Name: enrichment of native lipoprotein particles with microrna and subsequent determination of their absolute/relative microrna content and their cellular transfer rate
Uploaded: 2019-05-09T15:00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer

Detta arbete stöddes av den österrikiska vetenskaps fonden projektet P29110-B21, "Hochschuljubiläumsstiftung der Stadt Wien zur Förderung der wissenschaft" projekt H-3065/2011, Europeiska fonden för regional utveckling (EFRE, IWB2020), den federala delstaten övre Österrike, och "land OÖ Basisfinanzierung".

<ol>
	<li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins.">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 423-435 (2011).</li><li>Tabet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-transferred+microRNA-223+regulates+ICAM-1+expression+in+endothelial+cells.">HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Wahid, F., Shehzad, A., Khan, T., Kim, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Synthesis,+mechanism,+function,+and+recent+clinical+trials.">MicroRNAs: Synthesis, mechanism, function, and recent clinical trials.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1803 (11), 1231-1243 (2010).</li><li>Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+Mechanisms+of+miRNAs+and+siRNAs.">Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs.</a> Cell. 136 (4), 642-655 (2009).</li><li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+Translation+and+Stability+by+microRNAs.">Regulation of mRNA Translation and Stability by microRNAs.</a> Annual Review of Biochemistry. 79 (1), 351-379 (2010).</li><li>Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+post-transcriptional+regulation+by+microRNAs:+Are+the+answers+in+sight?.">Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: Are the answers in sight?.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).</li><li>Jonas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+High-Density+Lipoproteins.">Reconstitution of High-Density Lipoproteins.</a> Methods in Enzymology. , 553-582 (1986).</li><li>Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+AFM+and+Applications+to+Biomolecular+Systems.">High-Speed AFM and Applications to Biomolecular Systems.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 393-414 (2013).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments.">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Patsch, J. R., Patsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonal+ultracentrifugation.">Zonal ultracentrifugation.</a> Methods in Enzymology. 129 (1966), 3-26 (1986).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Yamamoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Techniques+for+Observing+Dynamic+Biomolecular+Processes.">High-Speed Atomic Force Microscopy Techniques for Observing Dynamic Biomolecular Processes.</a> Methods in Enzymology. 475, 541-564 (2010).</li><li>Stangl, H., Cao, G., Wyne, K. L., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+receptor,+class+B,+type+I-dependent+stimulation+of+cholesterol+esterification+by+high+density+lipoproteins,+low+density+lipoproteins,+and+nonlipoprotein+cholesterol.">Scavenger receptor, class B, type I-dependent stimulation of cholesterol esterification by high density lipoproteins, low density lipoproteins, and nonlipoprotein cholesterol.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (47), 31002-31008 (1998).</li><li>Hochberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+a+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: a Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. 57 (1), 289-300 (1995).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization.">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biology. 10 (6), (2009).</li><li>Schumaker, V. N., Puppione, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=6]+Sequential+Flotation+Ultracentrifugation.">6] Sequential Flotation Ultracentrifugation.</a> Methods in Enzymology. 128 (C), 155-170 (1986).</li><li>Wagner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+levels+and+cellular+transfer+of+circulating+lipoprotein-bound+microRNAs.">Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1392-1400 (2013).</li><li>Meier, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+chronic+kidney+disease+on+macrophage+cholesterol+efflux.">Effect of chronic kidney disease on macrophage cholesterol efflux.</a> Life Sciences. 136, 1-6 (2015).</li><li>Axmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+and+Lipoprotein+Particle+miRNA+Profile+in+Uremia+Patients.">Serum and Lipoprotein Particle miRNA Profile in Uremia Patients.</a> Genes. 9 (11), 533 (2018).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Här beskrivs isoleringen av lipoproteinpartikelfraktioner från humant blod och bestämningen av deras individuella miRNA-innehåll steg för steg. Det är viktigt att arbeta i en RNase-fri miljö samtidigt hantera isolerade och syntetiserade miRNA-partikel-Embedded miRNA är uppenbarligen skyddad från enzymatisk nedbrytning. Eftersom miRNA/partikel förhållandet mellan infödda lipoproteinpartiklar är ganska låg, konstgjord berikning med miRNA krävs för att studera Holo partikel upptag av celler. Därmed, rekonstituering av HDL-partiklar som beskrivits tidigare7 modifieras för att införliva Mirna strängar. Dessutom, separation av lipid och protein fraktion under detta förfarande gör det möjligt för forskare att undersöka lipid-och proteinassocierade komponenter i lipoproteinpartikel19. På liknande sätt är märknings förfarandet för LDL-partiklar anpassat. Intressant, tillsatsen av spermine-en naturlig stabilisator av nukleotider-påverkade inte miRNA/partikel förhållandet. Det bör noteras att metoden i princip gör det möjligt att lägga till andra ämnen än miRNA inom en lipoproteinpartikel. Naturligtvis finns det en gräns när det gäller den fysiska storleken på ämnet baserat på den totala storleken på HDL (diameter: 5-12 nm) och LDL-partiklar (diameter: 18-25 nm).
När det gäller kvalitets kontroll av rekonstituerade/märkta lipoproteinpartiklar, HS-AFM är en tillämplig metod för att karakterisera HDL/LDL-partiklar på den enda partikel nivå. I jämförelse med EM, det möjliggör kortare förberedelse tider och nästan fysiologiska förhållanden (våt, rums temperatur).
Tack vare sin inneboende känslighet och amplifiering är qPCR den metod som används för att detektera låga miRNA-koncentrationer. Alternativt, enkelmolekylen känslig fluorescensmikroskopi, som kan detektera även enskilda molekyler, skulle inte vara lämplig på grund av de låga koncentrationerna av, till exempel, fluorescensmarkerade märkt Mirna strängar per partikel. Sålunda, förhållandet mellan miRNA trådar per Native lipoprotein partikel har visat sig vara 10-8. Konstgjord berikning ökar förhållandet med en faktor på 10 000, vilket underlättar uppskattningen av cellulär lipoproteinupptagningsförmåga (ingen signifikant skillnad detekteras med hjälp av infödda lipoproteinpartiklar 19). Den höga känsligheten hos qPCR gör det möjligt att bestämma denna upptagnings hastighet genom att mäta antalet miRNA-strängar efter inkubations tiden och förhållandet mellan miRNA och partikel. Det bör noteras att det beräknade värdet ignorerar cellulär nedbrytning och frisättning av miRNA och därmed utgör åtminstone en lägre gräns för lipoproteinpartikelupptagningsförhållandet.
I framtiden, metoden kan anpassas för att överföra farmaceutiska substanser (särskilt också lipofila sådana) i celler och korrelera deras biologiska effekt till den intracellulära koncentrationen (bestäms via upptag hastighet av lipoproteinpartiklar).

Lipoproteinpartiklar består av en enskiktslager av amfifila molekylers lipider och kolesterol innesluter en kärna av kolesterylestrar estrar och triglycerid fetter. Hela partikeln stabiliseras av membraninbäddade apolipoproteiner, som definierar partikelns biologiska funktionalitet. Lipoproteinpartiklar kan särskiljas beroende på deras respektive ökande densitet och därmed minskande storlek, nämligen som mycket-low-density lipoprotein (VLDL), mellanliggande densitet lipoprotein (IDL), LDL, och HDL-partiklar. Trots transporten av vatten olösliga komponenter i blod omloppet, det har visats att HDL-partiklar bär kodande strängar av Mirna1,2. Mikro-rnas är en klass av korta (vanligt vis två dussin nukleotider) RNA-strängar, som försämrar intracellulärt kompletterande mRNA strängar och därmed ändra uttrycks profilen för vissa proteiner3,4,5, och 6. Vidare har förändringar av miRNA-profilen hittats i en mängd olika sjukdomar och därför är profilen tillämplig som bio markör för diagnos och prognos. Den extracellulära transporten av miRNAs mellan celler via lipoproteinpartiklar kan fungera som en extra mekanism för intercellulär mRNA-nivåmodulering. För att kvantitativt uppskatta den biologiska effekten behövs kunskap om det absoluta och relativa miRNA-innehållet i lipoproteinpartiklar.
Kvantitativ realtids-PCR är en lämplig och relativt snabb metod för att få denna information. Därför kan värdet för relativ kvantifiering (RQ) beräknas, och relativa skillnader mellan olika prover och lipoproteinfraktioner är uppskattnings bara. Multiwell mikroflödessystem array kort är en snabb och enkel att använda metod för att bestämma den relativa närvaron (motsvarar RQ värde) av mirnas i ett prov. Multiwell mikroflödessystem array kort består av 96 eller 384 individuella reaktionskammare för enskilda QPCR reaktioner inbäddade i en mikroflödessystem enhet. Varje kammare innehåller den erforderliga hydrolyssonden och specifika qPCR-primers för en individuell miRNA. Fördelarna är en kort hanterings tid på grund av standardisering, ett enkelt arbets flöde och ett minskat antal pipetteringsteg. Dessutom minimeras den nödvändiga prov volymen. I motsats till den relativa kvantifieringen kräver det absoluta miRNA-innehållet en jämförelse av resultaten av qPCR-provet med standard kurvor av det kända absoluta antalet miRNA-strängar. Det bör noteras att, på grund av deras relativt låga miRNA innehåll, standard och dessutom även Single-molekylen känsliga Imaging tekniker inte är genomförbara-den artificiella berikningen av lipoproteinpartiklar med miRNA är oundvikligt att studera cellulära lipoproteinpartikelinteraktion och miRNA-överföring. När det gäller detta, delipidation av HDL-partikel följt med efterföljande relipidation7 tillåter införlivande av och, därmed, berikning med Mirna strängar. Liknande berikning av LDL-partiklar med miRNA är inte genomförbart på grund av hydrofobicity av apoB-100 protein, som är den viktigaste bestånds delen i LDL-partikeln. Men genom tillsats av Polar lösnings medel dimetylsulfoxid (DMSO), som kan penetrera Lipidmembran, kan LDL-partiklar vara artificiellt laddad med miRNA strängar också.
Hög hastighet atomär mikroskopi (HS-AFM) är ett kraftfullt verktyg för karakterisering av biologiska prover som erbjuder subnanometer rumsliga och subsecond temporal resolution8. Därför är det en väl lämpad teknik för kvalitets kontroll av modifierade lipoproteinpartiklar som infödda/rekonstituerade/märkta lipoproteinpartiklar kan avbildas under en nästan fysiologisk miljö.
Här presenteras ett qPCR-baserat protokoll steg-för-steg för att bestämma det absoluta/relativa miRNA-innehållet i lipoproteinpartiklar och cellprover, vilket möjliggör en uppskattning av den cellulära lipoproteinpartikelupptagshastigheten. Dessutom demonstreras en metod för berikning av lipoproteinpartiklar med miRNA. Denna metod kan anpassas för allmän manipulation av lipoproteinhalten och, därmed, visar tillämpligheten av lipoproteinpartiklar som mål för läkemedels leverans.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>TI 55.2</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer (EDTA)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366643</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaliumbromid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2110</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342414</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube sealer</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342428</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P029.2</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D/0650/50</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubes, MWCO 12 - 14k</td>
			<td>Spectra</td>
			<td>132700</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synthetic miRNA</td>
			<td>microSynth</td>
			<td>-</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 7</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 8</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile tubes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>ENE8.1</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf Biophotometer</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>XK20</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G-250 Stain</td>
			<td>BioRad GmbH</td>
			<td>161-0786</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3957.1</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>AustrAlco</td>
			<td>Ethanol Absolut 99.9%</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3942.1</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Multifuge X3R</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3313.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4627.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>P3556-25mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol oleate</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>C-9253-250mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>C8667-500mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass tubes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>K226.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spermine</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>S3256-1G</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>3097-25G</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>0955.2</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#181;L micropipettes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>A762.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9143.2</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amberlite XAD-2 beads</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>10357</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer casette (cut-off 20 kDa)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66003</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>465 76 83</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3054.2</td>
			<td>Labeling of LDL particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Labeling of LDL particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope</td>
			<td>RIBM</td>
			<td>SS-NEX</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscovite Mica (V-1 Grade)</td>
			<td>Christine Gr&#246;pl</td>
			<td>G250-1/V1</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Cantilever</td>
			<td>Nanoworld</td>
			<td>USC-F1.2-k0.15</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gwyddion 2.49</td>
			<td>Czech Metrology Institute</td>
			<td>http://gwyddion.net</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slides, Nunc Lab-Tek</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9117.1</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Omni Life Science GmbH</td>
			<td>Casy</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>217004</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Sterican 465 75 19</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309050</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cabinet</td>
			<td>Esco</td>
			<td>PCR-3A1</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4366596</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free water</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T143</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 ml tubes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781305</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>Microcentrifuge AL</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Sensoquest</td>
			<td>Labcycler</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Primer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal probe supermix</td>
			<td>BioRad GmbH</td>
			<td>1725131</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Corbett</td>
			<td>Rotor-Gene RG-6000</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366596</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4399966</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4391128</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4399933</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal Master Mix II, no UNG</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4440040</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA Human A Cards</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A31805</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0581</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (25mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0971</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9849</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7900HT Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4351405</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Array Card Sealer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>-</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native lipoprotein particles with microrna and subsequent determination of their absolute/relative microrna content and their cellular transfer rate

Lipoproteinpartiklar är huvudsakligen transportörer av lipider och kolesterol i blodet. Dessutom innehåller de små mängder av strängar av kodande mikroRNA (Mirna). I allmänhet förändrar miRNA protein uttrycks profilen på grund av interaktioner med Messenger-RNA (mRNA). Således är kunskapen om det relativa och absoluta miRNA-innehållet i lipoproteinpartiklar avgörande för att uppskatta den biologiska effekten av cellernas partikel upptag. Här, en kvantitativ real tid polymeras kedje reaktion (QPCR)-baserat protokoll presenteras för att bestämma den absoluta Mirna innehållet av lipoproteinpartiklar-exemplifieras visas för infödda och Mirna-berikad lipoprotein partiklar. Det relativa Mirna-innehållet kvantifieras med multispot mikroflödessystem array-kort. Dessutom, detta protokoll gör det möjligt för forskare att uppskatta cellulära miRNA och därmed lipoprotein partikel upptagshastigheten. En signifikant ökning av cellulär miRNA nivå är observerbar när du använder High-density lipoprotein (HDL) partiklar artificiellt laddad med miRNA, medan inkubation med inhemska HDL-partiklar ger ingen signifikant effekt på grund av deras ganska låga miRNA innehåll. I kontrast, det cellulära upptaget av low-density lipoprotein (LDL) partiklar-varken med infödda miRNA eller artificiellt laddad med det-inte ändra cellulär miRNA nivå.

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer 

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Här, ett kvantitativt i real tid polymeras kedje reaktion-baserat protokoll presenteras för bestämning av den infödda Micro-RNA innehåll (absoluta/relativa) av lipoproteinpartiklar. Dessutom, en metod för att öka mikro-RNA-nivån, samt en metod för att bestämma den cellulära upptagshastigheten av lipoproteinpartiklar, visas.

Anrikning av Native Lipoproteinpartiklar med mikroRNA och efterföljande bestämning av deras absoluta/relativa mikroRNA innehåll och deras cellulära överföringshastigheten

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Lipoproteinpartiklar är inhemska transportfordon. Anrikningen av främmande ämnen underlättar deras användning som bandbärare. Specifik märkning av molekyler eller hela partiklar gör det möjligt att mäta cellupptaget.De två metoderna för berikning är snabba och enkla att använda, och kan anpassas för ett brett spektrum av ämnen. Demonstrerar proceduren blir Markus Axmann och Andreas Karner, två postdoktorer från mitt labb. För att börja delipidation i en fume huva, blanda en till två milliliter av beredd HDL-lösning som innehåller fem milligram HDL partiklar med 50 milliliter av pre-kylda tre till två blandning av etanolsydyleter i en konisk centrifugeringsrör.Inkubera i två timmar vid negativt 20 grader Celsius. Centrifugera vid 2500 gånger g i 10 minuter vid negativ 10 grader Celsius. Kassera supernatant, resuspend pelleten i 50 milliliter av pre-kyld etanoldietyleter blandning, och virvel kort.Inkubera en andra gång i två timmar vid negativa 20 grader Celsius. Centrifugera igen vid 2500 gånger g i 10 minuter vid negativ 10 grader Celsius. Sätt sedan in slangar som försörjer gasflödet av kväveoxid för att torka pelleten.Och resuspend det i 250 mikroliter av buffert A.Beställ proteinkoncentrationen med hjälp av Bradford protein analysen eller en annan lämplig en. Det är viktigt att ta bort eventuella rester av etanolsytyleterblandningen, eftersom dessa lösningsmedel skulle hämma relipidationen av apolipoproteiner. Därefter späd till en slutlig koncentration av ett milligram protein per 250 mikroliter av buffert A.Insert ett rör som levererar inert gas i lösningsdelen i röret.Om det behövs, lagra lösningen över natten vid fyra grader Celsius under inert gas atmosfär. För att börja rekonstitution, i ett rent glasrör, blanda 100 mikroliter av CO, 13,5 mikroliter av C, och 500 mikroliter av PC. Rotera sedan glasröret medan spolning kvävegas inuti röret för att torka blandningen för att ge en homogen ytskikt. I ett 0,5-milliliter reaktionsrör, preparera en färsk 30-millimolär sperminlösning i buffert A.Blanda sedan 100 mikroliter 10-mikromolor syntetiskt mikroRNA med 100 mikroliter sperminlösning i ett två milliliter reaktionsrör.Och inkubera i 30 minuter vid 30 grader Celsius. Därefter överför du den inkuberade 200-mikroliterlösningen i glasröret för att rehydrera det förberedda PC-CO-C mastermix-ytskiktet. Och sedan lägga till 50 mikroliter av en 30 milligram per milliliter natrium deoxicholat lösning.Rör om vid fyra grader Celsius i två timmar. Därefter lägger du till 250 mikroliter av den delipiderade HDL-lösningen i glasröret. Och rör om vid fyra grader Celsius över natten.För att börja dialys, först tillsätt 50 gram adsorbent pärlor till 800 milliliter dubbeldestillerat vatten. Och använd en magnetisk omrörare för att röra om i en minut. Vänta i 15 minuter så att pärlorna kan sätta sig, och dekantera supernatanten.Upprepa proceduren med färdigkyld PBS. Förvåt dialyskassetter i PBS. Använd en spruta för att lägga till den tidigare beredda blandningen i kassetterna enligt tillverkarens anvisningar.Lägg till PBS-behandlade adsorbent pärlor till tre liter PBS, och placera kassetterna i PBS att dialyze vid fyra grader Celsius. Pärlorna håller densitetsgradienten längs dialysmembranet konstant. Ändra buffert och pärlorna efter en timme och två timmar.Efter 24 timmar, med en spruta, extrahera lösningen från kassetten i en 1,5-milliliter reaktionsrör för att återvinna den rekonstituerade HDL partikellösning. Bestäm proteinkoncentrationen med hjälp av Bradford-analysen. Leverera inert gas till reaktionsröret, försegla den och lagra den rekonstituerade HDL-partikellösningen under inert gasatmosfär vid fyra grader Celsius.Förbered först en färsk 30-millimolär sperminlösning i RNAsfritt vatten. Blanda 100 mikroliter av 10 mikromolar av syntetiskt mikroRNA med 100 mikroliter av sperminlösning i ett reaktionsrör på två milliliter. Och inkubera i 30 minuter vid 30 grader Celsius.Tillsätt sedan 100 mikroliter av DMSO och 1,2 milliliter 1X LDL-buffert till den beredda mikroRNA-sperminlösningen. Späd tidigare beredd LDL partikellösning med PBS till en slutkoncentration på cirka fyra milligram per milliliter. Dra sedan 450 mikroliter av den utspädda lösningen till ett 1,5-milliliter reaktionsrör, och blanda med 50 mikroliter av 10X LDL-buffert.Inkubera den i 10 minuter på is. Efter inkubation, kombinera 500-mikroliter LDL partikellösning och 1,5-milliliter microRNA-spermine-DMSO lösning, och inkubera den i två timmar vid 40 grader Celsius. Utför dialys liknande som tidigare beskrivits, och lagra den märkta LDL partikellösningen under inert gasatmosfär vid fyra grader Celsius.Till att börja späda ut HDL- eller LDL-partikellösningen i PBS mellan en till 100 och en till 1, 000. Cleave glimmer genom att trycka fasthäftande tejp mot glimmersubstratet, och dra av tejpen för att ta bort de övre glimmerlagren. Använd en pipett för att sätta in två mikroliter på nyklyvade glimmer för att inkubera i fem minuter.Lipoproteinpartiklar tenderar att bilda kontinuerliga bondmembran på ytor. Följaktligen är det viktigt att justera partikelkoncentrationen på glimmerytan för att få enskilda. Skölj provet med PBS efter inkubationen.Fyll den snabba AFM-vätskecellen med PBS, och montera den glimmerbärande skannern till den snabba AFM-scenen. I styrprogramvaran startar du tillvägagångssättsprocessen för fribärandet till glimmerytan. Använd skanningsstorlekar mindre än en kvadratisk mikrometer, och håll bildkrafterna så låga som möjligt.Avbilda provet i knackningsläge. Ladda data i Gwyddion, och detektera partiklarna via markeringskornen efter tröskelfunktion. Justera höjdtröskelvärdet för att maskera de enskilda partiklarna.Vanligtvis är en nivå runt 50%en bra utgångspunkt. Ta bort polynombakgrund för att platta till bilden, och aktivera alternativet exkluderad maskerad region. Exportera de högsta höjdvärdena för de upptäckta partiklarna med hjälp av fördelningen av olika kornegenskaper funktion, och upprepa dessa steg för alla inspelade bilder.I detta experiment utfördes reconstitution av HDL partiklar genom delipidation av HDL partiklar, följt av relipidation och dialys. En avkastning på 50% av rekonstituerade HDL partiklar kan uppnås. Samma märkning med mikroRNA var dock inte genomförbart för märkning av LDL-partiklar, på grund av hydrophobicity av apolipoprotein B100 protein.Således användes DMSO för penetration av lipidmonomlagaren av LDL-partiklarna, med en avkastning nära 100%Under kvalitetskontroll är utspädningen kritisk för analys. Den översta bilden visar en för hög partikeldensitet. Den nedre bilden är lämplig för analys.Sannolikhet densitet funktioner av partikel höjder beräknades för jämförelse av storlek distributioner av den infödda, märkt och märkt kontroll lipoprotein partiklar. Den relativa ändringen före och efter märkningsproceduren är vanvårdsbar. Vid hantering av RNA oligonukleotider, arbeta RNAse-fritt.Använd färska engångsplast förbrukningsvaror, och alltid bära handskar. Använd endast nukleasfria lösningar. Höghastighets-AFM är bara en metod för att bestämma den allmänna formen av lipoproteiner.En alternativ metod skulle vara elektronmikroskopi. Använd lämplig personlig skyddsutrustning, och arbeta i en rökhuva medan du hanterar thyleter.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

En effektiv metod för syntes av Peptoider med blandad lysin-typ / Arginin-monomerer och utvärdering av deras anti-leishmanial aktivitet

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Syntes av 1,2-Azaborines och utarbetandet av deras proteinkomplex med T4 Lysozyme mutanter

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestämning av glykogeninnehållet i cyanobakterier

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Mycket känslig och kvantitativa påvisande av proteiner och deras isoformer av kapillär isoelektrisk fokusering metod

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Bildandet av kovalent DNA addukter av enzymatiskt aktiverade carcinogener och droger In Vitro och deras beslutsamhet av 32P-postlabeling

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteomiska analys av sammanhangsberoende proteinkomplex i deras infödda cellulära miljön

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spektrofotometrisk bestämning av Phycobiliprotein innehåll i Cyanobakterien Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering av fysiologiskt aktiva Thylakoids och deras användning i energi-beroende Protein Transport analyser

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Hybrid Clear/blå Native Electrophoresis för separation och analys av mitokondriella respiratoriska kedjan Superkomplex

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolering av Lipoproteinpartiklar från kyckling äggula för studiet av bakteriell patogen fettsyra inkorporering i Membranfosfolipider

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...