Name: enrichment of native lipoprotein particles with microrna and subsequent determination of their absolute/relative microrna content and their cellular transfer rate
Uploaded: 2019-05-09T15:00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer

Dette arbeidet ble støttet av den østerrikske Science Fund Project P29110-B21, "Hochschuljubiläumsstiftung der Stadt Wien Zur Förderung der Wissenschaft" Project H-3065/2011, det europeiske fondet for regional utvikling (EFRE, IWB2020), den føderale staten Upper Østerrike, og "land OÖ Basisfinanzierung".

<ol>
	<li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins.">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 423-435 (2011).</li><li>Tabet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-transferred+microRNA-223+regulates+ICAM-1+expression+in+endothelial+cells.">HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Wahid, F., Shehzad, A., Khan, T., Kim, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Synthesis,+mechanism,+function,+and+recent+clinical+trials.">MicroRNAs: Synthesis, mechanism, function, and recent clinical trials.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1803 (11), 1231-1243 (2010).</li><li>Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+Mechanisms+of+miRNAs+and+siRNAs.">Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs.</a> Cell. 136 (4), 642-655 (2009).</li><li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+Translation+and+Stability+by+microRNAs.">Regulation of mRNA Translation and Stability by microRNAs.</a> Annual Review of Biochemistry. 79 (1), 351-379 (2010).</li><li>Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+post-transcriptional+regulation+by+microRNAs:+Are+the+answers+in+sight?.">Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: Are the answers in sight?.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).</li><li>Jonas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+High-Density+Lipoproteins.">Reconstitution of High-Density Lipoproteins.</a> Methods in Enzymology. , 553-582 (1986).</li><li>Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+AFM+and+Applications+to+Biomolecular+Systems.">High-Speed AFM and Applications to Biomolecular Systems.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 393-414 (2013).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments.">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Patsch, J. R., Patsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonal+ultracentrifugation.">Zonal ultracentrifugation.</a> Methods in Enzymology. 129 (1966), 3-26 (1986).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Yamamoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Techniques+for+Observing+Dynamic+Biomolecular+Processes.">High-Speed Atomic Force Microscopy Techniques for Observing Dynamic Biomolecular Processes.</a> Methods in Enzymology. 475, 541-564 (2010).</li><li>Stangl, H., Cao, G., Wyne, K. L., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+receptor,+class+B,+type+I-dependent+stimulation+of+cholesterol+esterification+by+high+density+lipoproteins,+low+density+lipoproteins,+and+nonlipoprotein+cholesterol.">Scavenger receptor, class B, type I-dependent stimulation of cholesterol esterification by high density lipoproteins, low density lipoproteins, and nonlipoprotein cholesterol.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (47), 31002-31008 (1998).</li><li>Hochberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+a+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: a Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. 57 (1), 289-300 (1995).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization.">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biology. 10 (6), (2009).</li><li>Schumaker, V. N., Puppione, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=6]+Sequential+Flotation+Ultracentrifugation.">6] Sequential Flotation Ultracentrifugation.</a> Methods in Enzymology. 128 (C), 155-170 (1986).</li><li>Wagner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+levels+and+cellular+transfer+of+circulating+lipoprotein-bound+microRNAs.">Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1392-1400 (2013).</li><li>Meier, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+chronic+kidney+disease+on+macrophage+cholesterol+efflux.">Effect of chronic kidney disease on macrophage cholesterol efflux.</a> Life Sciences. 136, 1-6 (2015).</li><li>Axmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+and+Lipoprotein+Particle+miRNA+Profile+in+Uremia+Patients.">Serum and Lipoprotein Particle miRNA Profile in Uremia Patients.</a> Genes. 9 (11), 533 (2018).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Her beskrives isolasjonen av lipoprotein partikkel fraksjoner fra humant blod og fastsettelse av deres individuelle miRNA innhold trinn for trinn. Det er viktig å arbeide i et RNase-fritt miljø mens håndtering isolert og syntetisert miRNA-partikkel-embedded miRNA er åpenbart skjermet fra enzymatisk degradering. Som miRNA/partikkel ratio av innfødte lipoprotein partikler er ganske lav, kunstig berikelse med miRNA er nødvendig for å studere Holo partikkel opptaket av celler. Derved er rekonstituering av HDL-partikler som beskrevet tidligere7 modifisert til å innlemme miRNA tråder. I tillegg separasjon av lipid og protein brøkdel i denne prosedyren gjør det mulig for forskere å undersøke lipid-og protein-tilknyttede komponenter i lipoprotein partikkel19. På en lignende måte, er merkings prosedyren av LDL-partikler tilpasset. Interessant, tillegg av spermin-en naturlig stabilisator av nukleotider-ikke påvirke den miRNA/partikkel ratio. Det bør bemerkes at, i prinsippet, tillater metoden infolding av andre stoffer enn miRNA innenfor en lipoprotein partikkel. Selvfølgelig, det er en grense med hensyn til den fysiske størrelsen på stoffet basert på den totale størrelsen på HDL (diameter: 5-12 NM) og LDL partikler (diameter: 18-25 NM).
Når det gjelder kvalitetskontroll av rekonstituert/merket lipoprotein partikler, HS-AFM er en anvendelig metode for å karakterisere HDL/LDL partikler på enkelt partikkel nivå. I forhold til EM, gir det for kortere Forberedelses tider og nær fysiologiske forhold (våt, romtemperatur).
På grunn av sin iboende følsomhet og forsterkning, er qPCR metoden for valg for å oppdage lav miRNA konsentrasjoner. Alternativt, enkelt-molekyl følsom fluorescens mikroskopi, som er i stand til å oppdage selv individuelle molekyler, ville ikke være egnet på grunn av den lave konsentrasjoner av for eksempel fluorescensmerkete merket miRNA tråder per partikkel. Dermed forholdet mellom miRNA tråder per native lipoprotein partikkel er funnet å være 10-8. Kunstig berikelse øker forholdet med en faktor på 10 000, som forenkler estimering av Cellular lipoprotein opptaket rate (ingen signifikant forskjell oppdages ved hjelp native lipoprotein partikler 19). Den høye følsomheten til qPCR gjør det mulig å fastslå dette opptaket rate ved å måle antall miRNA tråder etter inkubasjonstid og miRNA/partikkel ratio. Det bør bemerkes at den beregnede verdien ignorerer cellulær degradering og frigjøring av miRNA og dermed representerer minst en nedre grense for lipoprotein partikkel opptak ratio.
I fremtiden kan metoden tilpasses til å overføre farmasøytiske stoffer (spesielt også lipofile seg) i celler og relatere deres biologiske effekten til intracellulære konsentrasjon (bestemmes via opptaket rate av lipoprotein partikler).

Lipoprotein partikler er sammensatt av en monolag av amfifile lipider og kolesterol omslutter en kjerne av cholesteryl estere og triglyserider fett. Hele partikkel er stabilisert av membran-embedded Apolipoproteins, som definerer partikkel biologiske funksjonalitet. Lipoprotein partikler kan skilles i henhold til deres respektive økende tetthet og dermed synkende størrelse, nemlig som svært lav tetthet lipoprotein (VLDL), middels-density lipoprotein (IDL), LDL, og HDL-partikler. Til tross for transport av vann-uløselig komponenter i blodet, det har blitt demonstrert at HDL partikler bære Noncoding tråder av miRNA1,2. Mikro-RNAs er en klasse av korte (vanligvis to dusin nukleotider) RNA tråder, som brytes ned intracellulært komplementære mRNA tråder og dermed endre uttrykket profilen til visse proteiner3,4,5, 6i den. Videre endringer av miRNA profilen har blitt funnet i en rekke sykdommer og dermed profilen er aktuelt som en biomarkør for diagnostisering og prognose. Den ekstracellulære transport av miRNAs mellom celler via lipoprotein partikler kan tjene som en ekstra mekanisme for intercellulære mRNA nivå moduleringshjul. Å kvantitativt anslå biologisk effekt, kunnskap om den absolutte og relative miRNA innholdet av lipoprotein partikler er nødvendig.
Kvantitativ sann tids PCR er en passende og relativt rask metode for å få denne informasjonen. Således, det slektning kvantifisering (RQ) salgsverdi kan beregnet, og slektning forskjellene imellom annerledes eksemplar og lipoprotein brøk er estimable. Multiwell mikrovæskebasert array kort er en rask og enkel å bruke metode for å bestemme den relative tilstedeværelsen (tilsvarer RQ verdi) av miRNAs i en prøve. Multiwell mikrovæskebasert array-kort består av 96 eller 384 individuelle reaksjons kamre for individuelle qPCR-reaksjoner som er innebygd i en mikrovæskebasert enhet. Hvert kammer inneholder den nødvendige hydrolyse sonden og spesifikke qPCR primere for en individuell miRNA. Fordelene er en kort håndteringstid på grunn av standardisering, en enkel arbeidsflyt, og et redusert antall pipettering trinn. Videre er det nødvendige prøvevolumet minimert. I motsetning til den relative kvantifisering, den absolutte miRNA innholdet krever en sammenligning av qPCR sample resultater med standard kurver av kjente absolutte antall miRNA tråder. Det bør bemerkes at, på grunn av deres relativt lave miRNA innhold, standard og dessuten selv enkelt-molekylet sensitive Imaging teknikker er ikke gjennomførbart-den kunstige berikelse av lipoprotein partikler med miRNA er uunngåelig å studere mobilnettet lipoprotein partikkel interaksjon og miRNA overføring. Når det gjelder dette, delipidation av HDL-partikkel etterfulgt med påfølgende relipidation7 tillater inkorporering av og dermed berikelse med miRNA tråder. Lignende berikelse av LDL-partikler med miRNA er ikke gjennomførbart på grunn av hydrofobisiteten av apoB-100 protein, som er den viktigste bestanddel av LDL partikkel. Men, ved tilsetning av Polar løsemiddel dimethyl sulfoxide (DMSO), som er i stand til å trenge lipid membraner, kan LDL partikler være kunstig lastet med miRNA tråder også.
High-Speed Atomic Force mikroskopi (HS-AFM) er et kraftig verktøy for karakterisering av biologiske prøver som tilbyr subnanometer romlig og subsecond Temporal oppløsning8. Derfor er det en godt egnet teknikk for kvalitetskontroll av modifiserte lipoprotein partikler som innfødt/rekonstituert/merket lipoprotein partikler kan bli avbildet under en nær fysiologiske miljø.
Her, en qPCR-basert protokoll presenteres steg-for-trinn for å bestemme absolutt/relativ miRNA innholdet i lipoprotein partikler og celleprøver, som tillater en estimering av mobilnettet lipoprotein partikkel opptak rate. Videre er en metode for berikelse av lipoprotein partikler med miRNA demonstrert. Denne metoden kan tilpasses for den generelle manipulering av lipoprotein innhold og dermed demonstrerer anvendelsen av lipoprotein partikler som mål for narkotika levering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>TI 55.2</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer (EDTA)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366643</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaliumbromid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2110</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342414</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube sealer</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342428</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P029.2</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D/0650/50</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubes, MWCO 12 - 14k</td>
			<td>Spectra</td>
			<td>132700</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synthetic miRNA</td>
			<td>microSynth</td>
			<td>-</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 7</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 8</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile tubes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>ENE8.1</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf Biophotometer</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>XK20</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G-250 Stain</td>
			<td>BioRad GmbH</td>
			<td>161-0786</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3957.1</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>AustrAlco</td>
			<td>Ethanol Absolut 99.9%</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3942.1</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Multifuge X3R</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3313.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4627.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>P3556-25mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol oleate</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>C-9253-250mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>C8667-500mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass tubes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>K226.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spermine</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>S3256-1G</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>3097-25G</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>0955.2</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#181;L micropipettes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>A762.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9143.2</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amberlite XAD-2 beads</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>10357</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer casette (cut-off 20 kDa)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66003</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>465 76 83</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3054.2</td>
			<td>Labeling of LDL particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Labeling of LDL particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope</td>
			<td>RIBM</td>
			<td>SS-NEX</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscovite Mica (V-1 Grade)</td>
			<td>Christine Gr&#246;pl</td>
			<td>G250-1/V1</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Cantilever</td>
			<td>Nanoworld</td>
			<td>USC-F1.2-k0.15</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gwyddion 2.49</td>
			<td>Czech Metrology Institute</td>
			<td>http://gwyddion.net</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slides, Nunc Lab-Tek</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9117.1</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Omni Life Science GmbH</td>
			<td>Casy</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>217004</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Sterican 465 75 19</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309050</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cabinet</td>
			<td>Esco</td>
			<td>PCR-3A1</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4366596</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free water</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T143</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 ml tubes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781305</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>Microcentrifuge AL</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Sensoquest</td>
			<td>Labcycler</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Primer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal probe supermix</td>
			<td>BioRad GmbH</td>
			<td>1725131</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Corbett</td>
			<td>Rotor-Gene RG-6000</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366596</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4399966</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4391128</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4399933</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal Master Mix II, no UNG</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4440040</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA Human A Cards</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A31805</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0581</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (25mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0971</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9849</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7900HT Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4351405</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Array Card Sealer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>-</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native lipoprotein particles with microrna and subsequent determination of their absolute/relative microrna content and their cellular transfer rate

Lipoprotein partikler er hovedsakelig transportører av lipider og kolesterol i blodet. Videre inneholder de små mengder av tråder av Noncoding microRNA (miRNA). Generelt endrer miRNA protein uttrykks profilen på grunn av interaksjoner med Messenger-RNA (mRNA). Således, kunnskap av det slektning og absolutt miRNA innhold av lipoprotein partikler er vesentlige å anslå den Biological bevirke av Cellular partikkel opptak. Her er en kvantitativ sanntids polymerase kjedere reaksjon (qPCR)-basert protokoll presentert for å bestemme den absolutte miRNA innholdet av lipoprotein partikler-et eksempel vist for innfødte og miRNA-beriket lipoprotein partikler. Den relative miRNA innholdet er kvantifisert bruker multiwell mikrovæskebasert array kort. Videre denne protokollen tillater forskere å anslå mobilnettet miRNA og dermed lipoprotein partikkel opptak rate. En betydelig økning av mobilnettet miRNA nivå er Observer når du bruker high-density lipoprotein (HDL) partikler kunstig lastet med miRNA, mens inkubasjons med innfødte HDL partikler gir ingen signifikant effekt på grunn av deres ganske lav miRNA innhold. I kontrast, mobilnettet opptaket av lav tetthet lipoprotein (LDL) partikler-verken med innfødte miRNA eller kunstig lastet med det-ikke endre mobilnettet miRNA nivå.

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer 

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Her presenteres en kvantitativ sann tids polymerase kjede reaksjons BAS ert protokoll for fastsettelse av det opprinnelige mikro-RNA-innholdet (absolutt/relativ) av lipoprotein-partikler. I tillegg er en metode for å øke Micro-RNA nivå, samt en metode for å bestemme den cellulære opptaket rate av lipoprotein partikler, demonstrert.

Berikelse av Native lipoprotein partikler med microRNA og påfølgende fastsettelse av deres Absolute/relative microRNA innhold og deres Cellular overføringshastighet

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Lipoproteinpartikler er innfødte transportkjøretøy. Berikelsen av fremmede stoffer letter bruken som sporbærer. Spesifikk merking av molekyler eller hele partikler gjør det mulig å måle det cellulære opptaket.De to metodene for berikelse er raske og enkle å bruke, og kan tilpasses et bredt spekter av stoffer. Å demonstrere prosedyren vil være Markus Axmann og Andreas Karner, to postdoktorer fra laboratoriet mitt. For å begynne delipidering i en røykhette, bland en til to milliliter tilberedt HDL-løsning som inneholder fem milligram HDL-partikler med 50 milliliter forhåndskjølt tre-til-to-blanding av etanolbenyliseringsmiddel i et konisk sentrifugeringsrør.Inkuber i to timer ved negative 20 grader Celsius. Sentrifuge ved 2500 ganger g i 10 minutter ved negativ 10 grader Celsius. Kast den supernatante, resuspend pellet i 50 milliliter av pre-avkjølt etanol dietyleter blanding, og vortex kort.Inkuber en gang til i to timer ved negative 20 grader Celsius. Sentrifuge igjen på 2500 ganger g i 10 minutter ved negative 10 grader Celsius. Sett deretter inn rør som leverer nitrogengassstrøm for å tørke pelleten.Og resuspend det i 250 mikroliter buffer A.Bestem proteinkonsentrasjonen ved hjelp av Bradford protein analyse eller en annen passende. Det er viktig å fjerne eventuelle rester av etanol dietyliserblandingen, da disse løsemidlene ville hemme relipidation av apolipoproteiner. Deretter fortynnes til en endelig konsentrasjon på ett milligram protein per 250 mikroliter buffer A.Sett inn en slange som leverer inert gass inn i løsningsdelen i røret.Om nødvendig, lagre løsningen over natten på fire grader Celsius under inert gass atmosfære. For å begynne rekonstituering, bland 100 mikroliter co, 13,5 mikroliter C og 500 mikroliter PC i et rent glass. Roter deretter glassrøret mens du spyler nitrogengass inne i røret for å tørke blandingen for å gi et homogent overflatelag. I et 0,5-milliliter reaksjonsrør, lag en frisk 30-millimolar sperminløsning i buffer A.Bland deretter 100 mikroliter med 10 mikromos syntetiske microRNA med 100 mikroliter sperminløsning i et to milliliter reaksjonsrør.Og inkuber i 30 minutter ved 30 grader Celsius. Deretter overfører du den inkuberte 200-mikroliteroppløsningen til glassrøret for å rehydrere det tilberedte PC-CO-C mastermix overflatelaget. Og legg deretter til 50 mikroliter av en 30 milligram per milliliter natriumdeoksykollatløsning.Rør ved fire grader Celsius i to timer. Deretter legger du til 250 mikroliter av den deliperte HDL-løsningen i glassrøret. Og rør på fire grader Celsius over natten.For å begynne dialyse, legg først til 50 gram adsorbentperler til 800 milliliter dobbeltdestillert vann. Og bruk en magnetisk rører til å røre i ett minutt. Vent 15 minutter for perlene å bosette seg, og dekantere det overnaturlige.Gjenta prosedyren med forhåndskjølt PBS. Pre-våt dialyse kassetter i PBS. Bruk en sprøyte til å legge den tidligere tilberedte blandingen i kassettene i henhold til produsentens instruksjoner.Tilsett PBS-behandlede adsorbentperler til tre liter PBS, og legg kassettene i PBS for å dialyze ved fire grader Celsius. Perlene holder tettheten gradient langs dialysemembranen konstant. Endre bufferen og perlene etter en time og to timer.Etter 24 timer, med en sprøyte, trekker du oppløsningen fra kassetten til et reaksjonsrør på 1,5 milliliter for å gjenopprette den rekonstituerte HDL-partikkeloppløsningen. Bestem proteinkonsentrasjonen ved hjelp av Bradford-analysen. Tilsyne inert gass til reaksjonsrøret, forsegle den og lagre den rekonstituerte HDL-partikkelløsningen under inert gassatmosfære ved fire grader Celsius.Først, forberede en frisk 30-millimolar spermin løsning i RNAse-fritt vann. Bland 100 mikroliter med 10 mikromos syntetisk microRNA med 100 mikroliter sperminløsning i et to milliliter reaksjonsrør. Og inkuber i 30 minutter ved 30 grader Celsius.Tilsett deretter 100 mikroliter DMSO og 1,2 milliliter 1X LDL-buffer til den tilberedte microRNA-sædinløsningen. Fortynn tidligere forberedt LDL partikkeloppløsning med PBS til en endelig konsentrasjon på ca. fire milligram per milliliter. Trekk deretter 450 mikroliter av den fortynnede oppløsningen inn i et reaksjonsrør på 1,5 milliliter, og bland med 50 mikroliter 10X LDL-buffer.Inkuber den i 10 minutter på is. Etter inkubasjon kombinerer du 500 mikroliter LDL-partikkelløsningen og den 1,5 milliliter mikroRNA-spermine-DMSO-løsningen, og inkuberer den i to timer ved 40 grader Celsius. Utfør dialyse på samme måte som tidligere beskrevet, og oppbevar den merkede LDL-partikkeloppløsningen under inert gassatmosfære ved fire grader Celsius.Til å begynne med fortynnes HDL- eller LDL-partikkeloppløsningen i PBS mellom en til 100 og en-til-1 000. Cleave glimmer ved å trykke tape mot glimmerunderlaget, og trekke båndet av for å fjerne de øvre glimmerlagene. Bruk en pipette til å deponere to mikroliter på nyklyst glimmer for å inkubere i fem minutter.Lipoproteinpartikler har en tendens til å danne kontinuerlige bindingsmembraner på overflater. Derfor er det viktig å justere partikkelkonsentrasjonen på glimmeroverflaten for å få individuelle. Etter inkubasjon, skyll prøven med PBS.Fyll høyhastighets AFM-væskecellen med PBS, og monter den glimmerbærende skanneren til høyhastighets AFM-fasen. I kontrollprogramvaren starter du tilnærmingsprosessen til cantilever til glimmeroverflaten. Bruk skannestørrelser som er mindre enn ett kvadratisk mikrometer, og hold bildekreftene så lave som mulig.Bilde av eksemplet i tappemodus. Last dataene inn i Gwyddion, og oppdage partiklene via markkornene etter terskelfunksjon. Juster høydeterskelverdien for å maskere de enkelte partiklene.Vanligvis er et nivå rundt 50%et godt utgangspunkt. Fjern polynom bakgrunn for å flate bildet, og aktiver alternativet Utelat maskert område. Eksporter de maksimale høydeverdiene til de oppdagede partiklene ved hjelp av fordelingen av ulike kornegenskaper funksjon, og gjenta disse trinnene for alle innspilte bilder.I dette eksperimentet ble rekonstituering av HDL-partikler utført ved delipidering av HDL-partikler, etterfulgt av relipidation og dialyse. Et utbytte på 50% av rekonstituerte HDL-partikler kan oppnås. Den samme merkingen med microRNA var imidlertid ikke mulig for merking av LDL-partikler, på grunn av hydrofobiiteten til apolipoproteinet B100 protein.Dermed ble DMSO brukt til penetrasjon av lipidmonolaget til LDL-partiklene, med et utbytte nær 100%Under kvalitetskontroll er fortynningen kritisk for analyse. Det øverste bildet viser en for høy partikkeltetthet. Det nederste bildet er egnet for analyse.Sannsynlighetstetthetsfunksjoner av partikkelhøyder ble beregnet for sammenligning av størrelsesfordelinger av de innfødte, merkede og merkede kontroll lipoproteinpartikler. Den relative endringen før og etter merkingsprosedyren er forsømt. Når du håndterer RNA oligonucleotides, må du arbeide RNAse-fri.Bruk ferske engangsplastforbruk, og bruk alltid hansker. Bruk bare kjernefrie løsninger. Høyhastighets AFM er bare én metode for å bestemme den generelle formen på lipoproteiner.En alternativ metode ville være elektronmikroskopi. Bruk egnet personlig verneutstyr, og arbeid i en røykhette mens du håndterer dietyleter.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

En effektiv metode for syntese av Peptoids med Mixed Lysin-type / Arginin-type Monomerer og evaluering av deres anti-leishmanial aktivitet

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Syntese av 1,2-Azaborines og utarbeidelse av deres protein komplekser med T4 Lysozyme Mutants

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestemmelse av glykogeninnholdet i cyanobakterier

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Svært Sensitive og kvantitative påvisning av proteiner og deres isoformene av kapillær Isoelectric fokuserer metoden

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Dannelsen av kovalente DNA-addukter av enzymatisk aktivert kreftfremkallende og narkotika In Vitro og deres vilje av 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID-Proteomic analyse av kontekstavhengige Protein komplekser i sitt opprinnelige mobilnettet miljø

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spektrofotometri fastsettelse av Phycobiliprotein innhold i Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering av fysiologisk aktiv Thylakoids og deres bruk i energi avhengig av Protein Transport analyser

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Hybrid Clear/Blue native elektroforese for separasjon og analyse av mitokondrie respiratory Chain Supercomplexes

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolering av lipoprotein partikler fra Chicken egg eggeplomme for studier av bakteriell patogen fatty acid innlemmelse i membran fosfolipider

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...