Name: enrichment of native lipoprotein particles with microrna and subsequent determination of their absolute/relative microrna content and their cellular transfer rate
Uploaded: 2019-05-09T15:00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer

Este trabajo fue apoyado por el proyecto del fondo científico austriaco P29110-B21, la "Hochschuljubiläumsstiftung der Stadt Wien Zur Förderung der Wissenschaft" proyecto H-3065/2011, el Fondo Europeo para el desarrollo regional (EFRE, IWB2020), el estado federal de Upper Austria, y el "Land OÖ Basisfinanzierung".

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, el aislamiento de las fracciones de partículas de lipoproteínas de la sangre humana y la determinación de su contenido individual de miRNA se describe paso a paso. Es fundamental trabajar en un entorno libre de RNase mientras se maneja miRNA aislada y sintetizada: miRNA incrustada de partículas está obviamente protegida de la degradación enzimática. Como la relación miRNA/partícula de las partículas de lipoproteínas nativas es bastante baja, se requiere enriquecimiento artificial con miRNA para estudiar la captación de partículas holo de las células. Por lo tanto, la reconstitución de partículas HDL como se describió anteriormente7 se modifica para incorporar hebras de Mirna. Además, la separación de la fracción de lípidos y proteínas durante este procedimiento permite a los científicos examinar los componentes asociados a lípidos y proteínas de la partícula de lipoproteína19. De manera similar, se adapta el procedimiento de etiquetado de las partículas de LDL. Curiosamente, la adición de espermina — un estabilizador natural de los nucleótidos — no influyó en la relación miRNA/partícula. Cabe señalar que, en principio, el método permite la inplegamiento de otras sustancias que miRNA dentro de una partícula de lipoproteína. Por supuesto, hay un límite con respecto al tamaño físico de la sustancia basado en el tamaño total de HDL (diámetro: 5-12 Nm) y las partículas de LDL (diámetro: 18-25 nm).
En cuanto al control de calidad de las partículas de lipoproteínas reconstituidas/etiquetadas, el HS-AFM es un método aplicable para caracterizar las partículas de HDL/LDL en el nivel de partícula única. En comparación con el EM, permite tiempos de preparación más cortos y condiciones casi fisiológicas (húmedo, temperatura ambiente).
Debido a su inherente sensibilidad y amplificación, la qPCR es el método de elección para detectar bajas concentraciones de miRNA. Alternativamente, la microscopía de fluorescencia sensible a una molécula, que es capaz de detectar incluso moléculas individuales, no sería adecuada debido a las bajas concentraciones de, por ejemplo, hebras de miRNA etiquetadas con fluorescentemente por partícula. Por lo tanto, se ha encontrado que la proporción de hebras de miRNA por partícula de lipoproteína nativa es de 10 a8. El enriquecimiento artificial aumenta la relación por un factor de 10.000, lo que facilita la estimación de la tasa de captación de lipoproteínas celulares (no se detecta ninguna diferencia significativa usando partículas nativas de lipoproteína 19). La alta sensibilidad de la qPCR hace posible determinar esta tasa de captación midiendo el número de hebras de miRNA después del tiempo de incubación y la relación miRNA/partícula. Cabe señalar que el valor calculado ignora la degradación celular y la liberación de miRNA y, por lo tanto, representa al menos un límite inferior para la proporción de captación de partículas de lipoproteínas.
En el futuro, el método se puede adaptar para transferir sustancias farmacéuticas (especialmente también las lipofílicas) en las células y correlacionar su efecto biológico con la concentración intracelular (determinada a través de la tasa de captación de partículas de lipoproteínas).

Las partículas de lipoproteína se componen de una monocapa de lípidos anfifílicos y colesterol que encierra un núcleo de ésteres de colesteryl y grasas de triglicéridos. Toda la partícula es estabilizada por las Apolipoproteínas incrustadas por membrana, que definen la funcionalidad biológica de la partícula. Las partículas de lipoproteína pueden distinguirse según su respectiva densidad creciente y, por lo tanto, disminuyendo el tamaño, a saber, como lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de densidad intermedia (IDL), LDL y partículas de HDL. A pesar del transporte de componentes insolubles en agua en el torrente sanguíneo, se ha demostrado que las partículas de HDL llevan hebras no codificantes de Mirna1,2. Las micro-RNAs son una clase de hebras de ARN cortas (generalmente dos docenas de nucleótidos), que degradan las hebras de mRNA complementarias intracelular y, de este modo, alteran el perfil de expresión de ciertas proteínas3,4,5, 6. Además, las alteraciones del perfil de miRNA se han encontrado en una variedad de enfermedades y, por lo tanto, el perfil es aplicable como un biomarcador para el diagnóstico y el pronóstico. El transporte extracelular de miRNAs entre células a través de partículas de lipoproteínas puede servir como un mecanismo adicional para la modulación del nivel de mRNA intercelular. Para estimar cuantitativamente el efecto biológico, se necesita conocimiento sobre el contenido miRNA absoluto y relativo de las partículas de lipoproteínas.
La PCR cuantitativa en tiempo real es un método adecuado y relativamente rápido para obtener esta información. Por lo tanto, el valor de cuantificación relativa (RQ) puede calcularse, y las diferencias relativas entre las diferentes muestras y las fracciones de lipoproteínas son estimable. Las tarjetas de matriz microfluidos multiwell son un método rápido y fácil de usar para determinar la presencia relativa (equivale al valor RQ) de miRNAs en una muestra. Las tarjetas de matriz de microfluidos multiwell constan de 96 o 384 cámaras de reacción individuales para las reacciones de qPCR individuales incrustadas en un dispositivo microfluidico. Cada cámara contiene la sonda de hidrólisis requerida y los imprimadores específicos de qPCR para un miRNA individual. Las ventajas son un tiempo de manipulación corto debido a la estandarización, un flujo de trabajo simple y un número reducido de pasos de pipeteo. Además, se minimiza el volumen de muestra necesario. A diferencia de la cuantificación relativa, el contenido absoluto de miRNA requiere una comparación de los resultados de la muestra de qPCR con curvas estándar de números absolutos conocidos de hebras de miRNA. Cabe señalar que, debido a su relativamente bajo contenido de miRNA, estándar y, por otra parte, incluso las técnicas de imágenes sensibles de una sola molécula no son factibles — el enriquecimiento artificial de las partículas de lipoproteína con miRNA es inevitable para estudiar celulares interacción de partículas de lipoproteínas y transferencia de miRNA. En cuanto a esto, la delipiación de la partícula HDL seguida con la posterior refundación7 permite la incorporación y, por lo tanto, el enriquecimiento con hebras de Mirna. El enriquecimiento similar de las partículas de LDL con miRNA no es factible debido a la hidrofobicidad de la proteína apoB-100, que es el componente principal de la partícula de LDL. Sin embargo, por adición del disolvente polar dimetilsulfóxido (DMSO), que es capaz de penetrar las membranas lipídicas, partículas de LDL pueden ser artificialmente cargados con miRNA hebras, así.
La microscopía de fuerza atómica de alta velocidad (HS-AFM) es una poderosa herramienta para la caracterización de especímenes biológicos que ofrecen una resolución temporal de subnanómetros espaciales y subsegundos8. Por lo tanto, es una técnica adecuada para el control de calidad de las partículas de lipoproteínas modificadas como partículas de lipoproteínas nativas/reconstituidas/etiquetadas pueden ser imágenes bajo un ambiente casi fisiológico.
Aquí, un protocolo basado en qPCR se presenta paso a paso para determinar el contenido de miRNA absoluto/relativo de partículas de lipoproteína y muestras celulares, lo que permite una estimación de la tasa de captación de partículas de lipoproteínas celulares. Por otra parte, se demuestra un método para el enriquecimiento de las partículas de lipoproteínas con miRNA. Este método puede ser adaptado para la manipulación general del contenido de lipoproteínas y, por lo tanto, demuestra la aplicabilidad de las partículas de lipoproteínas como objetivos para la administración de fármacos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>TI 55.2</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer (EDTA)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366643</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaliumbromid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2110</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342414</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube sealer</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342428</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P029.2</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D/0650/50</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubes, MWCO 12 - 14k</td>
			<td>Spectra</td>
			<td>132700</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synthetic miRNA</td>
			<td>microSynth</td>
			<td>-</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 7</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 8</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile tubes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>ENE8.1</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf Biophotometer</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>XK20</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G-250 Stain</td>
			<td>BioRad GmbH</td>
			<td>161-0786</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3957.1</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>AustrAlco</td>
			<td>Ethanol Absolut 99.9%</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3942.1</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Multifuge X3R</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3313.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4627.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>P3556-25mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol oleate</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>C-9253-250mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>C8667-500mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass tubes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>K226.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spermine</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>S3256-1G</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>3097-25G</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>0955.2</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#181;L micropipettes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>A762.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9143.2</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amberlite XAD-2 beads</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>10357</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer casette (cut-off 20 kDa)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66003</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>465 76 83</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3054.2</td>
			<td>Labeling of LDL particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Labeling of LDL particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope</td>
			<td>RIBM</td>
			<td>SS-NEX</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscovite Mica (V-1 Grade)</td>
			<td>Christine Gr&#246;pl</td>
			<td>G250-1/V1</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Cantilever</td>
			<td>Nanoworld</td>
			<td>USC-F1.2-k0.15</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gwyddion 2.49</td>
			<td>Czech Metrology Institute</td>
			<td>http://gwyddion.net</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slides, Nunc Lab-Tek</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9117.1</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Omni Life Science GmbH</td>
			<td>Casy</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>217004</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Sterican 465 75 19</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309050</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cabinet</td>
			<td>Esco</td>
			<td>PCR-3A1</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4366596</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free water</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T143</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 ml tubes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781305</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>Microcentrifuge AL</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Sensoquest</td>
			<td>Labcycler</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Primer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal probe supermix</td>
			<td>BioRad GmbH</td>
			<td>1725131</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Corbett</td>
			<td>Rotor-Gene RG-6000</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366596</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4399966</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4391128</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4399933</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal Master Mix II, no UNG</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4440040</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA Human A Cards</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A31805</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0581</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (25mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0971</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9849</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7900HT Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4351405</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Array Card Sealer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>-</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native lipoprotein particles with microrna and subsequent determination of their absolute/relative microrna content and their cellular transfer rate

Las partículas de lipoproteínas son principalmente transportadores de lípidos y colesterol en el torrente sanguíneo. Además, contienen pequeñas cantidades de hebras de microRNA no codificante (miRNA). En general, miRNA altera el perfil de expresión proteica debido a las interacciones con messenger-RNA (mRNA). Por lo tanto, el conocimiento del contenido miRNA relativo y absoluto de las partículas de lipoproteína es esencial para estimar el efecto biológico de la captación de partículas celulares. Aquí, se presenta un protocolo cuantitativo en tiempo real de la reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) para determinar el contenido absoluto de miRNA de las partículas de lipoproteínas, ejemplificado en las partículas de lipoproteínas nativas y enriquecidas con miRNA. El contenido de Mirna relativo se cuantifica utilizando tarjetas de matriz de microfluidos multiplacas. Además, este protocolo permite a los científicos estimar el miRNA celular y, por lo tanto, la tasa de captación de partículas de lipoproteínas. Un aumento significativo del nivel de miRNA celular es observable cuando se utilizan partículas de lipoproteína de alta densidad (HDL) cargadas artificialmente con miRNA, mientras que la incubación con partículas de HDL nativas no produce ningún efecto significativo debido a su contenido de miRNA bastante bajo. En cambio, la captación celular de partículas de lipoproteína de baja densidad (LDL), ni con miRNA nativa ni cargada artificialmente con ella, no alteró el nivel de miRNA celular.

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer 

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Aquí, se presenta un protocolo cuantitativo en tiempo real basado en la reacción en cadena de la polimerasa para la determinación del contenido nativo de microARN (absoluto/relativo) de las partículas de lipoproteína. Además, se demuestra un método para aumentar el nivel de microARN, así como un método para determinar la tasa de captación celular de las partículas de lipoproteínas.

Enriquecimiento de partículas de lipoproteínas nativas con microRNA y determinación posterior de su contenido absoluto/relativo de microRNA y su tasa de transferencia celular

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Las partículas de lipoproteínas son vehículos de transporte nativos. El enriquecimiento de sustancias extrañas facilita su uso como portador de vías. El etiquetado específico de moléculas o partículas enteras hace factible medir la absorción celular.Los dos métodos de enriquecimiento son rápidos y fáciles de usar, y se pueden adaptar para una amplia gama de sustancias. Demostrando el procedimiento serán Markus Axmann y Andreas Karner, dos postdoctorados de mi laboratorio. Para comenzar la delipidación en una campana de humo, mezcle de uno a dos mililitros de solución HDL preparada que contenga cinco miligramos de partículas HDL con 50 mililitros de mezcla preenfriada de tres a dos de éter dietílico de etanol en un tubo de centrifugación cónica.Incubar durante dos horas a 20 grados centígrados negativos. Centrifugar a 2500 veces g durante 10 minutos a 10 grados Celsius negativos. Deseche el sobrenadante, resuspender el pellet en 50 mililitros de mezcla de éter de etanol dietil preenfriado, y vórtice brevemente.Incubar por segunda vez durante dos horas a 20 grados centígrados negativos. Centrifugar de nuevo a 2500 veces g durante 10 minutos a 10 grados Celsius negativos. A continuación, inserte tubos que suministren el flujo de gas nitrógeno para secar el pellet.Y lo resusppend en 250 microlitros del tampón A.Determinar la concentración de proteína utilizando el ensayo de proteína Bradford u otro apropiado. Es fundamental eliminar los restos de la mezcla de éter de etanol dietil, ya que estos disolventes inhibirían la relipidación de las apolipoproteínas. A continuación, diluir a una concentración final de un miligramo de proteína por cada 250 microlitros del tampón A.Inserte un tubo que suministre gas inerte en la parte de la solución en el tubo.Si es necesario, guarde la solución durante la noche a cuatro grados centígrados bajo la atmósfera de gas inerte. Para comenzar la reconstitución, en un tubo de vidrio limpio, mezcle 100 microlitros de CO, 13,5 microlitros de C y 500 microlitros de PC. A continuación, gire el tubo de vidrio mientras se vacía el gas nitrógeno dentro del tubo para secar la mezcla con el fin de producir una capa de superficie homogénea. En un tubo de reacción de 0,5 mililitros, prepare una solución fresca de espermatozoides de 30 mililitros en el tampón A.Then mezcle 100 microlitros de microARnes sintéticos de 10 micromolares con 100 microlitros de solución de espermatozoides en un tubo de reacción de dos mililitros.Y incubar durante 30 minutos a 30 grados centígrados. A continuación, transfiera la solución incubada de 200 microlitros al tubo de vidrio para rehidratar la capa de superficie mastermix PC-CO-C preparada. Y luego añadir 50 microlitros de una solución de desoxicolato de sodio de 30 miligramos por mililitro.Revuelva a cuatro grados centígrados durante dos horas. Después de eso, agregue 250 microlitros de la solución HDL deslipidada en el tubo de vidrio. Y revuelva a cuatro grados centígrados durante la noche.Para comenzar la diálisis, primero agregue 50 gramos de perlas adsorbentes a 800 mililitros de agua doble destilada. Y usa un agitador magnético para remover durante un minuto. Espere 15 minutos hasta que las cuentas se asienten y decante el sobrenadante.Repita el procedimiento con PBS preenfriado. Cassettes de diálisis pre-húmedos en PBS. Utilice una jeringa para añadir la mezcla previamente preparada en los cassettes de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Agregue las perlas adsorbentes tratadas con PBS a tres litros de PBS, y coloque los casetes en el PBS para dializar a cuatro grados centígrados. Las perlas mantienen constante el gradiente de densidad a lo largo de la membrana de diálisis. Cambie el búfer y las cuentas después de una hora y dos horas.Después de 24 horas, con una jeringa, extraiga la solución del cassette en un tubo de reacción de 1,5 mililitros para recuperar la solución de partículas HDL reconstituida. Determinar la concentración de proteínas utilizando el ensayo Bradford. Suministre gas inerte al tubo de reacción, ciérrelo y almacene la solución de partículas HDL reconstituida bajo atmósfera de gas inerte a cuatro grados centígrados.En primer lugar, preparar una solución fresca de espermatozoides de 30 mililitros en agua libre de RNAse. Mezclar 100 microlitros de 10 micromolares de microARN sintético con 100 microlitros de solución de espermatozoides en un tubo de reacción de dos mililitros. Y incubar durante 30 minutos a 30 grados centígrados.A continuación, añada 100 microlitros de DMSO y 1,2 mililitros de tampón 1X LDL a la solución de espermatozoides de microARN preparada. Diluir la solución de partículas LDL previamente preparada con PBS a una concentración final de aproximadamente cuatro miligramos por mililitro. A continuación, dibuje 450 microlitros de la solución diluida en un tubo de reacción de 1,5 mililitros y mezcle con 50 microlitros de tampón 10X LDL.Incubarlo durante 10 minutos sobre hielo. Después de la incubación, combine la solución de partículas LDL de 500 microlitros y la solución de microRNA-espermato-espermicida-DMSO de 1,5 mililitros, e i incuba durante dos horas a 40 grados centígrados. Realice diálisis de forma similar a la descrita anteriormente y almacene la solución de partículas LDL etiquetada bajo atmósfera de gas inerte a cuatro grados centígrados.Para comenzar, diluya la solución de partículas HDL o LDL en PBS entre uno a 100 y uno a 1.000. Corte la mica presionando la cinta adhesiva contra el sustrato de mica, y tirando de la cinta para quitar las capas superiores de mica. Utilice una pipeta para depositar dos microlitros en mica recién cortada para incubar durante cinco minutos.Las partículas de lipoproteínas tienden a formar membranas de unión continuas en las superficies. Por lo tanto, es importante ajustar la concentración de partículas en la superficie de la mica para obtener las individuales. Después de la incubación, enjuague la muestra con PBS.Llene la célula líquida AFM de alta velocidad con PBS y monte el escáner portador de mica en la etapa AFM de alta velocidad. En el software de control, inicie el proceso de aproximación del voladizo a la superficie de la mica. Utilice tamaños de escaneado inferiores a un micrómetro cuadrado y mantenga las fuerzas de imagen lo más bajas posible.Imagen de la muestra en modo de toque. Cargue los datos en el Gwyddion y detecte las partículas a través de los granos de marca por función de umbral. Ajuste el valor del umbral de altura para enmascarar las partículas individuales.Por lo general, un nivel alrededor del 50% es un buen punto de partida. Elimine el fondo polinómico para aplanar la imagen y active la opción Excluir región enmascarada. Exporte los valores de altura máxima de las partículas detectadas utilizando la distribución de varias características de grano y repita estos pasos para todas las imágenes grabadas.En este experimento, la reconstitución de partículas HDL se realizó a través de la delipidación de partículas HDL, seguida de relipidación y diálisis. Se puede lograr un rendimiento del 50% de las partículas DE HDL reconstituidos. Sin embargo, el mismo etiquetado con microARN no era factible para el etiquetado de partículas LDL, debido a la hidrofobicidad de la proteína Apolipoproteína B100.Por lo tanto, DMSO se utilizó para la penetración de la monocapa lipídica de las partículas LDL, con un rendimiento cercano al 100%Durante el control de calidad, la dilución es crítica para el análisis. La imagen superior muestra una densidad de partículas demasiado alta. La imagen inferior es adecuada para el análisis.Las funciones de densidad de probabilidad de las alturas de las partículas se calcularon para comparar las distribuciones de tamaño de las partículas de lipoproteínas de control nativas, etiquetadas y etiquetadas. El cambio relativo antes y después del procedimiento de etiquetado es descuidado. Cuando manipule oligonucleótidos de ARN, trabaje sin RNAse.Use consumibles de plástico desechables frescos y use siempre guantes. Utilice únicamente soluciones libres de nucleasas. AFM de alta velocidad es sólo un método para determinar la forma general de las lipoproteínas.Un método alternativo sería la microscopía electrónica. Use un equipo de protección personal adecuado y trabaje en una campana de humos mientras manipula el éter dietílico.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

Un método eficaz para la síntesis de peptoides con monómeros de tipo mixto lisina / arginina del tipo y la evaluación de su actividad anti-Leishmania

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

Investigación

Bioquímica

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Síntesis de 1,2-Azaborines y la preparación de sus complejos de proteínas con lisozima T4 Mutantes

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

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Aislamiento de partículas de lipoproteínas de yema de huevo de pollo para el estudio de la incorporación de ácidos grasos patógenos bacterianos en fosfolípidos de membrana

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...