Name: enrichment of native lipoprotein particles with microrna and subsequent determination of their absolute/relative microrna content and their cellular transfer rate
Uploaded: 2019-05-09T15:00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer

Quest'opera è stata sostenuta dal progetto del Fondo scientifico austriaco P29110-B21, dal progetto "Hochschuljubiläumsstiftung der Stadt Wien zur Förderung der Wissenschaft" H-3065/2011, dal Fondo europeo per lo sviluppo regionale (EFRE, IWB2020), dallo stato federale di alta Austria, e la "terra OÖ Basisfinanzierung".

<ol>
	<li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins.">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 423-435 (2011).</li><li>Tabet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-transferred+microRNA-223+regulates+ICAM-1+expression+in+endothelial+cells.">HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Wahid, F., Shehzad, A., Khan, T., Kim, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Synthesis,+mechanism,+function,+and+recent+clinical+trials.">MicroRNAs: Synthesis, mechanism, function, and recent clinical trials.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1803 (11), 1231-1243 (2010).</li><li>Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+Mechanisms+of+miRNAs+and+siRNAs.">Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs.</a> Cell. 136 (4), 642-655 (2009).</li><li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+Translation+and+Stability+by+microRNAs.">Regulation of mRNA Translation and Stability by microRNAs.</a> Annual Review of Biochemistry. 79 (1), 351-379 (2010).</li><li>Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+post-transcriptional+regulation+by+microRNAs:+Are+the+answers+in+sight?.">Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: Are the answers in sight?.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).</li><li>Jonas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+High-Density+Lipoproteins.">Reconstitution of High-Density Lipoproteins.</a> Methods in Enzymology. , 553-582 (1986).</li><li>Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+AFM+and+Applications+to+Biomolecular+Systems.">High-Speed AFM and Applications to Biomolecular Systems.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 393-414 (2013).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments.">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Patsch, J. R., Patsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonal+ultracentrifugation.">Zonal ultracentrifugation.</a> Methods in Enzymology. 129 (1966), 3-26 (1986).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Yamamoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Techniques+for+Observing+Dynamic+Biomolecular+Processes.">High-Speed Atomic Force Microscopy Techniques for Observing Dynamic Biomolecular Processes.</a> Methods in Enzymology. 475, 541-564 (2010).</li><li>Stangl, H., Cao, G., Wyne, K. L., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+receptor,+class+B,+type+I-dependent+stimulation+of+cholesterol+esterification+by+high+density+lipoproteins,+low+density+lipoproteins,+and+nonlipoprotein+cholesterol.">Scavenger receptor, class B, type I-dependent stimulation of cholesterol esterification by high density lipoproteins, low density lipoproteins, and nonlipoprotein cholesterol.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (47), 31002-31008 (1998).</li><li>Hochberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+a+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: a Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. 57 (1), 289-300 (1995).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization.">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biology. 10 (6), (2009).</li><li>Schumaker, V. N., Puppione, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=6]+Sequential+Flotation+Ultracentrifugation.">6] Sequential Flotation Ultracentrifugation.</a> Methods in Enzymology. 128 (C), 155-170 (1986).</li><li>Wagner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+levels+and+cellular+transfer+of+circulating+lipoprotein-bound+microRNAs.">Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1392-1400 (2013).</li><li>Meier, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+chronic+kidney+disease+on+macrophage+cholesterol+efflux.">Effect of chronic kidney disease on macrophage cholesterol efflux.</a> Life Sciences. 136, 1-6 (2015).</li><li>Axmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+and+Lipoprotein+Particle+miRNA+Profile+in+Uremia+Patients.">Serum and Lipoprotein Particle miRNA Profile in Uremia Patients.</a> Genes. 9 (11), 533 (2018).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, l'isolamento delle frazioni di particelle di lipoproteina dal sangue umano e la determinazione del loro contenuto di miRNA individuale è descritta passo-passo. È fondamentale lavorare in un ambiente privo di RNAsi durante la manipolazione di miRNA isolati e sintetizzati — il miRNA incorporato in particelle è ovviamente riparato dalla degradazione enzimatica. Poiché il rapporto miRNA/particelle delle particelle di lipoproteina nativa è piuttosto basso, è necessario un arricchimento artificiale con miRNA per studiare l'assorbimento delle particelle di Holo nelle cellule. In tal modo, la ricostituzione delle particelle HDL come descritto in precedenza7 viene modificata per incorporare i filamenti di Mirna. Inoltre, la separazione della frazione lipidica e proteica durante questa procedura consente agli scienziati di esaminare i componenti associati ai lipidi e alle proteine della particella di lipoproteina19. Analogamente, la procedura di etichettatura delle particelle LDL è adattata. È interessante notare che l'aggiunta di Spermine — uno stabilizzatore naturale di nucleotidi — non ha influenzato il rapporto miRNA/particella. Va notato che, in linea di principio, il metodo consente l'inpiegatura di altre sostanze di miRNA all'interno di una particella di lipoproteina. Naturalmente, c'è un limite per quanto riguarda le dimensioni fisiche della sostanza in base alla dimensione complessiva di HDL (diametro: 5-12 Nm) e particelle LDL (diametro: 18-25 Nm).
Per quanto riguarda il controllo di qualità delle particelle lipoproteiche ricostituite/etichettate, HS-AFM è un metodo applicabile per caratterizzare le particelle HDL/LDL a livello di singola particella. Rispetto all'EM, consente tempi di preparazione più brevi e condizioni quasi fisiologiche (bagnato, temperatura ambiente).
Grazie alla sua intrinseca sensibilità e amplificazione, qPCR è il metodo di scelta per rilevare basse concentrazioni di miRNA. In alternativa, la microscopia a fluorescenza sensibile a singola molecola, che è in grado di rilevare anche singole molecole, non sarebbe adatta a causa delle basse concentrazioni, ad esempio, di filamenti di miRNA con etichetta fluorescente per particella. Così, il rapporto dei filamenti di miRNA per particella di lipoproteina nativa è stato trovato per essere 10-8. L'arricchimento artificiale aumenta il rapporto di un fattore di 10.000, che facilita la stima del tasso di assorbimento della lipoproteina cellulare (non viene rilevata alcuna differenza significativa utilizzando le particelle di lipoproteina nativa 19). L'elevata sensibilità della qPCR consente di determinare questo tasso di assorbimento misurando il numero di filamenti di miRNA dopo il tempo di incubazione e il rapporto miRNA/particella. Va notato che il valore calcolato ignora la degradazione cellulare e il rilascio di miRNA e, pertanto, rappresenta almeno un limite inferiore per il rapporto di assorbimento delle particelle di lipoproteina.
In futuro, il metodo può essere adattato per trasferire le sostanze farmaceutiche (in particolare anche quelle lipofiliche) nelle cellule e correlare il loro effetto biologico alla concentrazione intracellulare (determinata attraverso il tasso di assorbimento delle particelle di lipoproteina).

Le particelle di lipoproteina sono composte da un monostrato di lipidi e colesterolo amphiphilici che racchiude un nucleo di esteri di colesteryl e grassi del trigliceride. L'intera particella è stabilizzata da apolipoproteine incorporate nella membrana, che definiscono la funzionalità biologica della particella. Le particelle di lipoproteina possono essere distinte in base alla loro rispettiva densità crescente e, quindi, diminuire le dimensioni, vale a dire come lipoproteina a bassissima densità (VLDL), lipoproteina a densità intermedia (IDL), LDL e particelle di HDL. Nonostante il trasporto di componenti insolubili in acqua nel sangue, è stato dimostrato che le particelle di HDL trasportano filamenti non codificanti di Mirna1,2. I micro-RNA sono una classe di brevi filamenti (di solito due dozzine di nucleotidi), che degradano i filamenti di mRNA intracellularmente complementari e, quindi, modificano il profilo di espressione di certe proteine3,4,5, 6. il Inoltre, le alterazioni del profilo di miRNA sono state trovate in una varietà di malattie e, pertanto, il profilo è applicabile come un biomarcatore per la diagnosi e la prognosi. Il trasporto extracellulare di Mirna tra le cellule attraverso le particelle lipoproteiche può fungere da meccanismo aggiuntivo per la modulazione del livello di mRNA intercellulare. Per stimare quantitativamente l'effetto biologico, è necessaria la conoscenza del contenuto di miRNA assoluto e relativo delle particelle di lipoproteina.
La PCR in tempo reale quantitativa è un metodo adatto e relativamente rapido per ottenere queste informazioni. Pertanto, il valore di quantificazione relativa (RQ) può essere calcolato e le differenze relative tra i diversi campioni e le frazioni di lipoproteina sono stimabili. Le schede di matrice microfluidica multiwell sono un metodo rapido e facile da usare per determinare la presenza relativa (equivale al valore RQ) dei miRNA in un campione. Le schede di matrice microfluidica multiwell consistono di 96 o 384 camere di reazione individuali per le singole reazioni qPCR incorporate in un dispositivo microfluidico. Ogni camera contiene la sonda di idrolisi richiesta e i primer qPCR specifici per un singolo miRNA. I vantaggi sono un breve tempo di gestione dovuto alla standardizzazione, un semplice flusso di lavoro e un numero ridotto di passaggi di pipettaggio. Inoltre, il volume campione richiesto è minimizzato. Contrariamente alla quantificazione relativa, il contenuto assoluto di miRNA richiede un confronto dei risultati dei campioni qPCR con curve standard di numeri assoluti noti di filamenti miRNA. Va notato che, a causa del loro contenuto di miRNA relativamente basso, le tecniche di imaging sensibili a singola molecola non sono realizzabili: l'arricchimento artificiale delle particelle di lipoproteina con miRNA è inevitabile per studiare interazione delle particelle di lipoproteina e trasferimento di miRNA. Per quanto riguarda questo, delipidazione della particella HDL seguita con successiva relipidazione7 permette l'incorporazione di e, quindi, arricchimento con filamenti Mirna. L'arricchimento simile delle particelle LDL con miRNA non è fattibile a causa dell'idrofobicità della proteina apoB-100, che è il costituente principale della particella LDL. Tuttavia, con l'aggiunta del solvente polare dimetilsolfossido (DMSO), che è in grado di penetrare le membrane lipidiche, le particelle di LDL possono essere caricate artificialmente con filamenti di miRNA pure.
La microscopia a forza atomica ad alta velocità (HS-AFM) è un potente strumento per la caratterizzazione di esemplari biologici che offrono una risoluzione temporale di subnanometro spaziale e subsecondo8. Quindi, è una tecnica ben adatta per il controllo di qualità delle particelle di lipoproteina modificate come particelle lipoproteiche native/ricostituite/etichettate possono essere immagine in un ambiente quasi fisiologico.
Qui, un protocollo basato su qPCR viene presentato passo-passo per determinare il contenuto di miRNA assoluto/relativo di particelle di lipoproteina e campioni di cellule, che consente una stima del tasso di assorbimento delle particelle di lipoproteina cellulare. Inoltre, è dimostrato un metodo per l'arricchimento delle particelle di lipoproteina con miRNA. Questo metodo può essere adattato per la manipolazione generale del contenuto di lipoproteine e, quindi, dimostra l'applicabilità delle particelle di lipoproteina come bersagli per la somministrazione di farmaci.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>TI 55.2</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer (EDTA)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366643</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaliumbromid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2110</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342414</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube sealer</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342428</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P029.2</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D/0650/50</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubes, MWCO 12 - 14k</td>
			<td>Spectra</td>
			<td>132700</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synthetic miRNA</td>
			<td>microSynth</td>
			<td>-</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 7</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 8</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile tubes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>ENE8.1</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf Biophotometer</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>XK20</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G-250 Stain</td>
			<td>BioRad GmbH</td>
			<td>161-0786</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3957.1</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>AustrAlco</td>
			<td>Ethanol Absolut 99.9%</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3942.1</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Multifuge X3R</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3313.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4627.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>P3556-25mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol oleate</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>C-9253-250mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>C8667-500mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass tubes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>K226.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spermine</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>S3256-1G</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>3097-25G</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>0955.2</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#181;L micropipettes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>A762.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9143.2</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amberlite XAD-2 beads</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>10357</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer casette (cut-off 20 kDa)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66003</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>465 76 83</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3054.2</td>
			<td>Labeling of LDL particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Labeling of LDL particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope</td>
			<td>RIBM</td>
			<td>SS-NEX</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscovite Mica (V-1 Grade)</td>
			<td>Christine Gr&#246;pl</td>
			<td>G250-1/V1</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Cantilever</td>
			<td>Nanoworld</td>
			<td>USC-F1.2-k0.15</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gwyddion 2.49</td>
			<td>Czech Metrology Institute</td>
			<td>http://gwyddion.net</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slides, Nunc Lab-Tek</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9117.1</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Omni Life Science GmbH</td>
			<td>Casy</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>217004</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Sterican 465 75 19</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309050</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cabinet</td>
			<td>Esco</td>
			<td>PCR-3A1</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4366596</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free water</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T143</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 ml tubes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781305</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>Microcentrifuge AL</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Sensoquest</td>
			<td>Labcycler</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Primer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal probe supermix</td>
			<td>BioRad GmbH</td>
			<td>1725131</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Corbett</td>
			<td>Rotor-Gene RG-6000</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366596</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4399966</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4391128</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4399933</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal Master Mix II, no UNG</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4440040</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA Human A Cards</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A31805</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0581</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (25mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0971</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9849</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7900HT Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4351405</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Array Card Sealer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>-</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native lipoprotein particles with microrna and subsequent determination of their absolute/relative microrna content and their cellular transfer rate

Le particelle di lipoproteina sono prevalentemente trasportatori di lipidi e colesterolo nel sangue. Inoltre, contengono piccole quantità di filamenti di microRNA non codificante (miRNA). In generale, miRNA altera il profilo delle espressioni proteiche a causa delle interazioni con il Messaggero-RNA (mRNA). Pertanto, la conoscenza del contenuto di miRNA relativo e assoluto delle particelle di lipoproteina è essenziale per stimare l'effetto biologico dell'assorbimento delle particelle cellulari. Qui viene presentato un protocollo quantitativo basato sulla reazione a catena della polimerasi (qPCR) in tempo reale per determinare il contenuto di miRNA assoluto delle particelle di lipoproteina, esemplificato come mostrato per le particelle di lipoproteina arricchite con miRNA. Il contenuto di miRNA relativo è quantificato utilizzando schede di array microfluidici multiwell Program. Inoltre, questo protocollo consente agli scienziati di stimare il miRNA cellulare e, quindi, il tasso di captazione delle particelle lipoproteiche. Un aumento significativo del livello di miRNA cellulare è osservabile quando si utilizzano particelle di lipoproteina ad alta densità (HDL) caricate artificialmente con miRNA, mentre l'incubazione con particelle di HDL native non produce alcun effetto significativo a causa del loro contenuto di miRNA piuttosto basso. Al contrario, l'assorbimento cellulare delle particelle di lipoproteina a bassa densità (LDL), né con miRNA nativo né caricato artificialmente, non ha alterato il livello di miRNA cellulare.

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Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Qui viene presentato un protocollo quantitativo basato sulla reazione a catena della polimerasi in tempo reale per la determinazione del contenuto di micro-RNA nativo (assoluto/relativo) delle particelle di lipoproteina. Inoltre, è dimostrato un metodo per aumentare il livello di micro-RNA, nonché un metodo per determinare il tasso di captazione cellulare delle particelle di lipoproteina.

Arricchimento delle particelle di lipoproteina nativa con microRNA e successiva determinazione del loro contenuto di microRNA assoluto/relativo e della loro velocità di trasferimento cellulare

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Le particelle di lipoproteina sono veicoli di trasporto nativi. L'arricchimento di sostanze estranee ne facilita l'uso come vettore di binari. L'etichettatura specifica di molecole o particelle intere rende possibile misurare l'assorbimento cellulare.I due metodi di arricchimento sono rapidi e facili da usare e possono essere adattati per un'ampia gamma di sostanze. A dimostrare la procedura saranno Markus Axmann e Andreas Karner, due postdoc del mio laboratorio. Per iniziare la delipidazione in una cappa aspirante, mescolare da uno a due millilitri di soluzione HDL preparata contenente cinque milligrammi di particelle HDL con 50 millilitri di miscela tri-a-due pre-raffreddata di etere dietile etanolo in un tubo di centrifugazione conico.Incubare per due ore a -20 gradi Celsius. Centrifuga a 2500 volte g per 10 minuti a -10 gradi Celsius. Scartare il supernatante, rimescolare il pellet in 50 millilitri di miscela di etere dietile a etanolo pre-raffreddato e vortice brevemente.Incubare una seconda volta per due ore a -20 gradi Celsius. Centrifuga di nuovo a 2500 volte g per 10 minuti a -10 gradi Celsius. Quindi inserire tubi che forniscono flusso di gas azoto per asciugare il pellet.E lo rimospendò in 250 microlitri del tampone A.Determinare la concentrazione proteica usando il saggio proteico di Bradford o un altro appropriato. È fondamentale rimuovere tutti i resti della miscela di etere dietile a base di etanolo, poiché questi solventi inibirebbero la rilipidazione delle apolipoproteine. Successivamente, diluire ad una concentrazione finale di un milligrammo di proteine per 250 microlitri del tampone A.Inserire un tubo che fornisca gas inerte nella parte della soluzione nel tubo.Se necessario, conservare la soluzione durante la notte a quattro gradi Celsius sotto l'atmosfera di gas inerte. Per iniziare la ricostituzione, in un tubo di vetro pulito, mescolare 100 microlitri di CO, 13,5 microlitri di C e 500 microlitri di PC. Quindi ruotare il tubo di vetro mentre si scarica il gas azoto all'interno del tubo per asciugare la miscela al fine di produrre uno strato superficiale omogeneo. In un tubo di reazione da 0,5 millilitri, preparare una fresca soluzione di spermina da 30 millimolare nel tampone A.Quindi mescolare 100 microlitri di microRNA sintetico da 10 micromolare con 100 microlitri di soluzione di spermina in un tubo di reazione a due millilitri.E incubare per 30 minuti a 30 gradi Celsius. Successivamente, trasferire la soluzione incubata da 200 microliter nel tubo di vetro per reidratare lo strato superficiale mastermix PC-CO-C preparato. E poi aggiungere 50 microlitri di una soluzione di deossicorato di sodio da 30 millilitri per millilitro.Mescolare a quattro gradi Celsius per due ore. Successivamente, aggiungere 250 microlitri della soluzione HDL delipidata nel tubo di vetro. E mescolare a quattro gradi Celsius durante la notte.Per iniziare la dialisi, aggiungere prima 50 grammi di perline adsorbenti a 800 millilitri di acqua doppia distillata. E utilizzare un agitatore magnetico per mescolare per un minuto. Attendere 15 minuti per le perline di stabilirsi, e decantare il supernatante.Ripetere la procedura con PBS pre-raffreddato. Cassette di dialisi pre-bagnate in PBS. Utilizzare una siringa per aggiungere la miscela preparata in precedenza nelle cassette secondo le istruzioni del produttore.Aggiungere le perle adsorbenti trattate con PBS a tre litri di PBS e posizionare le cassette nel PBS per dializzare a quattro gradi Celsius. Le perline mantengono costante il gradiente di densità lungo la membrana di dialisi. Cambiare il buffer e le perline dopo un'ora e due ore.Dopo 24 ore, con una siringa, estrarre la soluzione dalla cassetta in un tubo di reazione da 1,5 millilitri per recuperare la soluzione di particelle HDL ricostituita. Determinare la concentrazione proteica usando il saggio di Bradford. Fornire gas inerte al tubo di reazione, sigillarlo e conservare la soluzione di particelle HDL ricostituita in atmosfera di gas inerte a quattro gradi Celsius.In primo luogo, preparare una soluzione fresca di spermina da 30 millimolare in acqua priva di RNAse. Mescolare 100 microlitri di 10 micromolari di microRNA sintetico con 100 microlitri di soluzione di spermina in un tubo di reazione a due millilitri. E incubare per 30 minuti a 30 gradi Celsius.Quindi aggiungere 100 microlitri di DMSO e 1,2 millilitri di tampone 1X LDL alla soluzione di spermina di microRNA preparata. Diluire la soluzione di particelle LDL precedentemente preparata con PBS ad una concentrazione finale di circa quattro milligrammi per millilitro. Quindi disegnare 450 microlitri della soluzione diluita in un tubo di reazione da 1,5 millilitri e mescolare con 50 microlitri di tampone LDL 10X.Incubarlo per 10 minuti sul ghiaccio. Dopo l'incubazione, combinare la soluzione di particelle LDL da 500 microlitri e la soluzione di microRNA-spermina-DMSO da 1,5 millilitri e incubarla per due ore a 40 gradi Celsius. Eseguire la dialisi simile a quanto descritto in precedenza e conservare la soluzione di particelle LDL etichettata in atmosfera di gas inerte a quattro gradi Celsius.Per iniziare, diluire la soluzione di particelle HDL o LDL in PBS tra uno a 100 e uno a 1.000. Scindere la mica premendo il nastro adesivo contro il substrato di mica e tirando fuori il nastro per rimuovere gli strati superiori di mica. Utilizzare una pipetta per depositare due microlitri su mica appena sciccata per incubare per cinque minuti.Le particelle di lipoproteina tendono a formare membrane di legame continuo sulle superfici. Di conseguenza, è importante regolare la concentrazione di particelle sulla superficie della mica per ottenere quelle individuali. Dopo l'incubazione, sciacquare il campione con PBS.Riempire la cella liquida AFM ad alta velocità con PBS e montare lo scanner portamica allo stadio AFM ad alta velocità. Nel software di controllo, avviare il processo di avvicinamento del cantilever alla superficie della mica. Utilizzare dimensioni di scansione inferiori a un micrometro quadrato e mantenere le forze di imaging il più basse possibile.Immagine dell'esempio in modalità tocco. Caricare i dati nel Gwyddion e rilevare le particelle attraverso i granelli di segno per funzione di soglia. Regolate il valore della soglia di altezza per mascherare le singole particelle.Di solito, un livello intorno al 50% è un buon punto di partenza. Rimuovere lo sfondo polinomiale per appiattire l'immagine e attivare l'opzione escludi area mascherata. Esportare i valori massimi di altezza delle particelle rilevate utilizzando la distribuzione di varie caratteristiche granulose e ripetere questi passaggi per tutte le immagini registrate.In questo esperimento, la ricostituzione delle particelle HDL è stata eseguita attraverso la delipidazione delle particelle HDL, seguita da rilipidazione e dialisi. È possibile ottenere una resa del 50% delle particelle HDL ricostitute. Tuttavia, la stessa etichettatura con microRNA non era fattibile per l'etichettatura delle particelle LDL, a causa dell'idrofobicità della proteina apolipoproteina B100.Pertanto, DMSO è stato utilizzato per la penetrazione del monostrato lipidico delle particelle LDL, con una resa vicina al 100% Durante il controllo di qualità, la diluizione è fondamentale per l'analisi. L'immagine superiore mostra una densità di particelle troppo elevata. L'immagine inferiore è adatta per l'analisi.Le funzioni di densità di probabilità delle altezze delle particelle sono state calcolate per il confronto delle distribuzioni delle dimensioni delle particelle lipoproteine di controllo native, etichettate ed etichettate. La modifica relativa prima e dopo la procedura di etichettatura è trascurabile. Quando si maneggiano oligonucleotidi RNA, lavorare senza RNA.Utilizzare materiali di consumo freschi in plastica usa e getta e indossare sempre guanti. Utilizzare solo soluzioni senza nucleasi. L'AFM ad alta velocità è solo un metodo per determinare la forma generale delle lipoproteine.Un metodo alternativo sarebbe la microscopia elettronica. Indossare adeguate attrezzature di protezione individuale e lavorare in una cappa aspirante durante la manipolazione dell'etere dietile.

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