Name: enrichment of native lipoprotein particles with microrna and subsequent determination of their absolute/relative microrna content and their cellular transfer rate
Uploaded: 2019-05-09T15:00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer

Bu çalışma Avusturya Bilim Fonu Projesi P29110-B21, "Hochschuljubiläumsstiftung der Stadt Wien Zur Förderung der Wissenschaft" projesi H-3065/2011, Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (EFRE, IWB2020), üst federal devlet tarafından destekleniyordu. Avusturya ve "Land OÖ Basisfinanzierung".

<ol>
	<li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins.">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 423-435 (2011).</li><li>Tabet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-transferred+microRNA-223+regulates+ICAM-1+expression+in+endothelial+cells.">HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li><li>Wahid, F., Shehzad, A., Khan, T., Kim, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+Synthesis,+mechanism,+function,+and+recent+clinical+trials.">MicroRNAs: Synthesis, mechanism, function, and recent clinical trials.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1803 (11), 1231-1243 (2010).</li><li>Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+Mechanisms+of+miRNAs+and+siRNAs.">Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs.</a> Cell. 136 (4), 642-655 (2009).</li><li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+Translation+and+Stability+by+microRNAs.">Regulation of mRNA Translation and Stability by microRNAs.</a> Annual Review of Biochemistry. 79 (1), 351-379 (2010).</li><li>Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+post-transcriptional+regulation+by+microRNAs:+Are+the+answers+in+sight?.">Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: Are the answers in sight?.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).</li><li>Jonas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+High-Density+Lipoproteins.">Reconstitution of High-Density Lipoproteins.</a> Methods in Enzymology. , 553-582 (1986).</li><li>Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+AFM+and+Applications+to+Biomolecular+Systems.">High-Speed AFM and Applications to Biomolecular Systems.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 393-414 (2013).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments.">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Patsch, J. R., Patsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonal+ultracentrifugation.">Zonal ultracentrifugation.</a> Methods in Enzymology. 129 (1966), 3-26 (1986).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Yamamoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Techniques+for+Observing+Dynamic+Biomolecular+Processes.">High-Speed Atomic Force Microscopy Techniques for Observing Dynamic Biomolecular Processes.</a> Methods in Enzymology. 475, 541-564 (2010).</li><li>Stangl, H., Cao, G., Wyne, K. L., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+receptor,+class+B,+type+I-dependent+stimulation+of+cholesterol+esterification+by+high+density+lipoproteins,+low+density+lipoproteins,+and+nonlipoprotein+cholesterol.">Scavenger receptor, class B, type I-dependent stimulation of cholesterol esterification by high density lipoproteins, low density lipoproteins, and nonlipoprotein cholesterol.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (47), 31002-31008 (1998).</li><li>Hochberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+False+Discovery+Rate:+a+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing.">Controlling the False Discovery Rate: a Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. 57 (1), 289-300 (1995).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization.">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biology. 10 (6), (2009).</li><li>Schumaker, V. N., Puppione, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=6]+Sequential+Flotation+Ultracentrifugation.">6] Sequential Flotation Ultracentrifugation.</a> Methods in Enzymology. 128 (C), 155-170 (1986).</li><li>Wagner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+levels+and+cellular+transfer+of+circulating+lipoprotein-bound+microRNAs.">Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1392-1400 (2013).</li><li>Meier, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+chronic+kidney+disease+on+macrophage+cholesterol+efflux.">Effect of chronic kidney disease on macrophage cholesterol efflux.</a> Life Sciences. 136, 1-6 (2015).</li><li>Axmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+and+Lipoprotein+Particle+miRNA+Profile+in+Uremia+Patients.">Serum and Lipoprotein Particle miRNA Profile in Uremia Patients.</a> Genes. 9 (11), 533 (2018).</li></ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Burada, lipoprotein parçacık fraksiyonları insan kanı ve kendi bireysel miRNA içeriğinin belirlenmesi yalıtım adım-adım açıklanmıştır. Yalıtılmış ve sentezlenmiş miRNA işleme sırasında bir RNase-Free ortamda çalışmak için önemlidir-parçacık gömülü miRNA belli ki enzimatik bozulması korunaklı. Yerli lipoprotein parçacıklarının miRNA/parçacık oranı oldukça düşüktür, miRNA ile yapay zenginleştirme hücrelerin Holo parçacık alımı incelemek için gereklidir. Böylece, daha önce açıklandığı gibi HDL partiküllerinin yeniden oluşturulması7 Mirna iplerini birleştirmek için değiştirilir. Ayrıca, bu prosedür sırasında lipid ve protein fraksiyonu ayrılması bilim adamlarının lipoprotein parçacık19lipid ve protein ilişkili bileşenlerini incelemek için izin verir. Benzer şekilde, LDL parçacıklarının etiketleme prosedürü adapte edilir. İlginçtir, spermine ilavesi-nükleotidler doğal bir stabilizatörü-miRNA/parçacık oranını etkilemez. Bu, prensip olarak, yöntem bir lipoprotein parçacık içinde miRNA daha diğer maddelerin infolding sağlar unutulmamalıdır. Tabii ki, HDL genel boyutuna göre maddenin fiziksel boyutu ile ilgili bir sınır vardır (çap: 5-12 NM) ve LDL parçacıklar (çap: 18-25 Nm).
Reconstituted/etiketli lipoprotein parçacıklarının kalite kontrolü ile ilgili olarak HS-AFM, tek parçacık seviyesinde HDL/LDL parçacıklarını karakterize etmek için uygulanabilir bir yöntemdir. EM ile karşılaştırıldığında, daha kısa hazırlık süreleri ve yakın fizyolojik koşullar (ıslak, oda sıcaklığı) sağlar.
Doğal duyarlılığı ve amplifikasyonu nedeniyle qPCR, düşük miRNA konsantrasyonlarını algılamak için tercih edilen yöntemdir. Alternatif olarak, tek molekül duyarlı Floresan Mikroskobu, hatta bireysel molekülleri algılamak mümkün, düşük konsantrasyonları nedeniyle uygun olmayacaktır, örneğin, Parçacık başına floresan etiketli miRNA ipleri. Böylece, yerli lipoprotein parçacığın başına miRNA iplerin oranı 10-8olarak bulunmuştur. Yapay zenginleştirme, hücresel lipoprotein alımını oranının (doğal lipoprotein parçacıkları 19kullanılarak algılanmayan) tahmin edilmesini kolaylaştıran 10.000 faktörüyle oranı artar. QPCR 'nin yüksek duyarlılığı, kuluçka süresi ve miRNA/parçacık oranı sonrasında miRNA iplerin sayısını ölçerek bu alımı hızını belirlemenize olanak sağlar. Hesaplanan değerin hücresel bozulması ve Mirna 'nın serbest bırakılması yok sayar ve bu nedenle, lipoprotein parçacık alımını oranı için en az bir alt sınırı temsil ettiği belirtilmelidir.
Gelecekte, yöntem hücrelerde ilaç maddeleri (özellikle de lipophilik olanlar) aktarmak için adapte edilebilir ve hücre içi konsantrasyon (lipoprotein parçacıkları alımını oranı ile belirlenir) biyolojik etkisini ilişkilendirir.

Lipoprotein parçacıkları, kolesteril esterleri ve trigliserid yağların bir çekirdeğini kapsayan, amphiphilik lipidler ve kolesterol bir tek tabakalı oluşur. Tüm parçacık, parçacık biyolojik işlevselliğini tanımlayan membran gömülü Apolipoproteinler tarafından stabilize edilir. Lipoprotein parçacıklar kendi artan yoğunluğa göre ayırt edilebilir ve böylece, azalan boyutu, yani çok-düşük yoğunluklu lipoprotein (VLDL), orta yoğunluklu lipoprotein (IDL), LDL, ve HDL parçacıkları. Kan dolaşımında su çözünmez bileşenlerin taşınması rağmen, bu HDL parçacıkları Mirna1,2kodlama olmayan ipler taşımak göstermiştir. Mikro-Rnas kısa bir sınıf (genellikle iki düzine nükleotis) RNA ipleri, hangi hücre dışı tamamlayıcı mRNA iplerini düşür ve böylece, belirli proteinler ifade profilini değiştirmek3,4,5, 6' ya kadar. Ayrıca, miRNA profilinin değişimleri çeşitli hastalıklarda bulunmuştur ve böylece profil tanı ve prognoz için bir biyomarker olarak uygulanabilir. MiRNAs 'ın lipoprotein parçacıkları aracılığıyla hücreler arasında harici olarak taşınması, hücre içi mRNA seviye modülasyonu için ek bir mekanizma olarak hizmet verebilir. Biyolojik etkiyi niceciksel olarak tahmin etmek için lipoprotein parçacıklarının mutlak ve göreceli miRNA içeriğine ilişkin bilgi gereklidir.
Nicel gerçek zamanlı PCR bu bilgileri elde etmek için uygun ve nispeten hızlı bir yöntemdir. Bu nedenle, göreli kantifikasyon (RQ) değeri hesaplanabilir ve farklı örnekler ile lipoprotein fraksiyonları arasındaki göreceli farklar tahmin edilebilir. Multiwell mikrofluidik dizi kartları, bir örnekteki miRNAs 'ın göreli varlığını (RQ değerine eşittir) belirlemek için hızlı ve kolay kullanımlı bir yöntemdir. Multiwell mikrofluidik dizi kartları mikrofluidik bir cihaza gömülü bireysel qPCR reaksiyonlar için 96 veya 384 bireysel reaksiyon odaları oluşur. Her oda, tek bir miRNA için gerekli hidroliz prob ve belirli qPCR astar içerir. Avantajlar, standardizasyon, basit bir iş akışı ve daha az sayıda pipetleme adımından dolayı kısa bir kullanım zamanıdır. Dahası, gerekli numune hacmi minimize edilir. Göreli quantification aksine, mutlak miRNA içeriği miRNA iplerin bilinen mutlak sayılar standart eğrileri ile qPCR örnek sonuçları bir karşılaştırma gerektirir. Bu unutulmamalıdır ki, nispeten düşük miRNA içeriği nedeniyle, standart ve, dahası, hatta tek molekül duyarlı görüntüleme teknikleri mümkün değildir-miRNA ile lipoprotein partiküllerinin yapay zenginleştirme hücresel çalışma kaçınılmaz lipoprotein parçacık etkileşimi ve miRNA transferi. Bununla ilgili olarak, HDL parçacığın delipidation sonraki relipidation7 ile birleştirilmesi ve böylece, Mirna ipleri ile zenginleştirme sağlar izledi. MiRNA ile LDL partiküllerinin benzerliği, LDL parçacıklarının ana bileşeni olan apoB-100 proteinin hidrofobiği nedeniyle uygulanabilir değildir. Ancak, lipid membranlarına nüfuz eden Polar solvent dimetil sülfoxid (DMSO) ek olarak, LDL parçacıkları yapay olarak miRNA ipleri ile de yüklenebilir.
Yüksek hızlı atomik kuvvet mikroskobu (HS-AFM) subnanometer uzamsal ve subsecond temporal çözünürlük8sunan biyolojik numunelerin karakterizasyonu için güçlü bir araçtır. Bu nedenle, yerel/reconstituted/etiketli lipoprotein parçacıkları gibi değiştirilmiş lipoprotein parçacıklarının kalite kontrolü için iyi uygun bir tekniktir, yakın fizyolojik bir çevre altında görüntülenmiş olabilir.
Burada, qPCR tabanlı bir protokol, lipoprotein parçacıklarının ve hücre örneklerinin mutlak/göreceli miRNA içeriğini belirlemek için adım adım sunulur ve bu da hücresel lipoprotein parçacık alımı oranının tahmin edilmesini sağlar. Dahası, miRNA ile lipoprotein parçacıklarının zenginleşmesi için bir yöntem gösterilmiştir. Bu yöntem lipoprotein içeriğinin genel manipülasyon için adapte olabilir ve bu nedenle, ilaç teslimi için hedefler olarak lipoprotein parçacıklarının uygulanabilirliğini gösterir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>TI 55.2</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer (EDTA)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366643</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaliumbromid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2110</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342414</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube sealer</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342428</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P029.2</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D/0650/50</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubes, MWCO 12 - 14k</td>
			<td>Spectra</td>
			<td>132700</td>
			<td>Lipoprotein isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synthetic miRNA</td>
			<td>microSynth</td>
			<td>-</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 7</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 8</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile tubes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>ENE8.1</td>
			<td>synthetic miRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf Biophotometer</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>XK20</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie G-250 Stain</td>
			<td>BioRad GmbH</td>
			<td>161-0786</td>
			<td>Bradford assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3957.1</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS buffer pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>AustrAlco</td>
			<td>Ethanol Absolut 99.9%</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3942.1</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Multifuge X3R</td>
			<td>Delipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3313.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4627.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylcholine</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>P3556-25mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol oleate</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>C-9253-250mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>C8667-500mg</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass tubes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>K226.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spermine</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>S3256-1G</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer comfort</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>3097-25G</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>0955.2</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#181;L micropipettes</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>A762.1</td>
			<td>Reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9143.2</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amberlite XAD-2 beads</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH</td>
			<td>10357</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer casette (cut-off 20 kDa)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66003</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>465 76 83</td>
			<td>Dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3054.2</td>
			<td>Labeling of LDL particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Labeling of LDL particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Force Microscope</td>
			<td>RIBM</td>
			<td>SS-NEX</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscovite Mica (V-1 Grade)</td>
			<td>Christine Gr&#246;pl</td>
			<td>G250-1/V1</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM Cantilever</td>
			<td>Nanoworld</td>
			<td>USC-F1.2-k0.15</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gwyddion 2.49</td>
			<td>Czech Metrology Institute</td>
			<td>http://gwyddion.net</td>
			<td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber slides, Nunc Lab-Tek</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9117.1</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Omni Life Science GmbH</td>
			<td>Casy</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>217004</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Sterican 465 75 19</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309050</td>
			<td>miRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cabinet</td>
			<td>Esco</td>
			<td>PCR-3A1</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4366596</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free water</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T143</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 ml tubes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781305</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>Microcentrifuge AL</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Sensoquest</td>
			<td>Labcycler</td>
			<td>Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Primer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal probe supermix</td>
			<td>BioRad GmbH</td>
			<td>1725131</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Corbett</td>
			<td>Rotor-Gene RG-6000</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366596</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4399966</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4391128</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4399933</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal Master Mix II, no UNG</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4440040</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA Human A Cards</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A31805</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0581</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (25mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0971</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9849</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7900HT Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4351405</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Array Card Sealer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>-</td>
			<td>TaqMan Array</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native lipoprotein particles with microrna and subsequent determination of their absolute/relative microrna content and their cellular transfer rate

Lipoprotein parçacıklar kan dolaşımında lipid ve kolesterol ağırlıklı taşıyıcılar vardır. Ayrıca, küçük miktarlarda kodlaması olmayan microRNA (miRNA) ipleri içerir. Genel olarak, miRNA, Messenger-RNA (mRNA) ile etkileşimleri nedeniyle protein ifadesi profilini değiştirir. Böylece, lipoprotein parçacıklarının göreceli ve mutlak miRNA içeriğinin bilgisi, hücresel parçacık alımı biyolojik etkisini tahmin etmek için esastır. Burada, lipoprotein parçacıklarının mutlak miRNA içeriğini belirlemek için, yerli ve miRNA zenginleştirilmiş lipoprotein parçacıkları için gösterilen örneklenmiş bir nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) tabanlı protokol sunulmaktadır. Göreceli Mirna içeriği multiwell mikroakışkan dizi kartları kullanılarak niceleyilmiş. Ayrıca, bu protokol bilim adamlarının hücresel Mirna ve böylece, lipoprotein parçacık alımını oranı tahmin sağlar. Hücre miRNA seviyesinin önemli bir artışı, miRNA ile yapay olarak yüklenmiş yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) parçacıkları kullanıldığında gözlemlenebilir, ancak yerel HDL partikülleri ile inkübasyon oldukça düşük miRNA içeriği nedeniyle önemli bir etki vermez. Buna karşılık, düşük yoğunluklu lipoprotein hücresel alımı (LDL) parçacıklar-ne yerli miRNA ile ne de yapay ile yüklü-hücresel miRNA seviyesini değiştirmez.

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer 

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Burada, lipoprotein parçacıklarının yerel Micro-RNA içeriğinin (mutlak/göreceli) belirlenmesi için nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyon tabanlı protokol sunulur. Buna ek olarak, Mikro-RNA seviyesini artırmak için bir yöntem, hem de lipoprotein parçacıkları hücresel alımını oranını belirlemek için bir yöntem gösterilmiştir.

MicroRNA ile yerli lipoprotein parçacıkları zenginleştirme ve onların mutlak/bağıl microRNA Içerik ve onların hücresel transfer hızı sonraki belirlenmesi

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Lipoprotein parçacıkları yerli taşıma araçlarıdır. Yabancı maddelerin zenginleşmesi, palet taşıyıcısı olarak kullanımını kolaylaştırır. Moleküllerin veya bütün parçacıkların özel olarak etiketlemi hücresel alımının ölçülmesini mümkün kılar.Zenginleştirme için iki yöntem hızlı ve kullanımı kolaydır ve maddelerin geniş bir yelpazede için adapte edilebilir. Prosedürü gösteren Markus Axmann ve Andreas Karner, laboratuvarımdan iki doktora sonrası. Duman kaputunda delipidasyona başlamak için, beş miligram HDL partikülü içeren bir ila iki mililitre uzunluğundaki HDL çözeltisini, konik bir santrifüj tüpünde önceden soğutulmuş üç-iki etanol etil eter karışımıile 50 mililitre HDL parçacıklarını karıştırın.Negatif 20 derecede iki saat kuluçkaya yat. 2500 kez g'de 10 dakika boyunca negatif 10 santigrat derecede santrifüj. Supernatant atın, önceden soğutulmuş etanol etil eter karışımı 50 mililitre pelet resuspend, ve girdap kısaca.Negatif 20 santigrat derecede iki saat boyunca ikinci kez kuluçkaya yat. Negatif 10 santigrat derece 10 dakika için 2500 kez g tekrar santrifüj. Sonra pelet kurutmak için azot gazı akışı sağlayan tüpler ekleyin.Ve 250 mikrolitre tampon A.Bradford protein isay'ını ya da uygun bir tanesini kullanarak protein konsantrasyonu belirleyin. Bu çözücüler apolipoproteinlerin relipidasyon inhibe edeceğini gibi, etanol diethyl eter karışımı nın herhangi bir kalıntıları kaldırmak için önemlidir. Sonra, tampon A.Insert bir tüp tüp çözelti parçası içine inert gaz sağlayan bir tüp eklemek başına protein bir miligram son konsantrasyonu seyreltin.Gerekirse, solüsyonu bir gecede, inert gaz atmosferinin altında dört santigrat derecede saklayın. Yeniden yapılmaya başlamak için, temiz bir cam tüpte 100 mikrolitre CO, 13,5 mikrolitre C ve 500 mikrolitre PC'yi karıştırın. Daha sonra homojen bir yüzey tabakası verim için karışımı kurutmak için tüp içinde azot gazı kızarma sırasında cam tüp döndürün. 0.5 mililitrelik bir reaksiyon tüpünde, tampon A.Then 100 mikrolitre 100 mikrolitre sentetik mikroRNA ile 100 mikrolitre spermin çözeltisi ile iki mililitrelik reaksiyon tüpünde taze 30 milimolar spermin çözeltisi hazırlayın.Ve 30 derece santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yat. Daha sonra, hazırlanan PC-CO-C mastermix yüzey tabakasını yeniden sulamak için kuluçkaya yatan 200 mikrolitrelik çözeltiyi cam tüpe aktarın. Ve sonra mililitre sodyum deoksiol çözeltisi başına 30 miligram 50 mikrolitre ekleyin.İki saat boyunca dört derecede karıştırın. Bundan sonra, cam tüp içine delipidated HDL çözeltisi 250 mikrolitre ekleyin. Ve bir gecede 4 derece karıştırın.Diyalize başlamak için, ilk çift distile su 800 mililitre adsorbent boncuk 50 gram ekleyin. Ve bir dakika karıştırmak için manyetik karıştırıcı kullanın. Boncukların yerleşmesi için 15 dakika bekleyin ve süpernatant'ı dekantlayın.İşlemi önceden soğutulmuş PBS ile tekrarlayın. PBS'de ıslak öncesi diyaliz kasetleri. Üreticinin talimatlarına göre kasetlere önceden hazırlanmış karışımı eklemek için bir şırınga kullanın.PBS tarafından işlenmiş adsorbent boncukları üç litre PBS'ye ekleyin ve kasetleri PBS'ye yerleştirerek dört santigrat derecede diyalize alın. Boncuklar diyaliz membranı boyunca yoğunluk gradyanı sabit tutar. Bir saat ve iki saat sonra arabellek ve boncuk değiştirin.24 saat sonra, bir şırınga ile, yeniden oluşturulan HDL parçacık çözeltisini kurtarmak için kasetteki çözeltiyi 1,5 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne alın. Bradford tsay kullanarak protein konsantrasyonu belirleyin. Reaksiyon tüpüne inert gaz tedarik edin, kapatın ve yeniden oluşturulmuş HDL parçacık çözeltisini durağan gaz atmosferinin altında dört santigrat derecede saklayın.İlk olarak, RNAse içermeyen suda taze 30 milimolar spermin çözeltisi hazırlayın. 100 mikrolitre sentetik mikroRNA 100 mikrolitre spermin çözeltisi ile iki mililitrelik reaksiyon tüpünde karıştırın. Ve 30 derece santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yat.Daha sonra hazırlanan mikroRNA spermin çözeltisine 100 mikrolitre DMSO ve 1,2 mililitre 1X LDL tampon ekleyin. PBS ile daha önce hazırlanmış LDL parçacık çözeltisini mililitrebaşına yaklaşık dört miligramlık bir konsantrasyona seyreltin. Daha sonra seyreltilmiş çözeltinin 450 mikrolitresini 1,5 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne çekin ve 50 mikrolitre 10X LDL tamponile karıştırın.Buzda 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, 500 mikrolitreLDL parçacık çözeltisi ve 1.5 mililitrelik mikroRNA-spermin-DMSO çözeltisini birleştirin ve 40 santigrat derecede iki saat kuluçkaya yatırın. Daha önce açıklandığı gibi diyaliz gerçekleştirin ve etiketli LDL parçacık çözeltisini durağan gaz atmosferinin altında dört santigrat derecede saklayın.Başlamak için, PBS'deki HDL veya LDL parçacık çözeltisini 1'den 100'e 1'e 000 arasında seyreltin. Mika alt tabakasına yapıştırıcı bant basarak ve üst mika katmanlarını çıkarmak için bandı çekerek mikayı ayırın. Beş dakika kuluçka için taze yarık mika üzerinde iki mikrolitre yatırmak için bir pipet kullanın.Lipoprotein parçacıkları yüzeylerde sürekli bağ membranları oluşturma eğilimindedir. Sonuç olarak, mika yüzeyindeki parçacık konsantrasyonunu tek tek ayarlamak önemlidir. Kuluçkadan sonra, örneği PBS ile durula.Yüksek hızlı AFM sıvı hücresini PBS ile doldurun ve mika taşıyan tarayıcıyı yüksek hızlı AFM aşamasına monte edin. Kontrol yazılımında, mika yüzeyine cantilever yaklaşma sürecini başlatın. Bir metre kareden daha az ölçüm boyutları kullanın ve görüntüleme kuvvetlerini mümkün olduğunca düşük tutun.Dokunma modunda örneği görüntüleyin. Verileri Gwyddion'a yükleyin ve parçacıkları eşik işlevine göre işaret taneleri aracılığıyla algıla. Tek tek parçacıkları maskelemek için yükseklik eşik değerini ayarlayın.Genellikle, % 50 civarında bir seviye iyi bir başlangıç noktasıdır. Görüntüyü düzleştirmek için çok nolualt arka planı kaldırın ve maskeli bölge seçeneğini dışla seçeneğini etkinleştirin. Çeşitli tane karakteristiklerinin dağılımı işlevini kullanarak algılanan parçacıkların maksimum yükseklik değerlerini dışa aktarın ve kaydedilen tüm görüntüler için bu adımları yineleyin.Bu deneyde HDL partiküllerinin yeniden yapılandırılması HDL partiküllerinin delipidasyonu ile gerçekleştirildi, ardından relipidasyon ve diyaliz yapıldı. Yeniden oluşturulan HDL partiküllerinin %50'si verim elde edilebilir. Ancak, apolipoprotein B100 proteininin hidrofobikliği nedeniyle, mikroRNA ile aynı etiketleme LDL partiküllerinin etiketlanması için mümkün değildi.Böylece, DMSO LDL parçacıklarının lipid monotabakasının penetrasyonu için kullanılmıştır, kalite kontrolü sırasında %100'e yakın bir verim ile seyreltme analiz için kritiköneme sahiptir. Üstteki görüntü çok yüksek parçacık yoğunluğu gösterir. Alttaki görüntü analiz için uygundur.Parçacık yüksekliklerinin olasılık yoğunluğu fonksiyonları yerli, etiketli ve etiketli kontrol lipoprotein parçacıklarının boyut dağılımlarının karşılaştırılması için hesaplanmıştır. Etiketleme işleminden önce ve sonra göreli değişiklik ihmal edilebilir. RNA oligonükleotidleri işlerken RNAse'siz çalışın.Taze tek kullanımlık plastik sarf malzemeleri kullanın ve her zaman eldiven giyin. Sadece nükleaz içermeyen çözeltiler kullanın. Yüksek hızlı AFM lipoproteinlerin genel şeklini belirlemek için sadece bir yöntemdir.Alternatif bir yöntem elektron mikroskobu olacaktır. Uygun kişisel koruma ekipmanı giyin ve diethyl eter kullanırken bir duman kaputunda çalışın.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

Bunların Anti layişmanya Faaliyet karışık Lizin tipi / Arjinin-monomerleri ve Değerlendirilmesi peptoidler Sentezi için etkili bir yöntem

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

1,2-Azaborines Sentezi ve T4 Lizozim Mutants ile Bunların Protein Kompleksleri hazırlanması

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Siyanobakterlerde Glikojen İçeriğinin Belirlenmesi

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Proteinler ve onların izoformlarının kapiller Isoelectric odaklanarak yöntemi tarafından son derece hassas ve nicel tespiti

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Kovalent DNA oluşumu enzimatik aktif kanserojen ve uyuşturucu Vitro ve kararlılıklarını 32P-postlabeling tarafından Adducts

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteomik analiz onların yerel hücresel ortamında içeriğe özel Protein kompleksleri

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Cyanobacterium Synechocystis Phycobiliprotein içeriğinde spektrofotometrik tayini

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Yalıtım fizyolojik aktif Thylakoids ve onların kullanımı enerji bağımlı Protein taşıma deneyleri

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Mitokondriyal solunum zinciri Süperkompleksleri ayrımı ve analizi için hibrid Clear/mavi yerli Elektroforez

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Membran fosfolipidler içine bakteriyel patojen yağ asidi kuruluş çalışması için tavuk yumurtası sarısı lipoprotein parçacıklarının yalıtım

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...