Name: enrichment of native lipoprotein particles with microrna and subsequent determination of their absolute/relative microrna content and their cellular transfer rate
Uploaded: 2019-05-09T15:00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer

Unterstützt wurde diese Arbeit vom Wissenschaftsfonds Projekt P29110-B21, der Hochschuljubiläumsstiftung der Stadt Wien zur Förderung der Wissenschaft, dem Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE, IWB2020), dem Land Oberer Österreich, und die "Land OÖ Basisfinanzierung".

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier wird Schritt für Schritt die Isolierung von Lipoprotein-Teilchenfraktionen aus menschlichem Blut und die Bestimmung ihres individuellen MiRNA-Inhalts beschrieben. Es ist wichtig, in einer rNase-freien Umgebung zu arbeiten, während man mit isolierten und synthetisierten miRNA umgeht — die partikelembedded miRNA offensichtlich vor enzymatischen Abbaumaßnahmen geschützt ist. Da das miRNA/-Partikel-Verhältnis von einheimischen Lipoprotein-Partikeln eher gering ist, ist eine künstliche Anreicherung mit miRNA erforderlich, um die Holo-Partikelaufnahme von Zellen zu untersuchen. Dabei wird die Rekrekonstitution von HDL-Partikeln, wie sie zuvorbeschrieben wurde, in miRNA-Stränge modifiziert. Darüber hinaus ermöglicht die Trennung der Lipid-und Proteinfraktion während dieses VerfahrensdenWissenschaftlern, Lipid-und Eiweißbestandteile des Lipoprotein-Teilchens 19 zu untersuchen. In ähnlicher Weise wird der Beschriftungsvorgang von LDL-Teilchen angepasst. Interessanterweise hat die Zugabe von Sperma — einem natürlichen Stabilisator von Nukleotiden — das miRNA/Partikelverhältnis nicht beeinflusst. Es ist zu beachten, dass die Methode grundsätzlich die Einfaltung von anderen Stoffen als miRNA innerhalb eines Lipoprotein-Teilchens erlaubt. Natürlich gibt es eine Grenze in Bezug auf die physikalische Größe des Stoffes, basierend auf der Gesamtgröße von HDL (Durchmesser: 5-12 nm) und LDL-Partikeln (Durchmesser: 18-25 nm).
Was die Qualitätskontrolle von rekonstituierten/beschrifteten Lipoprotein-Partikeln betrifft, so ist HS-AFM eine anwendbare Methode, um HDL/LL-Partikel auf der einzelnen Partikelebene zu charakterisieren. Im Vergleich zu EM ermöglicht es kürzere Vorbereitungszeiten und nahezu physiologische Bedingungen (Nass, Raumtemperatur).
Aufgrund seiner inhärenten Empfindlichkeit und Verstärkung ist qPCR die Methode der Wahl, um niedrige miRNA-Konzentrationen zu erkennen. Alternativ wäre die einmolekulare empfindliche Fluoreszenzmikroskopie, die auch einzelne Moleküle erkennen kann, aufgrund der geringen Konzentrationen beispielsweise fluoreszierend als miRNA-Stränge pro Partikel nicht geeignet. So wurde das Verhältnis der miRNA-Stränge pro einheimischem Lipoprotein-Teilchen auf 10-8 gefunden. Künstliche Anreicherung erhöht das Verhältnis um den Faktor 10.000, was die Schätzung der zellulären Lipoprotein-Auftaktrate erleichtert (kein signifikanter Unterschied wird mit einheimischen Lipoprotein-Partikeln 19 erkannt). Die hohe Empfindlichkeit von qPCR ermöglicht es, diese Aufführungsrate zu ermitteln, indem die Anzahl der miRNA-Stränge nach der Inkubationszeit und dem miRNA/Partikelverhältnis gemessen wird. Es ist zu beachten, dass der berechnete Wert den zellulären Abbau und die Freisetzung von miRNA ignoriert und somit mindestens eine niedrigere Grenze für das Verhältnis der Lipoprotein-Partikel darstellt.
In Zukunft kann die Methode angepasst werden, um pharmazeutische Substanzen (insbesondere auch lipophile) in Zellen zu übertragen und ihre biologische Wirkung mit der intrazellulären Konzentration (die über die Auftaktrate von Lipoprotein-Partikeln bestimmt wird) zu korrelieren.

Lipoprotein-Partikel bestehen aus einem Monolayer aus Amphiphilen und Cholesterinschalen, die einen Kern aus Cholesterystestern und Triglyceridfetten umschließen. Stabilisiert wird das gesamte Teilchen durch Membran-eingebettete Apolipoproteine, die die biologische Funktionalität des Teilchens definieren. Lipoprotein-Partikel können je nach ihrer jeweiligen zunehmenden Dichte und damit abnehmender Größe unterschieden werden, nämlich als sehr wenig Dichte Lipoprotein (VLDL), mitteldichte Lipoprotein (IDL), LDL und HDL-Partikel. Trotz des Transports von wasserunlöslichen Komponenten im Blutkreislauf hat sich gezeigt, dass HDL-Partikel nicht-kodierende Stränge von miRNA1,2tragen. Mikro-RNAs sind eine Klasse von kurzen (in der Regel zwei Dutzend Nukleotiden) RNA-Strängen, die intrazellulär ergänzende mRNA-Stränge abbauen und dadurch das Expressionsprofil bestimmter Proteine 3, 4,5verändern, 6. Platz Darüber hinaus wurden Veränderungen des miRNA-Profils bei einer Vielzahl von Krankheiten festgestellt und somit als Biomarker für Diagnose und Prognose eingesetzt. Der extrazelluläre Transport von miRNAs zwischen Zellen über Lipoprotein-Partikel kann als zusätzlicher Mechanismus für die interzelluläre mRNA-Niveaumodulation dienen. Um den biologischen Effekt quantitativ zu schätzen, ist das Wissen über den absoluten und relativen miRNA-Gehalt von Lipoprotein-Partikeln erforderlich.
Quantitative Echtzeit-PCR ist eine geeignete und relativ schnelle Methode, um diese Informationen zu erhalten. So kann der relative Quantifizierungswert (RQ) berechnet werden, und es sind relative Unterschiede zwischen verschiedenen Proben und Lipoprotein-Braktionen abschätzbar. Multiwell mikrofluidische Array-Karten sind eine schnelle und einfach zu bedienende Methode, um die relative Präsenz (entspricht dem RQ-Wert) von miRNAs in einer Probe zu bestimmen. Multiwell mikrofluidische Array-Karten bestehen aus 96 oder 384 einzelnen Reaktionskammern für einzelne QPCR-Reaktionen, die in ein mikrofluidisches Gerät eingebettet sind. Jede Kammer enthält die erforderliche Hydrolyse-Sonde und spezielle QPCR-Primer für eine einzelne miRNA. Die Vorteile sind eine kurze Bearbeitungszeit durch Standardisierung, ein einfacher Arbeitsablauf und eine reduzierte Anzahl von Pipettierschritten. Zudem wird das benötigte Probenvolumen minimiert. Im Gegensatz zur relativen Quantifizierung erfordert der absolute miRNA-Gehalt einen Vergleich von QPCR-Probenergebnissen mit Standard-Kurven bekannter absoluter MiRNA-Stränge. Es sollte darauf hingewiesen werden, dass aufgrund ihres relativ niedrigen MiRNA-Gehalts, Standard-und darüber hinaus auch einmolekül-empfindliche bildgebende Verfahren nicht machbar sind — die künstliche Anreicherung von Lipoprotein-Partikeln mit miRNA ist unvermeidlich, um zelluläre Studie zu studieren Lipoprotein-Partikelinteraktion und miRNA-Übertragung. In diesem Zusammenhang ermöglicht die Delikatesse des HDL-Teilchens, das mit anschließender Verlässlichkeit7 einhergeht, die Einbindung und damit die Anreicherung mit miRNA-Strängen. Eine ähnliche Anreicherung von LDL-Partikeln mit miRNA ist aufgrund der Hydrophobizität des ApoB-100-Proteins, das der Hauptbestandteil des LDL-Teilchens ist, nicht möglich. Durch die Zugabe des polaren Lösemittels Dimethylsulfoxid (DMSO), das in der Lage ist, in Lipidmembranen einzudringen, können LDL-Partikel aber auch künstlich mit MiRNA-Strängen beladen werden.
Die Hochgeschwindigkeits-Atomkraftmikroskopie (HS-AFM) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Charakterisierung biologischer Proben, die subnanometer räumliche und subsekundenlange zeitliche Auflösung8bieten. Daher ist es eine gut geeignete Technik für die Qualitätskontrolle von modifizierten Lipoprotein-Partikeln, da native/reconstitetetete Lipoprotein-Partikel unter einer nahezu physiologischen Umgebung abgebildet werden können.
Hier wird Schritt für Schritt ein QPCR-basiertes Protokoll vorgestellt, um den absoluten/relativen miRNA-Gehalt von Lipoprotein-Partikeln und Zellproben zu bestimmen, was eine Abschätzung der zellulären Lipoprotein-Partikelaufnahme ermöglicht. Darüber hinaus wird eine Methode zur Anreicherung von Lipoprotein-Partikeln mit miRNA demonstriert. Diese Methode kann für die allgemeine Manipulation des Lipoprotein-Gehalts angepasst werden und demonstriert damit die Anwendbarkeit von Lipoprotein-Partikeln als Ziel für die Arzneimittelzufuhr.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>TI 55.2</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer (EDTA)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366643</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaliumbromid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2110</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342414</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube sealer</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342428</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P029.2</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D/0650/50</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubes, MWCO 12 - 14k</td>
			<td>Spectra</td>
			<td>132700</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synthetic miRNA</td>
			<td>microSynth</td>
			<td>-</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 7</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 8</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile tubes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>ENE8.1</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf Biophotometer</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>XK20</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G-250 Stain</td>
			<td>BioRad GmbH</td>
			<td>161-0786</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3957.1</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>AustrAlco</td>
			<td>Ethanol Absolut 99.9%</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3942.1</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Multifuge X3R</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3313.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4627.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>P3556-25mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol oleate</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>C-9253-250mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>C8667-500mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass tubes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>K226.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spermine</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>S3256-1G</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>3097-25G</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>0955.2</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#181;L micropipettes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>A762.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9143.2</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amberlite XAD-2 beads</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>10357</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer casette (cut-off 20 kDa)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66003</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>465 76 83</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3054.2</td>
			<td>Labeling of LDL particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Labeling of LDL particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope</td>
			<td>RIBM</td>
			<td>SS-NEX</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscovite Mica (V-1 Grade)</td>
			<td>Christine Gr&#246;pl</td>
			<td>G250-1/V1</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Cantilever</td>
			<td>Nanoworld</td>
			<td>USC-F1.2-k0.15</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gwyddion 2.49</td>
			<td>Czech Metrology Institute</td>
			<td>http://gwyddion.net</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slides, Nunc Lab-Tek</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9117.1</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Omni Life Science GmbH</td>
			<td>Casy</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>217004</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Sterican 465 75 19</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309050</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cabinet</td>
			<td>Esco</td>
			<td>PCR-3A1</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4366596</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free water</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T143</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 ml tubes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781305</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>Microcentrifuge AL</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Sensoquest</td>
			<td>Labcycler</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Primer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal probe supermix</td>
			<td>BioRad GmbH</td>
			<td>1725131</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Corbett</td>
			<td>Rotor-Gene RG-6000</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366596</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4399966</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4391128</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4399933</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal Master Mix II, no UNG</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4440040</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA Human A Cards</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A31805</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0581</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (25mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0971</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9849</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7900HT Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4351405</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Array Card Sealer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>-</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native lipoprotein particles with microrna and subsequent determination of their absolute/relative microrna content and their cellular transfer rate

Lipoprotein-Partikel sind überwiegend Transporter von Lipiden und Cholesterin im Blutkreislauf. Darüber hinaus enthalten sie kleine Mengen von Strängen der nicht-kodierenden microRNA (miRNA). In der Regel verändert miRNA das Protein-Expressionsprofil durch Interaktionen mit messenger-RNA (mRNA). Daher ist das Wissen um den relativen und absoluten miRNA-Gehalt von Lipoprotein-Partikeln unerlässlich, um die biologische Wirkung der Zellteilchenaufnahme abzuschätzen. Hier wird ein quantitatives Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) vorgestellt, um den absoluten miRNA-Gehalt von Lipoprotein-Teilchen zu bestimmen — für native und miRNA-angereicherte Lipoprotein-Teilchen exemplarisch dargestellt. Der relative miRNA-Inhalt wird mit multiwell mikrofluidischen Array-Karten quantifiziert. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll Wissenschaftlern, die zelluläre miRNA und damit die Lipoprotein-Partikelaufnahme zu schätzen. Eine signifikante Erhöhung des zellulären MiRNA-Niveaus ist bei der Verwendung von hochdichten Lipoprotein-Partikeln (HDL) zu beobachten, die künstlich mit miRNA beladen sind, während die Inkubation mit nativen HDL-Partikeln aufgrund ihres eher niedrigen MiRNA-Gehalts keine signifikante Wirkung hat. Im Gegensatz dazu — die zelluläre Aufnahme von Lipoprotein-Partikeln mit geringer Dichte (LDL) weder mit der einheimischen MiRNA noch künstlich beladen — den zellulären miRNA-Wert nicht verändert hat.

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Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Hier wird ein quantitatives Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsprotokoll zur Bestimmung des nativen Mikro-RNA-Gehalts (absolute/relativ) von Lipoprotein-Partikeln vorgestellt. Darüber hinaus wird eine Methode zur Erhöhung des Mikro-RNA-Niveaus sowie eine Methode zur Bestimmung der zellulären Aufnahmevorrate von Lipoprotein-Partikeln demonstriert.

Anreicherung von Ureinium Lipoprotein-Partikeln mit Mikro-RNA und anschließender Bestimmung ihrer Absolute/Relative MicroRNA-Inhalte und ihrer Celluläre Transferquote

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Lipoproteinpartikel sind native Transportfahrzeuge. Die Anreicherung von Fremdstoffen erleichtert deren Verwendung als Gleisträger. Die spezifische Kennzeichnung von Molekülen oder ganzen Partikeln macht es möglich, die zelluläre Aufnahme zu messen.Die beiden Anreicherungsmethoden sind schnell und einfach zu bedienen und können für eine Vielzahl von Stoffen angepasst werden. Demonstriert wird das Verfahren von Markus Axmann und Andreas Karner, zwei Postdocs aus meinem Labor. Um mit der Delipidation in einer Dunstabzugshaube zu beginnen, mischen Sie ein bis zwei Milliliter vorbereitete HDL-Lösung mit fünf Milligramm HDL-Partikeln mit 50 Millilitern vorgekühlter Drei-zu-zwei-Mischung aus Ethanoldiethylether in einem konischen Zentrifugationsrohr.Zwei Stunden bei minus 20 Grad Celsius inkubieren. Zentrifuge bei 2500 mal g für 10 Minuten bei negativen 10 Grad Celsius. Den Überstand entsorgen, das Pellet in 50 Milliliter vorgekühltem Ethanol-Diethyl-Ether-Gemisch wieder aufhängen und kurz wirbeln.Ein zweites Mal für zwei Stunden bei negativen 20 Grad Celsius inkubieren. Zentrifuge wieder bei 2500 mal g für 10 Minuten bei negativen 10 Grad Celsius. Legen Sie dann Schläuche ein, die Stickstoffgasstrom liefern, um das Pellet zu trocknen.Und setzen Sie es in 250 Mikroliter Puffer A. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford Protein-Assay oder einem anderen geeigneten. Es ist wichtig, Reste des Ethanol-Diethylether-Gemischs zu entfernen, da diese Lösungsmittel die Relipidation von Apolipoproteinen hemmen würden. Als nächstes auf eine Endkonzentration von einem Milligramm Protein pro 250 Mikroliter Puffer A. Verdünnen Sie einen Schlauch, der Inertgas liefert, in den Lösungsteil in der Röhre.Lagern Sie die Lösung bei Bedarf über Nacht bei vier Grad Celsius unter der Inertgasatmosphäre. Um mit der Rekonstitution zu beginnen, in einem sauberen Glasrohr, mischen 100 Mikroliter CO, 13,5 Mikroliter C, und 500 Mikroliter PC. Drehen Sie dann das Glasrohr, während Stickstoffgas in das Rohr gespült wird, um das Gemisch zu trocknen, um eine homogene Oberflächenschicht zu ergeben. In einem 0,5-Milliliter-Reaktionsröhre eine frische 30-Millimolar-Sperminlösung im Puffer A vorbereiten. Mischen Sie dann 100 Mikroliter 10-Mikromolar synthetische microRNA mit 100 Mikroliter Sperminlösung in einem Zwei-Milliliter-Reaktionsröhre.Und für 30 Minuten bei 30 Grad Celsius brüten. Als nächstes übertragen Sie die inkubierte 200-Mikroliter-Lösung in das Glasrohr, um die vorbereitete PC-CO-C-Mastermix-Oberflächenschicht zu rehydrieren. Und dann fügen Sie 50 Mikroliter einer 30 Milligramm pro Milliliter Natriumdeoxycholat-Lösung.Zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius umrühren. Danach 250 Mikroliter der delipidierten HDL-Lösung in das Glasrohr geben. Und bei vier Grad Celsius über Nacht rühren.Um mit der Dialyse zu beginnen, fügen Sie zunächst 50 Gramm adsorbierende Perlen zu 800 Milliliter doppelt destilliertem Wasser hinzu. Und verwenden Sie einen magnetischen Rührer, um für eine Minute zu rühren. Warten Sie 15 Minuten, bis sich die Perlen absetzen, und dekantisieren Sie den Überstand.Wiederholen Sie den Vorgang mit vorgekühltem PBS. Vornassdialysekassetten in PBS. Verwenden Sie eine Spritze, um die zuvor hergestellte Mischung gemäß den Anweisungen des Herstellers in die Kassetten einzutragen.Fügen Sie die PBS-behandelten Adsorbieren zu drei Litern PBS hinzu, und legen Sie die Kassetten in die PBS, um bei vier Grad Celsius zu dialysieren. Die Perlen halten den Dichtegradienten entlang der Dialysemembran konstant. Ändern Sie den Puffer und die Perlen nach einer Stunde und zwei Stunden.Nach 24 Stunden, mit einer Spritze, extrahieren Sie die Lösung aus der Kassette in ein 1,5-Milliliter-Reaktionsrohr, um die rekonstituierte HDL-Partikellösung wiederherzustellen. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay. Versorgen Sie das Reaktionsrohr mit Inertgas, versiegeln Sie es und lagern Sie die rekonstituierte HDL-Partikellösung unter Inertgasatmosphäre bei vier Grad Celsius.Bereiten Sie zunächst eine frische 30-Millimolar-Sperminlösung in RNAse-freiem Wasser vor. Mischen Sie 100 Mikroliter von 10 Mikromolaren synthetischer microRNA mit 100 Mikroliter Naperlösung in einem Zwei-Milliliter-Reaktionsröhre. Und für 30 Minuten bei 30 Grad Celsius brüten.Dann fügen Sie 100 Mikroliter DMSO und 1,2 Milliliter 1X LDL Puffer in die vorbereitete microRNA-Sperminlösung. Verdünnen Sie die zuvor hergestellte LDL-Partikellösung mit PBS auf eine Endkonzentration von etwa vier Milligramm pro Milliliter. Dann 450 Mikroliter der verdünnten Lösung in ein 1,5-Milliliter-Reaktionsrohr ziehen und mit 50 Mikrolitern 10X LDL Puffer mischen.10 Minuten auf Eis bebrüten. Kombinieren Sie nach der Inkubation die 500-Mikroliter-LDL-Partikellösung und die 1,5-Milliliter-Lösung microRNA-spermin-DMSO und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei 40 Grad Celsius. Führen Sie eine Dialyse ähnlich wie zuvor beschrieben durch und lagern Sie die beschriftete LDL-Partikellösung unter Inertgasatmosphäre bei vier Grad Celsius.Verdünnen Sie zunächst die HDL- oder LDL-Partikellösung in PBS zwischen 1:100 und 1:000. Cleave Glimmer durch Drücken klebeband gegen das Glimmersubstrat, und ziehen Sie das Band ab, um die oberen Glimmerschichten zu entfernen. Verwenden Sie eine Pipette, um zwei Mikroliter auf frisch gespaltetem Glimmer zu legen, um für fünf Minuten zu brüten.Lipoproteinpartikel neigen dazu, kontinuierliche Bindungsmembranen auf Oberflächen zu bilden. Daher ist es wichtig, die Partikelkonzentration auf der Glimmeroberfläche anzupassen, um einzelne zu erhalten. Nach der Inkubation die Probe mit PBS abspülen.Füllen Sie die Hochgeschwindigkeits-AFM-Flüssigkeitszelle mit PBS und montieren Sie den Mica-tragenden Scanner auf die Hochgeschwindigkeits-AFM-Stufe. Starten Sie in der Steuerungssoftware den Annäherungsprozess des Auslegers an die Glimmeroberfläche. Verwenden Sie Scangrößen von weniger als einem Quadratmikrometer, und halten Sie die Bildkräfte so gering wie möglich.Bildn das Beispiel im Tippmodus. Laden Sie die Daten in die Gwyddion, und erkennen Sie die Partikel über die Markierungskörner nach Schwellenfunktion. Passen Sie den Höhenschwellenwert an, um die einzelnen Partikel zu maskieren.In der Regel ist ein Niveau um 50% ein guter Ausgangspunkt. Entfernen Sie den Polynomhintergrund, um das Bild abzuflachen, und aktivieren Sie die Option maskierte randalierte Bereiche ausschließen. Exportieren Sie die maximalen Höhenwerte der erfassten Partikel mithilfe der Verteilung der verschiedenen Korneigenschaften- und -schritte für alle aufgezeichneten Bilder.In diesem Experiment wurde die Rekonstitution von HDL-Partikeln durch Delipidation von HDL-Partikeln durchgeführt, gefolgt von Relipidation und Dialyse. Eine Ausbeute von 50% der rekonstituierten HDL-Partikel kann erreicht werden. Die gleiche Kennzeichnung mit microRNA war jedoch aufgrund der Hydrophobie des Apolipoproteins B100 Proteins für die Kennzeichnung von LDL-Partikeln nicht möglich.So wurde DMSO für das Eindringen der Lipidmonoschicht der LDL-Partikel verwendet, mit einer Ausbeute von fast 100%Während der Qualitätskontrolle ist die Verdünnung für die Analyse entscheidend. Das obere Bild zeigt eine zu hohe Partikeldichte. Das untere Bild eignet sich zur Analyse.Wahrscheinlichkeitsdichtefunktionen von Partikelhöhen wurden für den Vergleich der Größenverteilungen der nativen, markierten und markierten Kontrolllipoproteinpartikel berechnet. Die relative Änderung vor und nach der Etikettierung ist vernachlässigbar. Beim Umgang mit RNA-Oligonukleotiden arbeiten RNAse-frei.Verwenden Sie frische Einweg-Kunststoff-Verbrauchsmaterialien und tragen Sie immer Handschuhe. Verwenden Sie nur nukleasefreie Lösungen. High-Speed-AFM ist nur eine Methode, um die allgemeine Form von Lipoproteinen zu bestimmen.Eine alternative Methode wäre die Elektronenmikroskopie. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, und arbeiten Sie in einer Dunstabzugshaube beim Umgang mit Demethylether.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

Eine effiziente Methode zur Synthese von Peptoide mit gemischten Lysine-Typ / Arginin-Monomeren und die Bewertung der Anti-Leishmania-Aktivität

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

Forschung

Biochemie

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Synthese von 1,2-Azaborines und die Vorbereitung ihrer Proteinkomplexe mit T4-Lysozym Mutants

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestimmung des Glykogengehalts in Cyanobakterien

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Hochsensible und quantitativen Nachweis von Proteinen und deren Isoformen durch Kapillare isoelektrischen Fokussierung Methode

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Bildung von kovalenten DNA Addukte durch enzymatisch aktivierten Karzinogene und Drogen In Vitro und ihre Entschlossenheit von 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteomic Analyse der kontextspezifischen Proteinkomplexe in ihrer natürlichen zellulären Umgebung

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Photometrische Bestimmung des Cyanobakteriums Synechocystis Phycobiliprotein Inhalt

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und deren Einsatz in Energie-abhängige Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Hybrid Clear/Blaue Elektrophorese für die Trennung und Analyse von Mitochondrialen Respiratory Chain Supercomplexen

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolierung von Lipoproteinpartikeln aus Hühnereigelb zur Untersuchung des bakteriellen Pathogens Fettsäure-Inkorporation in Membranphospholipide

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...