipoprotéines reconstituées/étiquetées, HS-AFM est une méthode applicable pour caractériser les particules de HDL/LDL au niveau de la particule unique. Par rapport à l’EM, il permet des temps de préparation plus courts et des conditions quasi-physiologiques (humides, température ambiante).
En raison de sa sensibilité inhérente et de son amplification, la qPCR est la méthode de choix pour détecter les faibles concentrations de miRNA. Alternativement, la microscopie à fluorescence à une seule molécule, qui est capable de détecter même des molécules individuelles, ne serait pas appropriée en raison des faibles concentrations, par exemple, de brins de miRNA marqués par fluorescence par particule. Ainsi, le ratio des brins de miRNA par particule de lipoprotéine native s’est révélé être 10-8. L’enrichissement artificiel augmente le ratio d’un facteur de 10 000, ce qui facilite l’estimation du taux d’absorption des lipoprotéines cellulaires (aucune différence significative n’est détectée à l’aide de particules de lipoprotéines indigènes 19). La sensibilité élevée de la qPCR permet de déterminer ce taux d’absorption en mesurant le nombre de brins de miRNA après le temps d’incubation et le rapport miRNA/particule. Il convient de noter que la valeur calculée ignore la dégradation cellulaire et la libération de miRNA et, par conséquent, représente au moins une limite inférieure pour le ratio d’absorption des particules de lipoprotéine.
À l’avenir, la méthode peut être adaptée pour transférer des substances pharmaceutiques (notamment des lipophiles) dans les cellules et corréler leur effet biologique à la concentration intracellulaire (déterminée par le taux d’absorption des particules de lipoprotéines).

Les particules de lipoprotéines sont composées d’une monocouche de lipides amphiphiles et de cholestérol renfermant un noyau d’esters cholestérylés et de graisses triglycérides. La particule entière est stabilisée par des apolipoprotéines intégrées à la membrane, qui définissent la fonctionnalité biologique de la particule. Les particules de lipoprotéines peuvent être distinguées en fonction de leur densité croissante respective et, par conséquent, de la taille décroissantes, à savoir les lipoprotéines de très basse densité (VLDL), les lipoprotéines de densité intermédiaire (IDL), les LDL et les particules de HDL. Malgré le transport de composants insolubles dans l’eau dans la circulation sanguine, il a été démontré que les particules de HDL transportent des brins non codant de mirna1,2. Les micro-RNAs sont une classe de brins d’ARN courts (généralement deux douzaines de nucléotides), qui dégradent les brins d’ARNm complémentaires intracellulares et, par conséquent, modifient le profil d’expression de certaines protéines3,4,5, le 6. En outre, les modifications du profil miRNA ont été trouvées dans une variété de maladies et, par conséquent, le profil est applicable en tant que biomarqueur pour le diagnostic et le pronostic. Le transport extracellulaire de miRNAs entre les cellules par l’intermédiaire de particules de lipoprotéines peut servir de mécanisme supplémentaire pour la modulation de niveau d’ARNm intercellulaire. Pour estimer quantitativement l’effet biologique, il est nécessaire de connaître la teneur en miRNA absolue et relative des particules de lipoprotéines.
La PCR quantitative en temps réel est une méthode appropriée et relativement rapide pour obtenir cette information. Par conséquent, la valeur relative de quantification (RQ) peut être calculée, et les différences relatives entre les différents échantillons et les fractions de lipoprotéine sont estimables. Les cartes multipuits microfluidiques sont une méthode rapide et facile à utiliser pour déterminer la présence relative (équivaut à la valeur RQ) des miRNAs dans un échantillon. Les cartes multipuits microfluidiques sont constituées de 96 ou 384 chambres de réaction individuelles pour les réactions de qPCR individuelles incorporées dans un dispositif microfluidique. Chaque chambre contient la sonde d’hydrolyse requise et des amorces spécifiques de qPCR pour un miRNA individuel. Les avantages sont un temps de manipulation court en raison de la normalisation, un workflow simple, et un nombre réduit d’étapes de pipetage. De plus, le volume d’échantillonnage requis est minimisé. Contrairement à la quantification relative, le contenu absolu de miRNA nécessite une comparaison des résultats de l’échantillon de qPCR avec des courbes standard de nombres absolus connus de brins de miRNA. Il convient de noter que, en raison de leur teneur relativement faible en miRNA, la norme et, en outre, même les techniques d’imagerie sensibles à une seule molécule ne sont pas réalisables — l’enrichissement artificiel des particules de lipoprotéine avec miRNA est inévitable pour étudier les cellules cellulaires l’interaction des particules de lipoprotéines et le transfert de miRNA. En ce qui concerne cette, la déconcentration de la particule de HDL suivie de la relipidation subséquente7 permet l’incorporation de et, par conséquent, l’enrichissement avec des brins de mirna. L’enrichissement similaire des particules de LDL avec le miRNA n’est pas réalisable en raison de l’hydrophobicité de la protéine apoB-100, qui est le constituant principal de la particule de LDL. Cependant, par addition du diméthyl sulfoxyde de solvant polaire (DMSO), qui est capable de pénétrer les membranes lipidiques, les particules de LDL peuvent être chargées artificiellement avec des brins de miRNA aussi bien.
La microscopie à force atomique à grande vitesse (HS-AFM) est un outil puissant pour la caractérisation des spécimens biologiques offrant une résolution temporelle de subnanomètre spatiale et sous-seconde8. Par conséquent, il s’agit d’une technique bien adaptée pour le contrôle de la qualité des particules de lipoprotéines modifiées, car les particules de lipoprotéines natives/reconstituées/étiquetées peuvent être imagées dans un environnement quasi physiologique.
Ici, un protocole basé sur qPCR est présenté étape par étape pour déterminer la teneur absolue/relative en miRNA des particules de lipoprotéines et des échantillons de cellules, ce qui permet une estimation du taux de capture des particules de lipoprotéines cellulaires. En outre, une méthode pour l’enrichissement des particules de lipoprotéine avec miRNA est démontrée. Cette méthode peut être adaptée pour la manipulation générale de la teneur en lipoprotéines et, par conséquent, démontre l’applicabilité des particules de lipoprotéines comme cibles pour la délivrance de médicaments.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>TI 55.2</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer (EDTA)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366643</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaliumbromid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2110</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342414</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube sealer</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342428</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P029.2</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D/0650/50</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubes, MWCO 12 - 14k</td>
			<td>Spectra</td>
			<td>132700</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synthetic miRNA</td>
			<td>microSynth</td>
			<td>-</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 7</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 8</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile tubes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>ENE8.1</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf Biophotometer</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>XK20</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G-250 Stain</td>
			<td>BioRad GmbH</td>
			<td>161-0786</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3957.1</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>AustrAlco</td>
			<td>Ethanol Absolut 99.9%</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3942.1</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Multifuge X3R</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3313.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4627.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>P3556-25mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol oleate</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>C-9253-250mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>C8667-500mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass tubes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>K226.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spermine</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>S3256-1G</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>3097-25G</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>0955.2</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#181;L micropipettes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>A762.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9143.2</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amberlite XAD-2 beads</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>10357</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer casette (cut-off 20 kDa)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66003</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>465 76 83</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3054.2</td>
			<td>Labeling of LDL particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Labeling of LDL particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope</td>
			<td>RIBM</td>
			<td>SS-NEX</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscovite Mica (V-1 Grade)</td>
			<td>Christine Gr&#246;pl</td>
			<td>G250-1/V1</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Cantilever</td>
			<td>Nanoworld</td>
			<td>USC-F1.2-k0.15</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gwyddion 2.49</td>
			<td>Czech Metrology Institute</td>
			<td>http://gwyddion.net</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slides, Nunc Lab-Tek</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9117.1</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Omni Life Science GmbH</td>
			<td>Casy</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>217004</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Sterican 465 75 19</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309050</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cabinet</td>
			<td>Esco</td>
			<td>PCR-3A1</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4366596</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free water</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T143</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 ml tubes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781305</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>Microcentrifuge AL</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Sensoquest</td>
			<td>Labcycler</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Primer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal probe supermix</td>
			<td>BioRad GmbH</td>
			<td>1725131</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Corbett</td>
			<td>Rotor-Gene RG-6000</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366596</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4399966</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4391128</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4399933</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal Master Mix II, no UNG</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4440040</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA Human A Cards</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A31805</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0581</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (25mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0971</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9849</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7900HT Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4351405</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Array Card Sealer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>-</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native lipoprotein particles with microrna and subsequent determination of their absolute/relative microrna content and their cellular transfer rate

Les particules de lipoprotéines sont principalement des transporteurs de lipides et de cholestérol dans la circulation sanguine. En outre, ils contiennent de petites quantités de brins de microRNA non codant (miRNA). En général, miRNA modifie le profil d’expression protéique en raison des interactions avec l’ARN messager (mRNA). Ainsi, la connaissance de la teneur en miRNA relative et absolue des particules de lipoprotéines est essentielle pour estimer l’effet biologique de l’absorption des particules cellulaires. Ici, un protocole quantitatif en temps réel de réaction en chaîne de la polymérase (qPCR) est présenté pour déterminer la teneur absolue en miRNA des particules de lipoprotéines — illustré pour les particules de lipoprotéines natives et enrichifiées par le miRNA. Le contenu miRNA relatif est quantifié à l’aide de cartes multipuits microfluidiques. En outre, ce protocole permet aux scientifiques d’estimer le miRNA cellulaire et, par conséquent, le taux de capture des particules lipoprotéiques. Une augmentation significative du niveau de miRNA cellulaire est observable lors de l’utilisation de particules de lipoprotéines de haute densité (HDL) chargées artificiellement avec le miRNA, tandis que l’incubation avec des particules de HDL indigènes ne donne aucun effet significatif en raison de leur teneur assez faible en miRNA. En revanche, l’absorption cellulaire des particules de lipoprotéines de basse densité (LDL) — ni avec le miRNA natif, ni avec elle, ne modifie pas le niveau de miRNA cellulaire.

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer 

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Ici, un protocole quantitatif en temps réel basé sur la réaction en chaîne de la polymérase est présenté pour la détermination de la teneur en micro-ARN native (absolue/relative) des particules de lipoprotéines. En outre, une méthode pour augmenter le niveau de micro-ARN, ainsi qu’une méthode pour déterminer le taux d’absorption cellulaire des particules de lipoprotéines, est démontrée.

Enrichissement de particules de lipoprotéines indigènes avec microRNA et détermination subséquente de leur teneur absolue/relative de microRNA et de leur taux de transfert cellulaire

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Les particules de lipoprotéine sont des véhicules de transport indigènes. L’enrichissement de substances étrangères facilite leur utilisation comme transporteur de voies. L’étiquetage spécifique des molécules ou des particules entières permet de mesurer l’absorption cellulaire.Les deux méthodes d’enrichissement sont rapides et faciles à utiliser, et peuvent être adaptées pour un large éventail de substances. Markus Axmann et Andreas Karner, deux postdocs de mon labo, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer la délipidation dans un capot de fumée, mélangez un à deux millilitres de solution HDL préparée contenant cinq milligrammes de particules HDL avec 50 millilitres de mélange pré-refroidi de trois à deux mélanges d’éther de détyle d’éthanol dans un tube de centrifugation conique.Incuber pendant deux heures à 20 degrés Celsius négatif. Centrifugeuse à 2500 fois g pendant 10 minutes à 10 degrés Celsius négatifs. Jetez le supernatant, resuspendez la pastille en 50 millilitres de mélange d’éther de détyle d’éthanol pré-refroidi, et vortex brièvement.Incuber une deuxième fois pendant deux heures à 20 degrés Celsius négatifs. Centrifugeuse à nouveau à 2500 fois g pendant 10 minutes à 10 degrés Celsius négatifs. Insérez ensuite des tubes qui fournissent le flux de gaz azoté pour sécher la pastille.Et le resuspendre en 250 microlitres de tampon A.Déterminer la concentration de protéines en utilisant l’analyse de la protéine Bradford ou un autre approprié. Il est essentiel d’éliminer les restes du mélange d’éther de diéthyle d’éthanol, car ces solvants inhiberaient la relipidation des apolipoprotéines. Ensuite, diluer à une concentration finale d’un milligramme de protéines par 250 microlitres de tampon A.Insérer un tube fournissant du gaz inerte dans la partie solution dans le tube.Au besoin, conserver la solution pendant la nuit à quatre degrés Celsius sous l’atmosphère inerte du gaz. Pour commencer la reconstitution, dans un tube de verre propre, mélanger 100 microlitres de CO, 13,5 microlitres de C et 500 microlitres de PC. Faites ensuite pivoter le tube de verre tout en rinçant le gaz azoté à l’intérieur du tube pour sécher le mélange afin de produire une couche de surface homogène. Dans un tube de réaction de 0,5 millilitre, préparer une solution de spermine fraîche de 30 millimlaires dans le tampon A.Then mélanger 100 microlitres de microARN synthétique de 10 micromlaires avec 100 microlitres de solution spermine dans un tube de réaction de deux millilitres.Et incuber pendant 30 minutes à 30 degrés Celsius. Ensuite, transférez la solution incubée de 200 microlitres dans le tube de verre pour réhydrater la couche de surface préparée du mastermix PC-CO-C. Et puis ajouter 50 microlitres d’une solution de désoxycholate de sodium de 30 millilitres par millilitre.Remuer à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Après cela, ajouter 250 microlitres de la solution HDL délipidée dans le tube de verre. Et remuer à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Pour commencer la dialyse, ajoutez d’abord 50 grammes de perles adsorbentes à 800 millilitres d’eau double distillée. Et utilisez un agitateur magnétique pour remuer pendant une minute. Attendez 15 minutes pour que les perles se déposent et décantent le surnatant.Répétez la procédure avec du PBS pré-refroidi. Cassettes de dialyse pré-humides en PBS. Utilisez une seringue pour ajouter le mélange préalablement préparé dans les cassettes selon les instructions du fabricant.Ajouter les perles adsorbent traitées par PBS à trois litres de PBS et placer les cassettes dans le PBS pour les dialyser à quatre degrés Celsius. Les perles maintiennent le gradient de densité le long de la membrane de dialyse constante. Changer le tampon et les perles après une heure et deux heures.Après 24 heures, avec une seringue, extraire la solution de la cassette dans un tube de réaction de 1,5 millilitre pour récupérer la solution de particules HDL reconstituée. Déterminer la concentration de protéines à l’aide de l’analyse bradford. Fournissez du gaz inerte au tube de réaction, scellez-le et stockez la solution de particules HDL reconstituée sous une atmosphère de gaz inerte à quatre degrés Celsius.Tout d’abord, préparer une solution de spermine fraîche de 30 millimlaires dans de l’eau sans RNAse. Mélangez 100 microlitres de 10 micromolaires de microARN synthétique avec 100 microlitres de solution spermine dans un tube de réaction de deux millilitres. Et incuber pendant 30 minutes à 30 degrés Celsius.Ajoutez ensuite 100 microlitres de DMSO et 1,2 millilitres de tampon 1X LDL à la solution de spermine microARN préparée. Diluer la solution de particules LDL préparée précédemment avec PBS à une concentration finale d’environ quatre milligrammes par millilitre. Puis dessiner 450 microlitres de la solution diluée dans un tube de réaction de 1,5 millilitre, et mélanger avec 50 microlitres de tampon LDL 10X.Incubez-le pendant 10 minutes sur la glace. Après l’incubation, combinez la solution de particules LDL de 500 microlitres et la solution microARN-spermine-DMSO de 1,5 millilitre, et incubez-la pendant deux heures à 40 degrés Celsius. Effectuez une dialyse similaire à celle décrite précédemment et stockez la solution de particules LDL étiquetée sous atmosphère de gaz inerte à quatre degrés Celsius.Pour commencer, diluer la solution de particules HDL ou LDL dans PBS entre un à 100 et un à 1000. Fendre le mica en appuyant sur le ruban adhésif contre le substrat de mica, et en tirant le ruban pour enlever les couches supérieures de mica. Utilisez une pipette pour déposer deux microlitres sur du mica fraîchement fendue pour incuber pendant cinq minutes.Les particules de lipoprotéine ont tendance à former des membranes de liaison continues sur les surfaces. Par conséquent, il est important d’ajuster la concentration de particules sur la surface du mica pour obtenir des concentrations individuelles. Après l’incubation, rincer l’échantillon avec du PBS.Remplissez la cellule liquide AFM à grande vitesse avec PBS et montez le scanner porteur de mica jusqu’au stade afm à grande vitesse. Dans le logiciel de contrôle, démarrer le processus d’approche du porte-à-faux à la surface mica. Utilisez des tailles d’analyse inférieures à un micromètre carré et maintenez les forces d’imagerie aussi faibles que possible.Imagez l’échantillon en mode taraudage. Chargez les données dans le Gwyddion et détectez les particules via les grains de marque par fonction de seuil. Ajustez la valeur du seuil de hauteur pour masquer les particules individuelles.Habituellement, un niveau d’environ 50% est un bon point de départ. Supprimez l’arrière-plan polynomial pour aplatir l’image et activez l’option exclure la région masquée. Exportez les valeurs maximales de hauteur des particules détectées en utilisant la distribution de diverses caractéristiques céréalières et répétez ces étapes pour toutes les images enregistrées.Dans cette expérience, la reconstitution des particules de HDL a été exécutée par la délipidation des particules de HDL, suivie de la relipidation et de la dialyse. Un rendement de 50 % des particules HDL reconstituées peut être atteint. Cependant, le même étiquetage avec microARN n’était pas faisable pour l’étiquetage des particules de LDL, en raison de l’hydrophobicité de la protéine B100 d’apolipoprotéine.Ainsi, DMSO a été utilisé pour la pénétration de la monocouche lipidique des particules LDL, avec un rendement proche de 100% Pendant le contrôle de la qualité, la dilution est critique pour l’analyse. L’image du haut montre une densité de particules trop élevée. L’image du bas convient à l’analyse.Les fonctions de densité de probabilité des hauteurs de particules ont été calculées pour la comparaison des distributions de taille des particules lipoprotéines de contrôle indigènes, étiquetées et étiquetées. Le changement relatif avant et après la procédure d’étiquetage est négligé. Lorsque vous manipulez des oligonucléotides d’ARN, travaillez sans RNAse.Utilisez des consommables en plastique jetables frais et portez toujours des gants. N’utilisez que des solutions sans nucléase. L’AFM à grande vitesse n’est qu’une méthode pour déterminer la forme générale des lipoprotéines.Une autre méthode serait la microscopie électronique. Portez l’équipement approprié de protection personnelle, et travaillez dans une hotte de fumée tout en manipulant l’éther de dithyle.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

Une méthode efficace pour la synthèse de Peptoïdes avec Monomères / Arginine type de type Lysine mixte et de l&#39;évaluation de leur activité anti-leishmaniose

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

Recherche

Biochimie

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Synthèse de 1,2-Azaborines et la préparation de leurs complexes protéiques avec T4 lysozyme Mutants

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Détermination du contenu en glycogène dans les cyanobactéries

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Détection très sensible et Quantitative des protéines et leurs isoformes par isoélectrofocalisation capillaire méthode

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation de l’ADN Covalent adduits cancérogènes enzymatiquement activés et médicaments In Vitro et leur détermination par 32P-post-marquage

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — L’analyse protéomique des Complexes de protéines spécifiques au contexte dans leur environnement natif cellulaire

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Dosage spectrophotométrique du Phycobiliprotein en cyanobactérie Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolement des thylakoïdes physiologiquement actives et leur utilisation dans des essais de Transport protéine dépendant de l’énergie

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Électrophorèse hybride Clear/Blue native pour la séparation et l’analyse des supercomplexes de la chaîne respiratoire mitochondriale

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolement des particules de lipoprotéine du jaune d'oeuf de poulet pour l'étude de l'incorporation d'acide gras de pathogène bactérien dans les phospholipides de membrane

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...