Name: enrichment of native lipoprotein particles with microrna and subsequent determination of their absolute/relative microrna content and their cellular transfer rate
Uploaded: 2019-05-09T15:00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer

この作品は、オーストリア科学基金プロジェクト P29110 ・ B21、「Hochschuljubiläumsstiftung ・デア・シュタット・ウィーン zur Förderung ・デア・ Wissenschaft」プロジェクト H-3065/2011、欧州地域開発基金 (EFRE、IWB2020)、連邦国家オーストリア、そして「陸 OÖ Basisfinanzierung」。

<ol>
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作者は何も開示することはありません。

ここでは、ヒト血液からのリポ蛋白質粒子画分の単離とそれらの個々の miRNA 含量の決定について、段階的に説明する。単離および合成された miRNA を処理しながら、RNase フリーの環境で作業することが重要であり、粒子組込み miRNA は、酵素分解から明らかに守られる。天然リポタンパク質粒子の miRNA/粒子比がかなり低くなるにつれ、細胞のホロ粒子取り込みを研究するために miRNA による人工的な濃縮が必要となる。これにより、前述の7のような HDL 粒子の再構成が、miRNA ストランドを組み込むように修飾される。さらに、この手順の間の脂質およびタンパク質フラクションの分離は、科学者がリポ蛋白質粒子19の脂質およびタンパク質関連成分を調べることを可能にする。同様の方法で、LDL 粒子の標識手順が適合される。興味深いことに、スペルミンの添加 (ヌクレオチドの自然な安定剤) は、miRNA/粒子比に影響を与えませんでした。原理的には、この方法は、リポタンパク質粒子内の miRNA 以外の他の物質の infolding を可能にすることに留意すべきである。もちろん、HDL (直径: 5-12 nm) と LDL 粒子 (直径: 18-25 nm) の全体的なサイズに基づいて物質の物理的サイズに関して制限がある。
再構成/標識リポタンパク質粒子の品質管理に関して、HS − AFM は、単一の粒子レベルで HDL/LDL 粒子を特徴付けるのに適用可能な方法である。EM と比較して、それはより短い準備時間および近い生理学的な条件 (ぬれた、室温) を可能にする。
固有の感度と増幅により、qPCR は低 miRNA 濃度を検出するための選択方法です。あるいは、単一分子感受性蛍光顕微鏡は、個々の分子をも検出することができ、例えば、粒子当たりの蛍光標識された miRNA ストランドの低濃度のためには適さないであろう。したがって、天然リポタンパク質粒子当たりの miRNA 鎖の比は、10− 8であることが見出された。人工的な濃縮は、1万の係数によって比を増加させ、これは細胞リポタンパク質取り込み速度の推定を容易にする (天然のリポタンパク質粒子19を使用して有意な差は検出されない)。QPCR の高感度により、インキュベーション時間と miRNA/粒子比の後の miRNA 鎖の数を測定することでこの取込み速度を決定することができます。計算された値は、細胞の劣化および miRNA の放出を無視し、従って、リポタンパク質粒子取り込み比について少なくとも下限を表すことに留意すべきである。
将来的には、この方法は、医薬物質 (特に親油性のもの) を細胞内に移し、それらの生物学的効果と細胞内濃度を相関させることができる (リポ蛋白質粒子の取り込み速度によって決まる)。

リポタンパク質粒子は、コレステリルエステルエステルおよびトリグリセリド脂肪のコアを内包する両親媒性脂質およびコレステロールの単層から構成される。粒子全体は、粒子の生物学的機能を定義する膜埋め込まれた apolipoproteins によって安定化される。リポ蛋白粒子は、それぞれの増加密度に応じて区別することができ、したがって、サイズを減少させる、すなわち超低密度リポタンパク質 (VLDL)、中間密度リポタンパク質 (IDL)、LDL、および HDL 粒子として。血流中の水不溶性成分の輸送にもかかわらず、HDL 粒子が miRNA1,2の非コーディング鎖を運ぶことが実証されています。マイクロ rna は短い (通常2ダースヌクレオチドの) RNA 鎖のクラスであり、これは細胞内相補的 mRNA 鎖を分解し、それにより、ある種のタンパク質の発現プロファイルを変化させる3、4、5、 6さらに、miRNA プロファイルの改変が種々の疾患において見出され、従って、プロファイルは、診断および予後のためのバイオマーカーとして適用可能である。リポ蛋白粒子を介した細胞間の Mirna の細胞外輸送は、細胞間 mRNA レベル変調のための追加機構として機能し得る。生体効果を定量的に推定するためには、リポタンパク質粒子の絶対的および相対 miRNA 含量に関する知識が必要である。
定量的リアルタイム PCR は、この情報を取得するための適切で比較的迅速な方法です。したがって、相対定量化 (RQ) 値を計算することができ、異なるサンプルとリポ蛋白画分の間の相対差は推定可能である。マルチウェルマイクロ流体アレイカードは、サンプル中の Mirna の相対存在 (RQ 値に相当) を決定するための高速で使いやすい方法です。マルチウェルマイクロ流体アレイカードは、マイクロ流体デバイスに埋め込まれた個々の qPCR 反応のための96または384の個々の反応チャンバから成ります。各チャンバには、1つの個々の miRNA に必要な加水分解プローブおよび特異的 qPCR プライマーが含まれています。その利点は、標準化による短い処理時間、簡単なワークフロー、ピペット操作の回数の減少です。さらに、必要なサンプル容積は最小になる。相対定量とは対照的に、絶対 miRNA 含有量には、miRNA ストランドの既知の絶対数の標準曲線との qPCR サンプル結果の比較が必要です。そのため、miRNA 含量が比較的低く、標準であること、さらに、単一分子感受性イメージング技術でさえも実現可能でないということは、miRNA を用いたリポタンパク質粒子の人工的な濃縮は、細胞学を研究するために不可避であることに留意すべきであるリポタンパク質粒子相互作用および miRNA 転送。これに関して、HDL 粒子の delipidation はその後に続く relipidation7を用いて、miRNA ストランドを用いて濃縮することを可能にする。MiRNA を用いた LDL 粒子の同様の濃縮は、LDL 粒子の主な構成成分である apoB-100 タンパク質の疎水性のために実現可能ではない。しかしながら、極性溶媒を添加することによりジメチルスルホキシド (DMSO)、これは脂質膜を貫通することができ、LDL 粒子は同様に miRNA 鎖を人工的に装填することができる。
高速原子間力顕微鏡 (HS-AFM) は、subnanometer 空間的および subsecond 時間的分解能8を提供する生物学的標本の特徴付けのための強力なツールです。それ故に、それは、ネイティブ/再構成/標識リポタンパク質粒子が近生理的環境下で画像化することができるように変性リポタンパク質粒子の品質管理のための十分に適した技術である。
ここでは、qPCR ベースのプロトコルを段階的に提示して、リポタンパク質粒子および細胞サンプルの絶対/相対 miRNA 含有量を決定し、これにより細胞リポタンパク質粒子の取込み速度を推定することができます。さらに、miRNA を用いたリポ蛋白質粒子の濃縮のための方法が実証されている。この方法は、リポタンパク質含量の一般的な操作のために適合され得る、したがって、薬物送達のための標的としてのリポタンパク質粒子の適用性を実証する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>TI 55.2</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer (EDTA)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366643</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaliumbromid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2110</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342414</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube sealer</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342428</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P029.2</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D/0650/50</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubes, MWCO 12 - 14k</td>
			<td>Spectra</td>
			<td>132700</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synthetic miRNA</td>
			<td>microSynth</td>
			<td>-</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 7</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 8</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile tubes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>ENE8.1</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf Biophotometer</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>XK20</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G-250 Stain</td>
			<td>BioRad GmbH</td>
			<td>161-0786</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3957.1</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>AustrAlco</td>
			<td>Ethanol Absolut 99.9%</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3942.1</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Multifuge X3R</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3313.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4627.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>P3556-25mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol oleate</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>C-9253-250mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>C8667-500mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass tubes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>K226.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spermine</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>S3256-1G</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>3097-25G</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>0955.2</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#181;L micropipettes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>A762.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9143.2</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amberlite XAD-2 beads</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>10357</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer casette (cut-off 20 kDa)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66003</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>465 76 83</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3054.2</td>
			<td>Labeling of LDL particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Labeling of LDL particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope</td>
			<td>RIBM</td>
			<td>SS-NEX</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscovite Mica (V-1 Grade)</td>
			<td>Christine Gr&#246;pl</td>
			<td>G250-1/V1</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Cantilever</td>
			<td>Nanoworld</td>
			<td>USC-F1.2-k0.15</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gwyddion 2.49</td>
			<td>Czech Metrology Institute</td>
			<td>http://gwyddion.net</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slides, Nunc Lab-Tek</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9117.1</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Omni Life Science GmbH</td>
			<td>Casy</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>217004</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Sterican 465 75 19</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309050</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cabinet</td>
			<td>Esco</td>
			<td>PCR-3A1</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4366596</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free water</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T143</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 ml tubes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781305</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>Microcentrifuge AL</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Sensoquest</td>
			<td>Labcycler</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Primer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal probe supermix</td>
			<td>BioRad GmbH</td>
			<td>1725131</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Corbett</td>
			<td>Rotor-Gene RG-6000</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366596</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4399966</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4391128</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4399933</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal Master Mix II, no UNG</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4440040</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA Human A Cards</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A31805</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0581</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (25mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0971</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9849</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7900HT Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4351405</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Array Card Sealer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>-</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native lipoprotein particles with microrna and subsequent determination of their absolute/relative microrna content and their cellular transfer rate

リポタンパク質粒子は、主に血流中の脂質およびコレステロールのトランスポーターである。さらに、少量のノンコーディングマイクロ Rna (miRNA) を含有しています。一般に、miRNA は、メッセンジャー RNA (mRNA) との相互作用によりタンパク質発現プロファイルを変化させる。したがって、リポタンパク質粒子の相対および絶対 miRNA 含量の知識は、細胞粒子取り込みの生物学的効果を推定するために不可欠である。ここでは、定量的なリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) ベースのプロトコルを用いて、天然および miRNA 濃縮リポタンパク質粒子について例示されたリポタンパク質粒子の絶対 miRNA 含有量を決定します。相対 miRNA 含有量は、マルチウェルマイクロ流体アレイ・カードを使用して定量化されます。さらに、このプロトコルは、科学者が細胞 miRNA を推定することを可能にし、したがって、リポタンパク質粒子取込み速度である。人為的に miRNA を装填した高密度リポタンパク質 (HDL) 粒子を使用する場合、細胞 miRNA レベルの有意な増加が観察されますが、天然の HDL 粒子とのインキュベーションは、それらのむしろ低い miRNA 含量のために有意な効果をもたらしません。対照的に、低密度リポタンパク質 (LDL) 粒子の細胞の取り込みは、ネイティブ miRNA と人工的にロードされていません-細胞 miRNA レベルを変化させませんでした。

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer 

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

ここでは、定量的なリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応ベースのプロトコルが、リポタンパク質粒子の天然マイクロ RNA 含量 (絶対/相対) の決定のために提示される。加えて、マイクロ RNA レベルを増加させるための方法、ならびにリポ蛋白質粒子の細胞取り込み速度を決定するための方法が、実証される。

マイクロ Rna による天然リポタンパク質粒子の濃縮とその絶対/相対マイクロ Rna 含量とその細胞移動速度の決定

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

リポタンパク質粒子は、ネイティブ輸送車です。異物の濃縮は、トラックキャリアとしての使用を容易にします。分子または粒子全体の特異的標識は、細胞の取り込み量を測定することが可能になります。濃縮のための2つの方法は、迅速かつ使いやすく、物質の広い範囲に適合することができます。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の2つのポスドクであるマルクス・アクスマンとアンドレアス・カーナーです。ヒュームフードで脱脂を開始するには、5ミリグラムのHDL粒子を含む調製済みHDL溶液の1〜2ミリリットルを、コニカル遠心管にエタノールジエチルエーテルの3対2の混合物をあらかじめ冷却して50ミリリットル混合して混合します。マイナス20°Cで2時間インキュベートします。2500回gで遠心分離機を10分間マイナス10°Cで。上清を捨て、ペレットをあらかじめ冷却したエタノールジエチルエーテル混合物の50ミリリットルで再懸濁し、渦を短時間で繰り返す。20°Cを負の20度で2時間インキュベートします。2500回gで再び2500倍の摂氏マイナス10度で10分間遠心分離機。次に、窒素ガス流を供給するチューブを挿入してペレットを乾燥させます。そして、250マイクロリットルのバッファーAに再懸濁し、ブラッドフォードタンパク質アッセイまたは別の適切なものを使用してタンパク質濃度を決定します。これらの溶媒はアポリポタンパク質の再脂質化を阻害するので、エタノールジエチルエーテル混合物の残骸を除去することが重要です。次に、バッファーAの250マイクロリットル当たり1ミリグラムのタンパク質の最終濃度に希釈し、不活性ガスを供給するチューブをチューブ内の溶液部分に挿入します。必要に応じて、不活性ガス雰囲気下で摂氏4度で一晩保存します。再構成を開始するには、クリーンガラスチューブで、100マイクロリットルのCO、13.5マイクロリットルのC、500マイクロリットルのPCを混合します。次に、窒素ガスをチューブ内部に流し込みながらガラス管を回転させて、均一な表層を得るために混合物を乾燥させる。0.5ミリリットルの反応チューブで、新鮮な30ミリモルスペルミン溶液を緩衝Aに調製し、10マイクロモル合成マイクロRNAの100マイクロリットルを100マイクロモル合成マイクロRNAと100マイクロリットルのスペルミン溶液を2ミリリットルの反応チューブに混ぜます。そして摂氏30度で30分間インキュベートします。次に、インキュベートした200マイクロリットルの溶液をガラス管に移し、調製したPC-CO-Cマスターミックス表面層を水分補給する。そして、1ミリリットルのナトリウムデオキシコール酸ナトリウム10ミリグラムの50マイクロリットルを加えます。摂氏4度で2時間かき混ぜます。その後、250マイクロリットルの脱脂HDL溶液をガラス管に加えます。そして、一晩摂氏4度でかき混ぜます。透析を開始するには、まず800ミリリットルの二重蒸留水に50グラムの吸着剤ビーズを加えます。そして、1分間かき混ぜるために磁気攪拌機を使用してください。ビーズが落ち着くまで15分待ち、上清をデカントします。事前に冷却したPBSで手順を繰り返します。PBSのプレウェット透析カセット。シリンジを使用して、メーカーの指示に従って、以前に準備した混合物をカセットに追加します。PBS処理した吸着剤ビーズを3リットルのPBSに加え、カセットをPBSに入れ、摂氏4度で透析します。ビーズは透析膜に沿って密度勾配を一定に保ちます。1時間2時間後にバッファとビーズを変更します。24時間後、シリンジを用いて、カセットから1.5ミリリットルの反応チューブに溶液を抽出し、再構成したHDL粒子溶液を回収する。ブラッドフォードアッセイを用いてタンパク質濃度を決定します。反応管に不活性ガスを供給し、それを密封し、不活性ガス雰囲気下で再構成したHDL粒子溶液を摂氏4度で貯蔵する。まず、RNAseフリー水に新鮮な30ミリモルのスペルミン溶液を調製します。合成マイクロRNAの10マイクロモルの100マイクロリットルを、2ミリリットルの反応チューブに100マイクロリットルのスペルミン溶液と混合します。そして摂氏30度で30分間インキュベートします。次に、DMSOの100マイクロリットルと1X LDLバッファーの1.2ミリリットルを調製したマイクロRNAスペルミン溶液に加えます。PBSで以前に調製したLDL粒子溶液を、1ミリリットル当たり約4ミリグラムの最終濃度に希釈する。その後、希釈した溶液の450マイクロリットルを1.5ミリリットルの反応チューブに引き込み、50マイクロリットルの10X LDLバッファーと混合します。氷の上で10分間インキュベートします。インキュベーション後、500マイクロリットルLDL粒子溶液と1.5ミリリットルマイクロRNA-スペルミンDMSO溶液を組み合わせ、摂氏40度で2時間インキュベートします。先に述べたような透析を行い、標識されたLDL粒子溶液を不活性ガス雰囲気下で摂氏4度で保存する。まず、PBSのHDLまたはLDL粒子溶液を1対100と1対1、000の間で希釈します。マイカ基板に粘着テープを押して、テープを引っ張って上のマイカ層を取り除いて、マイカを切断します。ピペットを使用して、切断したばかりのマイカに2マイクロリットルを堆積し、5分間インキュベートします。リポタンパク質粒子は、表面上の連続的な結合膜を形成する傾向がある。その結果、マイカ表面の粒子濃度を調整して個々のものを得ることが重要です。インキュベーション後、PBSでサンプルをすすいだ。高速AFM液体セルをPBSで満たし、マイカを搭載したスキャナーを高速AFMステージに取り付けます。制御ソフトウェアでは、マイカ表面へのカンチレバーのアプローチプロセスを開始する。1平方マイクロメートル未満のスキャンサイズを使用し、イメージング力をできるだけ低く保ちます。タップモードでサンプルを画像化します。Gwyddionにデータをロードし、しきい値関数によってマークグレインを介して粒子を検出します。高さのしきい値を調整して、個々のパーティクルをマスクします。通常、50%前後のレベルが良い出発点です。多項式背景を削除してイメージを平坦化し、マスク領域を除外オプションをアクティブにします。各種の粒子特性関数の分布を使用して検出されたパーティクルの最大高さの値をエクスポートし、記録されたすべての画像に対してこれらの手順を繰り返します。本実験では、HDL粒子の再構成をHDL粒子の脱脂を経て、再脂質化および透析を行った。再構成されたHDL粒子の50%の収率を達成することができる。しかしながら、同じマイクロRNAによる標識は、アポリポタンパク質B100タンパク質の疎水性のために、LDL粒子の標識には実現できなかった。このように、DMSOはLDL粒子の脂質単層の浸透に用いられ、品質管理中に100%近い収率を有し、希釈は分析に重要である。上の画像は、パーティクル密度が高すぎることを示しています。下の画像は解析に適しています。粒子高さの確率密度関数は、ネイティブ、標識、および標識対照リポタンパク質粒子のサイズ分布の比較のために計算された。ラベル付け処理の前後の相対的な変更は無視できます。RNAオリゴヌクレオチドを取り扱う場合、RNAseフリーで働く。新鮮な使い捨てのプラスチック消耗品を使用し、常に手袋を着用してください。ヌクレアーゼフリー溶液のみを使用してください。高速AFMは、リポタンパク質の一般的な形状を決定する1つの方法に過ぎません。別の方法は電子顕微鏡です。適切な個人用保護具を着用し、ジエチルエーテルを扱いながらヒュームフードで作業します。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

混合リジン型/アルギニン型モノマーおよびそれらの抗リーシュマニア活性の評価とペプトイドの合成のための効率的な方法

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

1,2- Azaborinesの合成とT4リゾチーム変異体とのタンパク質複合体の調製

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

シアノバクテリアにおけるグリコーゲン含有量の測定

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

タンパク質キャピラリー等電点焦点法によるアイソ フォームの高感度・定量的検出

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

共有結合 DNA 付加体生成活性酵素によって発ガン性物質の in Vitro薬物と32p-ポストラベルで決意

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

ネイティブな携帯電話環境におけるコンテキスト固有蛋白質複合体の分割-BioID-プロテオーム解析

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

シアノ バクテリア阻害のフィコビリタンパク質の吸光光度定量

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

生理活性とエネルギー依存性タンパク質輸送アッセイでの使用の分離

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

ミトコンドリアの呼吸鎖 Supercomplexes の分離と分析のためのハイブリッドクリア/ブルーネイティブ電気泳動

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

細菌病原体脂肪酸を膜リン脂質に取り込む研究のための鶏卵黄からのリポタンパク質粒子の単離

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...