Name: enrichment of native lipoprotein particles with microrna and subsequent determination of their absolute/relative microrna content and their cellular transfer rate
Uploaded: 2019-05-09T15:00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer

עבודה זו נתמכת על ידי פרויקט קרן המדע האוסטרי P29110-B21, "פרויקט H-3065/2011, הקרן האירופית לפיתוח האזור (EFRE, IWB2020), המדינה הפדרלית של החלק העליון של הבנק הלאומי" אוסטריה, והאדמה. "

<ol>
	<li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins.">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 423-435 (2011).</li><li>Tabet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-transferred+microRNA-223+regulates+ICAM-1+expression+in+endothelial+cells.">HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Wahid, F., Shehzad, A., Khan, T., Kim, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Synthesis,+mechanism,+function,+and+recent+clinical+trials.">MicroRNAs: Synthesis, mechanism, function, and recent clinical trials.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1803 (11), 1231-1243 (2010).</li><li>Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+Mechanisms+of+miRNAs+and+siRNAs.">Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs.</a> Cell. 136 (4), 642-655 (2009).</li><li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+Translation+and+Stability+by+microRNAs.">Regulation of mRNA Translation and Stability by microRNAs.</a> Annual Review of Biochemistry. 79 (1), 351-379 (2010).</li><li>Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+post-transcriptional+regulation+by+microRNAs:+Are+the+answers+in+sight?.">Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: Are the answers in sight?.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).</li><li>Jonas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+High-Density+Lipoproteins.">Reconstitution of High-Density Lipoproteins.</a> Methods in Enzymology. , 553-582 (1986).</li><li>Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+AFM+and+Applications+to+Biomolecular+Systems.">High-Speed AFM and Applications to Biomolecular Systems.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 393-414 (2013).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments.">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Patsch, J. R., Patsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonal+ultracentrifugation.">Zonal ultracentrifugation.</a> Methods in Enzymology. 129 (1966), 3-26 (1986).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Yamamoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Techniques+for+Observing+Dynamic+Biomolecular+Processes.">High-Speed Atomic Force Microscopy Techniques for Observing Dynamic Biomolecular Processes.</a> Methods in Enzymology. 475, 541-564 (2010).</li><li>Stangl, H., Cao, G., Wyne, K. L., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+receptor,+class+B,+type+I-dependent+stimulation+of+cholesterol+esterification+by+high+density+lipoproteins,+low+density+lipoproteins,+and+nonlipoprotein+cholesterol.">Scavenger receptor, class B, type I-dependent stimulation of cholesterol esterification by high density lipoproteins, low density lipoproteins, and nonlipoprotein cholesterol.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (47), 31002-31008 (1998).</li><li>Hochberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+a+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: a Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. 57 (1), 289-300 (1995).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization.">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biology. 10 (6), (2009).</li><li>Schumaker, V. N., Puppione, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=6]+Sequential+Flotation+Ultracentrifugation.">6] Sequential Flotation Ultracentrifugation.</a> Methods in Enzymology. 128 (C), 155-170 (1986).</li><li>Wagner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+levels+and+cellular+transfer+of+circulating+lipoprotein-bound+microRNAs.">Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1392-1400 (2013).</li><li>Meier, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+chronic+kidney+disease+on+macrophage+cholesterol+efflux.">Effect of chronic kidney disease on macrophage cholesterol efflux.</a> Life Sciences. 136, 1-6 (2015).</li><li>Axmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+and+Lipoprotein+Particle+miRNA+Profile+in+Uremia+Patients.">Serum and Lipoprotein Particle miRNA Profile in Uremia Patients.</a> Genes. 9 (11), 533 (2018).</li></ol>

. למחברים אין מה לגלות

כאן, הבידוד של ליפופרוטאין שברים חלקיק מהדם האנושי וקביעת תוכן miRNA הפרט שלהם מתואר צעד אחר צעד. זה קריטי לעבוד בסביבה RNase-free תוך טיפול מבודדים מסונתז miRNA-חלקיק מוטבע miRNA מוגן ללא ספק מהשפלה אנזימטית. כמו היחס של mirna/חלקיק של חלקיקים יליד ליפופרוטאין הוא נמוך למדי, העשרה מלאכותית עם mirna נדרש כדי ללמוד את קליטת חלקיקים הולוגרפי של תאים. ובכך, את החוקה של חלקיקי ה-HDL כפי שמתואר בעבר7 הוא שונה כדי לשלב קווצות mirna. בנוסף, את ההפרדה של שבר השומנים והחלבון במהלך הליך זה מאפשר למדענים לבחון את השומנים-ואת החומרים הקשורים חלבון של ליפופרוטאין חלקיק19. באופן דומה, את ההליך תיוג של חלקיקי LDL מותאם. מעניין, תוספת של הספרמינה-מייצב טבעי של נוקלאוטידים-לא השפיעו על יחס miRNA/חלקיקים. יצוין כי, בעיקרון, השיטה מאפשרת את חוסר קיפול של חומרים אחרים מאשר miRNA בתוך חלקיק ליפופרוטאין. כמובן, יש גבול ביחס לגודל הפיזי של החומר המבוסס על הגודל הכולל של ה-HDL (קוטר: 5-12 ננומטר) ו-LDL חלקיקים (קוטר: 18-25 nm).
בנוגע לבקרת איכות של חלקיקי ליפופרוטאין, HS-AFM היא שיטה ישימה לאפיון חלקיקי HDL/LDL ברמת החלקיק הבודד. בהשוואה ל-EM, היא מאפשרת זמני הכנה קצרים יותר ותנאים כמעט פיזיולוגיים (רטוב, טמפרטורת החדר).
בשל הרגישות הפנימית שלה הגברה, qPCR היא שיטת הבחירה כדי לזהות ריכוזי miRNA נמוכה. לחילופין, מיקרוסקופ חד-מולקולה רגיש מיקרוסקופית הזריחה, אשר מסוגל לזהות אפילו מולקולות בודדות, לא יהיה מתאים בשל ריכוזים נמוכים של, למשל, מסומן ברצועות מירונה לכל חלקיק. כך, את היחס של קווצות miRNA לכל ליפופרוטאין החלקיקים נמצא 10-8. העשרה מלאכותית מגבירה את היחס על ידי גורם של 10,000, אשר מקלה על הערכה של שיעור ספיגת ליפופרוטאין הסלולר (אין הבדל משמעותי מזוהה באמצעות חלקיקים ליפופרוטאין טבעי 19). רגישות גבוהה של qPCR מאפשר לקבוע את קצב ספיגת זה על ידי מדידת מספר קווצות miRNA לאחר הזמן הדגירה ואת יחס miRNA/חלקיק. יצוין כי הערך המחושב מתעלם השפלה סלולרית ושחרורו של miRNA, ולכן, מייצג לפחות מגבלה נמוכה יותר עבור היחס ספיגת חלקיקים ליפופרוטאין.
בעתיד, השיטה יכולה להיות מותאמת להעברת חומרים התרופות (בעיקר גם ליפופילית) בתאים ולהתאים את ההשפעה הביולוגית שלהם לריכוז תאיים (נקבע באמצעות שיעור ספיגת חלקיקים ליפופרוטאין).

חלקיקי ליפופרוטאין מורכבים ממונאולייר של שומנים וכולסטרול אמפיפילי מתוחם ליבה של cholesteryl אסטרים ושומנים טריגליצרידים. החלקיק כולו מיוצב על ידי ממברנה מוטבע, המגדיר את הפונקציונליות הביולוגית של החלקיקים. ליפופרוטאין חלקיקים יכול להיות מכובד על פי הצפיפות ההולכת וגוברת שלהם, ולכן, גודל יורדת, כלומר כמו ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד (VLDL), ליפופרוטאין בצפיפות בינונית (IDL), LDL, ו-HDL. למרות התחבורה של מרכיבים מבוססי מים במחזור הדם, זה הוכיח כי חלקיקי HDL לשאת קווצות שאינן קידוד של mirna1,2. מיקרו rnas הם מחלקה של קצר (בדרך כלל שני תריסרים של נוקלאוטידים) גדילי רנ א, אשר לבזות intracellularly משלימים סיבי mrna, ובכך, לשנות את פרופיל הביטוי של חלבונים מסוימים3,4,5, . שישה מטרים יתר על כן, שינויים של פרופיל miRNA נמצאו במגוון של מחלות, ולכן, הפרופיל הוא ישים כסמנים ביונקר לאבחון ופרוגנוזה. התחבורה החילוץ של miRNAs בין תאים באמצעות ליפופרוטאין חלקיקים עשוי לשמש מנגנון נוסף עבור אפנון רמת mRNA ברמה הבין-תאית. כדי לאמוד את ההשפעה הביולוגית, הידע לגבי התוכן המוחלט והיחסי של מירופרוטאין הינו צורך.
PCR כמותי בזמן אמת היא שיטה מתאימה ומהירה יחסית להשגת מידע זה. לפיכך, ערך הקוונפיקציה היחסי (RQ) ניתן לחישוב, והבדלים יחסיים בין דגימות שונות ליפופרוטאין שברים מעריכים. כרטיסי מערך מיקרופלואידיג multiflu, הם שיטה מהירה וקלה לשימוש כדי לקבוע את הנוכחות היחסית (משווה לערך ה-RQ) של miRNAs במדגם. כרטיסי מערך multifluאידיג מורכבים של 96 או 384 חדרי התגובה הבודדים של התגובות qPCR בודדים מוטבע במכשיר microfluidic. כל תא מכיל את המחקר ההידרוליזה הנדרש ומדויק qPCR התחל עבור מירנה יחיד. היתרונות הם זמן הטיפול הקצר עקב סטנדרטיזציה, זרימת עבודה פשוטה, ומספר מופחת של שלבי פיליטוף. יתר על כן, נפח המדגם הנדרש הוא ממוזער. בניגוד לקוונפיקציה יחסית, התוכן miRNA המוחלט דורש השוואה של תוצאות לדוגמה qPCR עם עקומות סטנדרטיות של מספרים מוחלטים הידוע של קווצות miRNA. יש לציין כי, בשל התוכן הנמוך יחסית miRNA שלהם, סטנדרטי, יתר על כן, אפילו מולקולה אחת ושיטות הדמיה רגיש לא ריאלי – העשרה מלאכותית של חלקיקים ליפופרוטאין עם miRNA הוא בלתי נמנע ללמוד סלולרי ליפופרוטאין אינטראקציה חלקיקים ו miRNA העברה. לגבי זה, מדליזציה של חלקיק ה-HDL ואחריו עם משוב הבאים7 מאפשר התאגדות של, ובכך, העשרה עם קווצות mirna. העשרה דומים של חלקיקי LDL עם miRNA לא ניתן בשל הידרופוטביניטי של חלבון apoB-100, שהוא המרכיבים העיקריים של החלקיקים LDL. עם זאת, על ידי תוספת של הממס diמתיל סולפוקסיד (DMSO), אשר מסוגל לחדור ממברנות השומנים, חלקיקי LDL ניתן לטעון באופן מלאכותי עם קווצות miRNA גם.
מיקרוסקופ כוח אטומי במהירות גבוהה (HS-AFM) הוא כלי רב עוצמה לאפיון של דגימות ביולוגיות המציעות מרחבית תת-שנייה וברזולוציה של הזמן השני8. מכאן, היא טכניקה מתאים היטב עבור בקרת איכות של חלקיקים שונה ליפופרוטאין כמו יליד/reconstituted/התווית חלקיקים ליפופרוטאין ניתן לדימות תחת סביבה כמעט פיסיולוגיים.
כאן, פרוטוקול qPCR מוצג צעד אחר צעד כדי לקבוע את התוכן המוחלט/יחסי miRNA של ליפופרוטאין חלקיקים ודגימות תאים, אשר מאפשר הערכה של שיעור ספיגת חלקיקים ליפופרוטאין הסלולר. יתר על כן, שיטה להעשרה של חלקיקים ליפופרוטאין עם miRNA מומחש. שיטה זו עשויה להיות מותאמת עבור מניפולציה כללית של תוכן ליפופרוטאין, ומכאן, מדגים את תחולתן של חלקיקים ליפופרוטאין כמטרות לאספקת סמים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>TI 55.2</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer (EDTA)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366643</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaliumbromid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2110</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342414</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube sealer</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342428</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P029.2</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D/0650/50</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubes, MWCO 12 - 14k</td>
			<td>Spectra</td>
			<td>132700</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synthetic miRNA</td>
			<td>microSynth</td>
			<td>-</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 7</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 8</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile tubes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>ENE8.1</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf Biophotometer</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>XK20</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G-250 Stain</td>
			<td>BioRad GmbH</td>
			<td>161-0786</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3957.1</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>AustrAlco</td>
			<td>Ethanol Absolut 99.9%</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3942.1</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Multifuge X3R</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3313.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4627.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>P3556-25mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol oleate</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>C-9253-250mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>C8667-500mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass tubes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>K226.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spermine</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>S3256-1G</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>3097-25G</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>0955.2</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#181;L micropipettes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>A762.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9143.2</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amberlite XAD-2 beads</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>10357</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer casette (cut-off 20 kDa)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66003</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>465 76 83</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3054.2</td>
			<td>Labeling of LDL particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Labeling of LDL particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope</td>
			<td>RIBM</td>
			<td>SS-NEX</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscovite Mica (V-1 Grade)</td>
			<td>Christine Gr&#246;pl</td>
			<td>G250-1/V1</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Cantilever</td>
			<td>Nanoworld</td>
			<td>USC-F1.2-k0.15</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gwyddion 2.49</td>
			<td>Czech Metrology Institute</td>
			<td>http://gwyddion.net</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slides, Nunc Lab-Tek</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9117.1</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Omni Life Science GmbH</td>
			<td>Casy</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>217004</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Sterican 465 75 19</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309050</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cabinet</td>
			<td>Esco</td>
			<td>PCR-3A1</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4366596</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free water</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T143</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 ml tubes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781305</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>Microcentrifuge AL</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Sensoquest</td>
			<td>Labcycler</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Primer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal probe supermix</td>
			<td>BioRad GmbH</td>
			<td>1725131</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Corbett</td>
			<td>Rotor-Gene RG-6000</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366596</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4399966</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4391128</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4399933</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal Master Mix II, no UNG</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4440040</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA Human A Cards</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A31805</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0581</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (25mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0971</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9849</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7900HT Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4351405</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Array Card Sealer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>-</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native lipoprotein particles with microrna and subsequent determination of their absolute/relative microrna content and their cellular transfer rate

חלקיקי ליפופרוטאין הם מובילים ברובם של שומנים וכולסטרול במחזור הדם. יתר על כן, הם מכילים כמויות קטנות של קווצות שאינן מצפינה מיקרוקוד (miRNA). באופן כללי, miRNA משנה את פרופיל ביטוי החלבון עקב אינטראקציות עם messenger-RNA (mRNA). כך, הידע של התוכן הקרוב והמוחלט miRNA של חלקיקים ליפופרוטאין הוא חיוני כדי להעריך את ההשפעה הביולוגית של ספיגת חלקיקים סלולריים. כאן, תגובת שרשרת פולימראז כמותיים בזמן אמת (qPCR) הפרוטוקול מוצג כדי לקבוע את התוכן המוחלט miRNA של ליפופרוטאין חלקיקים — לדוגמה הראו מקורי ו-miRNA-מועשר ליפופרוטאין חלקיקים. התוכן היחסי של miRNA מכמת באמצעות כרטיסי מערך מיקרופלואידיג multiflu, יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר למדענים להעריך את miRNA הסלולר, ולכן, ליפופרוטאין שיעור ספיגת חלקיקים. גידול משמעותי של רמת miRNA הסלולר הוא הנצפה בעת שימוש ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) חלקיקים טעון באופן מלאכותי עם miRNA, בעוד דגירה עם חלקיקי HDL מקורי התשואות אין השפעה משמעותית בשל התוכן הנמוך שלהם miRNA נמוכה. לעומת זאת, הקליטה התאית של חלקיקי ה-LDL בעלי צפיפות נמוכה, לא משנה את רמת miRNA הסלולרית.

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer 

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

כאן, פרוטוקול כמותי בזמן אמת מבוסס על תגובת שרשרת פולימראז מוצגת לצורך קביעת התוכן המקורי מיקרו-RNA (מוחלט/יחסי) של חלקיקים ליפופרוטאין. בנוסף, שיטה להגברת רמת מיקרו RNA, כמו גם שיטה לקביעת שיעור ספיגת הסלולר של חלקיקים ליפופרוטאין, מומחש.

העשרה של ליפופרוטאין חלקיקים מקומיים עם מיקרואורנה והקביעה הבאה של התוכן המוחלט שלהם/מיקרוליאורנה וקצב העברת הסלולר שלהם

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

חלקיקי ליפופרוטאין הם כלי תחבורה מקומיים. העשרת חומרים זרים מקלה על השימוש בהם כנשאי מסלול. תיוג ספציפי של מולקולות או חלקיקים שלמים מאפשר למדוד את ספיגת התאים.שתי שיטות העשרה הן מהירות וקלות לשימוש, ו ניתן להתאים אותן למגוון רחב של חומרים. הדגימה של ההליך תהיה מרקוס אקסמן ואנדראס קרנר, שני פוסט-דוקים מהמעבדה שלי. כדי להתחיל delipidation ברדס אדים, לערבב אחד עד שני מיליליטר של פתרון HDL מוכן המכיל חמישה מיליגרם של חלקיקי HDL עם 50 מיליליטר של תערובת מקורר מראש של שלושה עד שניים של אתנול diethyl אתר בצינור צנטריפוגה חרוטי.דגירה במשך שעתיים ב 20 מעלות צלזיוס שליליות. צנטריפוגה ב 2500 פעמים g במשך 10 דקות ב שלילי 10 מעלות צלזיוס. השליכו את העל-טבעי, השליכו מחדש את גלולת הכדור ב-50 מיליליטר של תערובת אתנול דיאתיל אתר מקוררת מראש, ומערבולת לזמן קצר.דגירה בפעם השנייה במשך שעתיים ב 20 מעלות צלזיוס שליליות. צנטריפוגה שוב ב 2500 פעמים g במשך 10 דקות ב שלילי 10 מעלות צלזיוס. ואז להכניס צינורות המספקים זרימת גז חנקן לייבש את גלולה.ולהשתמש בו מחדש ב 250 microliters של חיץ A.לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות בדיקה חלבון ברדפורד או אחר מתאים. זה קריטי כדי להסיר את כל שרידים של תערובת האתר diethyl אתנול, כמו ממיסים אלה יעכבו את ההשתנות של אפוליפופרוטאינים. לאחר מכן, לדלל לריכוז סופי של מיליגרם אחד של חלבון לכל 250 microliters של חיץ A.Insert צינור אספקת גז אינרטי לחלק הפתרון בצינור.במידת הצורך, יש לאחסן את הפתרון למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירת הגז האנרטי. כדי להתחיל בהשבתה, בצינור זכוכית נקי, יש לערבב 100 מיקרוליטרים של CO, 13.5 מיקרוליטרים של C ו-500 מיקרוליטרים של מחשב. לאחר מכן לסובב את צינור הזכוכית תוך שטיפת גז חנקן בתוך הצינור כדי לייבש את התערובת על מנת להניב שכבת משטח הומוגנית. בצינור תגובה 0.5 מיליליטר, להכין פתרון זרע טרי 30 מילימולר במאגר A.Then לערבב 100 microliters של microRNA סינתטי 10 מיקרומולר עם 100 microliters של תותב זרע בצינור תגובה שני מיליליטר.ודגירה במשך 30 דקות ב30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להעביר את פתרון 200 מיקרוליטר דגירה לתוך צינור הזכוכית כדי rehydrate שכבת משטח PC-CO-C המוכן Mastermix. ולאחר מכן להוסיף 50 microliters של 30 מיליגרם לכל תווית נתרן deoxycholate מיליליטר.מערבבים בארבע מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לאחר מכן, להוסיף 250 microliters של פתרון HDL מתלבט לתוך צינור הזכוכית. ומערבבים בארבע מעלות צלזיוס בן לילה.כדי להתחיל בדיאליזה, תחילה להוסיף 50 גרם של חרוזים ספוגים ל 800 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים. ולהשתמש בערבב מגנטי כדי לבחוש במשך דקה אחת. המתן 15 דקות עד שהחורוזים יתיישבו, ויתקעו את העל-טבעי.חזור על ההליך עם PBS מקורר מראש. קלטות דיאליזה טרום רטובות ב- PBS. השתמש במזרק כדי להוסיף את התערובת שהוכנה בעבר לתוך הקלטות בהתאם להוראות היצרן.הוסיפו את גם פרעזי ה-PBS המטופלים ב-PBS לשלושה ליטרים של PBS, והצבו את הקלטות ב-PBS כדי להנייד בארבע מעלות צלזיוס. חרוזים לשמור על שיפוע הצפיפות לאורך קרום הדיאליזה קבוע. שנה את המאגר ואת חרוזים לאחר שעה ושעה.לאחר 24 שעות, עם מזרק, לחלץ את הפתרון מן הקלטת לתוך צינור תגובה 1.5 מיליליטר כדי לשחזר את פתרון חלקיקי HDL מחדש. לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות ההתזה ברדפורד. לספק גז אינרטי לצינור התגובה, לאטום אותו, ולאחסן את פתרון חלקיקי HDL מחדש תחת אטמוספרת גז אינרטי בארבע מעלות צלזיוס.ראשית, להכין פתרון זרע טרי 30 מילימולר במים ללא RNAse. מערבבים 100 מיקרוליטרים של 10 מיקרומולרים של מיקרו-רנ"א סינתטי עם 100 מיקרוליטרים של תותב זרע בצינור תגובה של שני מיליליטר. ודגירה במשך 30 דקות ב30 מעלות צלזיוס.לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של DMSO ו-1.2 מיליליטר של מאגר LDL 1X לתתסרון הזרע המיקרו-רנ"א המוכן. לדלל פתרון חלקיקי LDL שהוכן בעבר עם PBS לריכוז סופי של כארבעה מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן צייר 450 מיקרוליטרים של הפתרון המדולל לצינור תגובה של 1.5 מיליליטר, וערבב עם 50 מיקרוליטרים של מאגר LDL 10X.דגירה זה במשך 10 דקות על קרח. לאחר הדגירה, שלבו את תסנובת החלקיק LDL 500 מיקרוליטר ואת פתרון המיקרו-רנ"א-זרע-DMSO 1.5 מיליליטר, והדגירה במשך שעתיים ב-40 מעלות צלזיוס. בצע דיאליזה דומה כפי שתואר קודם לכן, ולאחסן את פתרון החלקיק LDL שכותרתו תחת אווירת גז אינרטי בארבע מעלות צלזיוס.כדי להתחיל, לדלל את פתרון חלקיקי HDL או LDL ב- PBS בין אחד ל-100 ואחד ל-1, 000. קליב נציץ על ידי לחיצה על סרט דבק נגד מצע נציץ, ומושך את הקלטת כדי להסיר את שכבות mica העליון. השתמש פיפטה להפקיד שני microliters על נציץ מחשוף טרי כדי דגירה במשך חמש דקות.חלקיקי ליפופרוטאין נוטים ליצור קרום קשר מתמשך על משטחים. כתוצאה מכך, חשוב להתאים את ריכוז החלקיק על משטח נציץ כדי לקבל אלה בודדים. לאחר הדגירה, לשטוף את המדגם עם PBS.מלאו את התא הנוזלי המהיר AFM ב-PBS והרמו את הסורק נושא הנציה לשלב ה-AFM המהיר. בתוכנת הבקרה, התחל את תהליך הגישה של ה- cantilever למשטח הנציץ. השתמש בגדלי סריקה של פחות ממיקרומטר מרובע אחד, ושמור על כוחות ההדמיה נמוכים ככל האפשר.תדמיין את הדוגמה במצב הקשה. לטעון את הנתונים לתוך Gwyddion, ולזהות את החלקיקים באמצעות גרגרי סימן על ידי פונקציית סף. התאימו את ערך סף הגובה כדי להסוות את החלקיקים הבודדים.בדרך כלל, רמה סביב 50% היא נקודת התחלה טובה. הסירו רקע פולינומיאלי כדי לשטח את התמונה, והפעילו את האפשרות 'אל תכלול אזור מסיכה'. יצא את ערכי הגובה המרביים של החלקיקים שזוהו באמצעות התפלגות של פונקציית מאפייני תבואה שונים, וחזור על שלבים אלה עבור כל התמונות המוקלטות.בניסוי זה, שחזור של חלקיקי HDL בוצע באמצעות delipidation של חלקיקי HDL, ואחריו relipidation ו דיאליזה. ניתן להשיג תשואה של 50% מחלקיקי HDL משוחזרים. עם זאת, אותו תיוג עם microRNA לא היה ריאלי עבור תיוג של חלקיקי LDL, בשל הידרופוביות של חלבון אפוליפופרוטאין B100.לכן, DMSO שימש לחדירה של monolayer השומנים של חלקיקי LDL, עם תשואה קרובה ל 100% במהלך בקרת איכות, הדילול הוא קריטי לניתוח. התמונה העליונה מציגה צפיפות חלקיקים גבוהה מדי. התמונה התחתונה מתאימה לניתוח.פונקציות צפיפות ההסתברות של גבהים חלקיקים חושבו להשוואה של התפלגות גודל של חלקיקי ליפופרוטאין מקוריים, מסומנים ומתויגים כבקרה. השינוי היחסי לפני ואחרי הליך התיוג ניתן להזנחה. בעת טיפול אוליגונוקלאוטידים RNA, לעבוד ללא RNAse.השתמש מתכלים פלסטיק חד פעמי טרי, תמיד ללבוש כפפות. השתמש רק בפתרונות נטולי גרעין. AFM במהירות גבוהה היא רק שיטה אחת כדי לקבוע את הצורה הכללית של ליפופרוטאינים.שיטה חלופית תהיה מיקרוסקופ אלקטרונים. ללבוש ציוד הגנה אישי מתאים, ולעבוד ברדס אדים תוך טיפול אתר diethyl.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

שיטה יעילה עבור הסינתזה של Peptoids עם מעורב ליזין מסוג / ארגינין-סוג מונומרים וערכה של אנטי-leishmanial פעילותם

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

סינתזה של 1,2-Azaborines ואת ההכנה של קומפלקסי החלבונים שלהם עם מוטאנטים ליזוזים T4

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

קביעת תוכן הגליקוגן בקיאנובקטריה

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

זיהוי רגיש מאוד, כמותית של חלבונים ושל שלהם איזופורמים בשיטה התמקדות לגירויי כאב נימי

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

היווצרות קשרי ערכיות דנ א Adducts על ידי חומרים מסרטנים Enzymatically מופעל, סמים במבחנה ונחישות שלהם על ידי 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

פיצול-BioID — ניתוח פרוטיאומיה מבנית של חלבון ספציפי ההקשר מתחמי הסלולר בסביבתם הטבעית

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

קביעת spectrophotometric תוכן Phycobiliprotein Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

בידוד של פעיל מבחינה פיזיולוגית Thylakoids, השימוש בהם במסגרת מבחני תחבורה אנרגיה תלוית חלבון

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

אלקטרופורזה היברידית ברורה/כחולה עבור הפרדה וניתוח של שרשרת נשימה מיטוכונדריאלי מערכות-העל

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

בידוד של חלקיקי ליפופרוטאין מעוף חלמון ביצה לחקר הפתוגן חומצות שומן בקטריאלי התאגדות לתוך ממברנה פוספוליפידים

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...