Name: lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates
Uploaded: 2019-05-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل ماليا من قبل المعاهد الوطنية للصحة إلى Y.I. (R01-DK090490) والرابطة الأمريكية للسكري إلى Y.I. (1-17-IBS-132). ويدعم J.A. وY.I. من قبل منظمة أخوية من النسور مركز أبحاث مرض السكري. A.B. بدعم من منحة التدريب المعاهد الوطنية للصحة (T32NS45549). استخدم المؤلفون جزر البنكرياس البشرية التي يوفرها برنامج توزيع الجزر المتكاملة (IIDP) الممول من NIDDK في مدينة الأمل (2UC4DK098085).

وقبل بدء الدراسات، قام مجلس الاستعراض المؤسسي التابع لجامعة آيوا بتحديد البحوث المتعلقة بالمواضيع البشرية، وقرر أن الدراسة لا تفي بمعايير بحوث المواضيع البشرية. استشر مجلس المراجعة المحلي قبل بدء الدراسة لتحديد ما إذا كان مصدر الجزر الصغيرة والدراسة المخطط لها يتطلب موافقة مسبقة.
<p cla...

<ol>
	<li>Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta+cell+mass+and+function+in+diabetes:+Recent+advances+in+knowledge+and+technologies+to+understand+disease+pathogenesis.">Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).</li><li>Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+flexible+system+for+glucose+homeostasis.">Stable and flexible system for glucose homeostasis.</a> Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).</li><li>Cryer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Glucagon+in+the+pathogenesis+of+hypoglycemia+and+hyperglycemia+in+diabetes.">Minireview: Glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes.</a> Endocrinology. 153 (3), 1039-1048 (2012).</li><li>Arrojo e Drigo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+architecture+of+the+islet+of+Langerhans:+a+focused+cross-species+assessment.">New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment.</a> Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).</li><li>Harata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+shRNA+via+lentivirus+in+human+pseudoislets+provides+a+model+to+test+dynamic+regulation+of+insulin+secretion+and+gene+function+in+human+islets.">Delivery of shRNA via lentivirus in human pseudoislets provides a model to test dynamic regulation of insulin secretion and gene function in human islets.</a> Physiological Reports. 6 (20), e13907 (2018).</li><li>Barbu, A. R., Akusjarvi, G., Welsh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+transduction+of+human+pancreatic+islets:+importance+of+adenoviral+genome+for+cell+viability+and+association+with+a+deficient+antiviral+response.">Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response.</a> Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).</li><li>Hughes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+to+improve+pancreatic+islet+transplantation+for+Type+1+diabetes+mellitus.">Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus.</a> Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).</li><li>Jimenez-Moreno, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+High+Efficiency+Intra-Islet+Transduction+Protocol+Using+Lentiviral+Vectors.">A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors.</a> Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).</li><li>Bonora, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+correlates+of+post-prandial+hyperglycaemia+in+a+large+sample+of+patients+with+type+2+diabetes+mellitus.">Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).</li><li>Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. L., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+reassociation+of+dispersed+adult+rat+pancreatic+islet+cells+into+aggregates+with+three-dimensional+architecture+typical+of+native+islets.">Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets.</a> Diabetes. 36 (7), 783-790 (1987).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+pseudoislets+form+efficiently+from+donated+tissue,+compare+favourably+with+native+islets+in+vitro+and+restore+normoglycaemia+in+mice.">Bioengineered human pseudoislets form efficiently from donated tissue, compare favourably with native islets in vitro and restore normoglycaemia in mice.</a> Diabetologia. 61 (9), 2016-2029 (2018).</li><li>Zuellig, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+physiological+properties+of+gravity-enforced+reassembled+rat+and+human+pancreatic+pseudo-islets.">Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).</li><li>Caton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+transduction+of+connexin+cDNAs+shows+level-+and+isoform-specific+alterations+in+insulin+secretion+of+primary+pancreatic+beta-cells.">Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells.</a> Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+beta+Cell+Function.">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li><li>Peiris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+human+diabetes-risk+gene+function+with+genetics+and+physiological+assays.">Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays.</a> Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).</li><li>Schlimgen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+Associated+With+Lentiviral+Vector+Exposures+and+Prevention+Strategies.">Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies.</a> Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+islet+for+improved+performance+by+optimized+reaggregation+in+alginate+gel+beads.">Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).</li><li>Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+re-aggregated+human+pancreatic+islets+for+secondary+drug+screening.">Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening.</a> British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).</li><li>Hilderink, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+aggregation+of+primary+human+pancreatic+islet+cells+leads+to+glucose-responsive+pseudoislets+comparable+to+native+islets.">Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).</li><li>Saunders, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectonucleoside+Triphosphate+Diphosphohydrolase-3+Antibody+Targets+Adult+Human+Pancreatic+beta+Cells+for+In+Vitro+and+In+Vivo+Analysis.">Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis.</a> Cell Metabolism. (18), (2018).</li><li>Reissaus, C. A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reestablishment+of+Glucose+Inhibition+of+Glucagon+Secretion+in+Small+Pseudoislets.">Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets.</a> Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).</li></ol>

هنا، يتم تقديم بروتوكول مفصل لتوليد الزائفة البشرية التي يتم نقلها عن طريق فيروس لينتي باستخدام لوحة مرفق منخفضة جدا ً 96-well أو لوحة ثقافة ميكروويل. وقد أفيد الزائفة لإظهار وظائف مورفولوجيا وإفراز مماثلة للجزر البشرية الأصلية ويمكن أن تكون مثقفة لفترة طويلة في المختبر5،...

فقدان كتلة خلية بيتا الوظيفية هو علم الأمراض المركزية لكل من النوع 1 والنوع 2 مرض السكري1. في حين أن خلايا بيتا هي منتجة الأنسولين في جزر البنكرياس، فإن التواصل بين خلايا بيتا والخلايا غير بيتا يلعب دورا حاسما في تنظيم إفراز الأنسولين2. وبالإضافة إلى ذلك، فإن خلل تنظيم إفراز الجلوكاجون يساهم في ارتفاع السكر في الدم في مرض السكري3. وهكذا، هناك اهتمام قوي لتعديل التعبير الجيني للخلايا داخل جزر البنكرياس لمعالجة الآلية وراء تطور خلل في مرض السكري في جزيرة. تتوفر مجموعة متنوعة من النهج بما في ذلك الفئران المعدلة وراثيا لتعديل التعبير الجيني من جزر الماوس. ومع ذلك، تظهر الجزر البشرية والماوس تتداخلي متميزة، وتوزيع الخلايا، ونسبة بيتا إلى خلايا ألفا، والاستجابة لsecretagogues4. لذلك ، فإن التقييم المباشر لوظيفة الجينات في الجزر البشرية مهم للغاية لفهم الفيزيولوجيا المرضية لجزيرة البنكرياس البشرية.
ناقلات الأدينوفيروسي هو الناقل الفيروسي الأكثر استخداما ً لنقل جزر البنكرياس في المختبر بسبب الكفاءة العالية للانتقال في الخلايا غير المقسمة. ومع ذلك، لا تخترق الغدة الدرقية إلى جوهر الجزر بكفاءة، وخاصة في الجزر البشرية5، وهو سامة للخلايا بجرعات عالية6. نسبيا, ناقلات لينتيفيروسي أقل سمية للخلايا ويسلم الجينات الخارجية بشكل دائم في كروموسوم الخلايا ما بعد السيتوتيك, مما يجعلها وسيلة اختبارها على نطاق واسع للعلاج الجيني7. ومع ذلك، فإن قدرة الفيروس اللين على اختراق جوهر الجزر البشرية السليمة محدودة أيضا، مما يتطلب تشتتا جزئيا عن طريق الهضم الأنزيمي لزيادة كفاءة التحويل8. التحذير مع تشتت الجزر البشرية سليمة هو انقطاع خلية الخلية وخلية مصفوفة الاتصالات، مما يعرض للخطر التنظيم الديناميكي لإفراز الأنسولين حاسمة للحفاظ على التوازن الجلوكوز في البشر9. وهكذا، كان من الصعب تقييم تأثير تعديل الجينات على التنظيم الديناميكي لوظيفة جزيرة في نموذج من الجزر البشرية.
ومن المعروف أن خلايا الجزر المشتتة من الجزر البشرية والقوارض تعيد تجميعها بشكل مستقل في هياكل شبيهة بالجزر تسمى "الزائفة". الزائفة تظهر بيتا وغير بيتا توزيع الخلايا مماثلة للجزر الأصلية10،11. بالإضافة إلى ذلك، بعد الثقافة على المدى الطويل،الجزر الأصلية تفقد تدريجيا قوية المرحلة الأولى إفراز الأنسولين 5،10،11،12. ومع ذلك، أظهرت الزائفة الحفاظ على أفضل من إفراز الأنسولين المرحلة الأولى استجابة للجلوكوز مقارنة مع الجزر الأصلية بعد نفس فترة الثقافة5. بالإضافة إلى وجود أفضل الحفاظ على إفراز الأنسولين، إعادة تصنيف الخلايا التي تسيطر عليها حجم من الخلايا الصغيرة البشرية في لوحات مرفق منخفضة11 يوفر فرصة لإدخال ناقلات فيروس لينتي قبل إعادة تجميعها في الزائفة. وقد أظهرت العديد من الدراسات فائدة الزائفة جنبا إلى جنب مع نقل اللاتيفيروسي بوساطة. وأفاد Caton et al.13 أن إدخال بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) الذي يعبر عن فيروس اللين لم يكن له تأثير يذكر على إفراز الأنسولين في حين حقق التعبير المتجانس عن GFP في الزائفة الفئران مقارنة مع السيطرة غير المصابة. كما أنها أظهرت تأثير محدد من connexins مختلفة على إفراز الأنسولين عن طريق الإفراط في connexins 32, 36, و 43 عن طريق lentivirus13. الزائفة البشرية أعدت مع لوحة مرفق 96-well منخفضة جدا المتاحة تجاريا أظهرت أن الإفراط في التعبير عن النسخ بوساطة lentiviral SIX3 يحسن إفراز الأنسولين التي تم تقييمها من قبل الحضانة ثابتة 14. في الآونة الأخيرة، تم استخدام الزائفة البشرية التي أعدت مع لوحة مرفق منخفضة جدا 96 جيدا لdownregulate glucokinase عن طريق الحمض النووي الريبي القصير لينفيروسي (شرنا) كدليل على المبدأ لإظهار أن يتم تقليل إفراز الأنسولين المحفز للجلوكوز، في حين يتم تخفيض تم الحفاظ على إفراز الأنسولين المحفز من قبل KCl5. وأظهرت الدراسة أيضا أن الزائفة البشرية مماثلة للجزر الأصلية في التعبير الجيني وملامح إفرازية، وزيادة دعم فائدة الزائفة البشرية لتشريح تنظيم وظيفة جزيرة5. على الرغم من أن لا يتم إجراء التسريب، ولوحة ثقافة ميكروويل المهندسة بيولوجيا التي أصبحت متاحة تجاريا مؤخرا، كما أفيد أن تكون متوافقة مع نقل اللاتفيروسي وتنتج الزائفة البشرية التي أظهرت الأنسولين ممتازة إفراز في المختبر وفي الجسم الحي بعد زرع11. بشكل جماعي، تكوين الزائفة البشرية جنبا إلى جنب مع الانبثاق الفيروسي ة هو نهج بسيط وفعال للتحقيق في الفيزيولوجيا الباثولوجية جزيرة الإنسان، وتوفير أداة قيمة لإجراء الدراسات الميكانيكية في الجزر البشرية.
وفي هذا التقرير، يُعرض بروتوكول لتشكيل الزائفات البشرية المستحثة بفيروس اللانتي باستخدام منصتين متاحتين تجارياً، ولوحة مرفق منخفضة جداً تبلغ 96 بئراً، ولوحة ثقافة ميكروويل. كلاهما تحقيق تعديل فعال للتعبير الجيني وخلق الزائفة البشرية التي تتوافق مع تقييمات المصب بما في ذلك الحضانة الثابتة وperifusion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series Type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer, 40 micrometer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11530037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Trizol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marien Feld</td>
			<td>Neubauer-Improved Bright line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>11-350-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube, 1.5 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microwell culture plate</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>34411</td>
			<td>Aggrewell 400, 24 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motor-driven pestle</td>
			<td>GAMUT</td>
			<td>#399X644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-tissue culture treated dish, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 mm</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 5 mL</td>
			<td>DOT Scientific,</td>
			<td>667205B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 8-channel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#613-5253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>667210B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P10</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P200</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P1000</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteolytic and collagenolytic enzyme mixture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6965</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagent reservoir, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversible strainer, 37 micrometer</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>27251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket plate centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-14R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SX4750A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin syringe, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra low attachment microplate, 96 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4515</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates

تتوفر أدوات وراثية مختلفة لتعديل الجينات في جزر البنكرياس من القوارض لتشريح وظيفة جينات الجزر لبحوث مرض السكري. ومع ذلك، فإن البيانات التي يتم الحصول عليها من جزر القوارض غالبا ما لا تستنسخ بالكامل في الجزر البشرية أو تنطبق عليها بسبب الاختلافات المعروفة في هيكل الجزر ووظيفتها بين الأنواع. وفي الوقت الراهن، فإن التقنيات المتاحة للتلاعب بالتعبير الجيني للجزر البشرية محدودة جدا. إدخال الجينات في الجزر سليمة عن طريق الفيروس الغدي، بلازميد، وoligonucleotides غالبا ما يعاني من انخفاض الكفاءة والسمية العالية. انخفاض الكفاءة هو إشكالية خاصة في الدراسات الجينات أسفل التنظيم في الجزر سليمة، والتي تتطلب كفاءة عالية. ومن المعروف أن خلايا جزيرة المشتتة الأنزيمية إعادة تجميع في الثقافة تشكيل spheroids تسمى الزائفة. إعادة تصنيف الخلايا الصغيرة التي يتم التحكم فيها بالحجم تخلق البساط التي تحافظ على إفراز الأنسولين الديناميكي في المرحلة الأولى بعد الزراعة المطولة وتوفر نافذة لإدخال الحمض النووي الريبي القصير اللين (shRNA) بكفاءة مع سمية منخفضة. هنا، يتم وصف بروتوكول مفصل لإنشاء الزائفة البشرية بعد الانشّاط الفيروسي باستخدام اثنين من لوحات multiwell المتاحة تجاريا. ويمكن تنفيذ البروتوكول بسهولة ويسمح بكفاءة خفض تنظيم الجينات وتقييم دينامية إفراز الأنسولين باستخدام خلايا الislet البشرية. وهكذا، فإن الزائفة البشرية مع تعديل الجينات بوساطة لينتيفيروسي توفر نموذجا قويا وتنوعا لتقييم وظيفة الجينات داخل خلايا جزيرة الإنسان.

يوضح الشكل 1 الخطوات الرئيسية في إنتاج الزائفين باستخدام لوحة مرفق منخفضة للغاية تبلغ 96 بئرًا ولوحة ثقافة ميكروويل. ويبين الشكل 2أ التغيرات المتتالية في مورفولوجيا أثناء تكوين الزائفين من 3 × 103 خلايا جزيرة بشرية في لوحة مرفق منخفضة ?...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates at JoVE.com

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

يتم تقديم بروتوكول لإنشاء البوادى البشرية المعدلة الجينات من خلايا جزيرة الإنسان المشتتة التي يتم نقلها بواسطة فيروس لينتي تحمل RNA دبوس الشعر القصير (shRNA). ويستخدم هذا البروتوكول الأنزيمات وأوعية الثقافة المتاحة بسهولة، ويمكن القيام به بسهولة، وينتج الزائفة البشرية المعدلة وراثيا مناسبة للدراسات الوظيفية والمورفولوجية.

لينتيفيروسي تسكت الجينات بوساطة في الزائفة البشرية أعدت في لوحات مرفق منخفضة

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

من الصعب تعديل التعبير الجيني في الجزر البشرية ، كما أن الانخفاض الأكبر في الجزر البشرية العاملة يشكل تحديات كبيرة بعد تعديل التعبير الجيني. عن طريق الجمع بين فيروس العدس بوساطة SHR8 transduction وتشكيل الجزر البشرية المناسبة. يسمح هذا البروتوكول بالتراجع الفعال للجين المستهدف مع الحفاظ على وظيفة الجزيرة أثناء الاستزراع المطول.للبدء، دوامة بلطف زجاجة الشحن للحفاظ على الجزر في التعليق. نقل وسيطة الشحن التي تحتوي على الجزر الصغيرة إلى أنبوب جهاز طرد مركزي مخروطي 50 ملليلتر. دع الأنبوب يجلس في خزانة السلامة البيولوجية لمدة 15 دقيقة حتى تستقر الجزر الصغيرة في قاع الأنبوب.إزالة المتوسطة الشحن بلطف باستخدام ماصة شعرية دون إزعاج بيليه جزيرة. إعادة تعليق بيليه جزيرة في المتوسط CMRL مع 1٪ البوم مصل الإنسان إلى تركيز 400 ما يعادل الجزيرة لكل ملليلتر. نقل الجزر إلى ثقافة غير الأنسجة معالجة طبق وثقافتها في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ بين عشية وضحاها.بعد الاستزراع بين عشية وضحاها، نقل الجزر البشرية إلى أنبوب مركزي مخروطي 15 ملليلتر، طرد مركزي بمعدل 250 ضعف غرام لمدة خمس دقائق في دوار دلو متأرجح. ويُفطّن الوسيط بمُصَحٍ شعري دون إزعاج بيليه الجزيرة. غسل بيليه بلدي إضافة 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني إلى أنبوب، مزيج بلطف والطرد المركزي في 250 مرات ز لمدة خمس دقائق.بعد الطرد المركزي، التعرق PBS دون إزعاج بيليه جزيرة. إعادة تعليق بيليه في 0.5 ملليلتر من مزيج الإنزيمات البروتيوليكية وكولاجينية الكولاجينية قبل الدفء. الماصات خمس مرات باستخدام ماصة P1000 لخلط الجزر.احتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة، مزيج ماصة مداعبة صعودا وهبوطا بلطف. تحقق من الغيوم الخلية واحدة وعدد من رقائق أو الجزر غير مهضومة.وضع مصفاة 40 ميكرون في طبق بتري 35 ملليمتر والرطب مصفاة بإضافة ملليلتر واحد من المتوسط CMRL مع 10٪ تنشيط مصل البقر الجنينية والاكتئاب مع مضخم حقنة ملليلتر واحد. نقل جميع تعليق الخلية على رأس مصفاة. وجمع تمرير من خلال في أنبوب 15 ملليلتر الطازجة.غسل أنبوب المستخدمة في الهضم جزيرة مع 0.5 ملليلتر من المتوسط CMRL الطازجة لجمع بقايا الخلايا وتمرير غسل من خلال مصفاة. الجمع بين تمرير من خلال في أنبوب 15 ملليلتر. كرر مرة واحدة.لتفكك الجزر غير مهضومة المتبقية على مصفاة، اضغط على مصفاة مع المكبس حقنة ملليلتر واحد. جمع تمريرة من خلال مرة أخرى وغسل المصفاة مع CMRL 1066 المتوسطة العادية الطازجة لإزالة جميع الجزر المهضوجمة المتبقية من المصفاة والطبق. إضافة تمرير من خلال إلى أنبوب 15 ملليلتر.سجل الحجم الإجمالي للتعليق الخلية واتخاذ 10 ميكرولتر aliquot من الخلايا لحساب عدد الخلية على مقياس الهيموسيت. بعد الطرد المركزي تعليق الخلية لمدة خمس دقائق في 200 مرة ز، وإزالة المتوسطة دون إزعاج بيليه. لإنتاج شبه الجزر باستخدام 96 جيدا لوحة مرفق منخفضة جدا، أولا حساب الحجم الإجمالي المطلوبة مرة واحدة 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من تعليق خلية واحدة.ثم, إعادة تعليق بيليه جزيرة في المتوسط CMRL مع 10٪ حرارة تنشيط مصل البقر الجنينية بحيث 30 ميكرولترات من تعليق الخلية لديه 3000 الخلايا. بعد ذلك، نقل الحجم المطلوب من تعليق خلية واحدة إلى أنبوب 15 ملليلتر جديد. في 250 وحدة نقل لكل خلية من فيروس العدس التي تحتوي على SH-RNA استهداف جين من الاهتمام أو السيطرة.لخلط تعليق الخلية مع الفيروس، ماصة بلطف خمس مرات مع ماصة P1000. ثم نقل الخلايا المختلطة إلى خزان كاشف معقم 50 ملليلتر إذا باستخدام ماصة قناة ثمانية. مع ماص قناة ثمانية أو ماص P200، الاستغناء 30 ميكرولترس في بئر من تعليق الخلية مختلطة مع فيروس العدس في كل بئر.بعد ذلك، الطرد المركزي لوحة البئر 96 في جهاز طرد مركزي صفيحة دلو يتأرجح في 270 مرة ز في درجة حرارة الغرفة لمدة سبع دقائق. ثقافة في 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون المرطبة بين عشية وضحاها. بعد الحضانة، وإزالة لوحة 96 جيدا من الحاضنة ووضعها في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.Pipette 100 ميكرولترز لكل جزيرة من 10٪ FBSCMRL عالية في بئر لمنع تجفيف الجزر ومواصلة الثقافة لمدة أسبوع واحد. Pipette 100 ميكرولترات لكل بئر من المتوسط CMRL مع 10٪ حرارة تنشيط مصل البقر الجنين من الخزان إلى الجزر الزائفة والماصات صعودا وهبوطا مرتين إلى ثلاث مرات بلطف في البئر لرفع الجزر حتى. ثم، التعرق المتوسطة في البئر التي تحتوي على جزيرة زائفة وإخراجها في طبق بتري 10 سنتيمترا.تحقق من اللوحة تحت مجهر خفيف لضمان الإزالة الكاملة لجميع الجزر الزائفة والمضي قدما في تجارب المصب. لإنتاج شبه الجزر باستخدام 24 جيدا جدا لوحة ثقافة الآبار الصغيرة، أولا إضافة 500 ميكرولترات في بئر من حل مكافحة الامتثال الشطف. أجهزة الطرد المركزي في 1300 مرة ز لمدة خمس دقائق في جهاز طرد مركزي لوحة دلو يتأرجح.ثم، مراقبة لوحة تحت المجهر لضمان إزالة فقاعات الهواء من الآبار الصغيرة. في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، الطامح حل الشطف المضادة للانضمام من الآبار. شطف كل بئر مع ملليلتر اثنين من دافئ CMRL عادي 1066 المتوسطة مرة واحدة.ثم, التعرق في CMRL عادي 1066 المتوسطة وإضافة 0.5 ملليلتر في بئر من CMRL الحارة مع 10٪ حرارة تنشيط مصل الأبقار الجنينية إلى كل مخطط جيدا للاستخدام. تحديد العدد الإجمالي للخلايا اللازمة لكل بئر. إعادة تعليق الخلايا المفردة في 0.8 ملليلتر من متوسط CMRL مع 10٪ من الحرارة تنشيط مصل الأبقار الجنين في أنبوب 1.5 ملليلتر معقمة.لإنشاء بئر واحد من الجزر الزائفة التي يتم تحويلها بواسطة فيروس العدس، أضف 125 وحدة تحويل لكل خلية إلى تعليق الخلية المفردة مع الحفاظ على حجم الفيروس دون 0.2 ملليلتر. احتضان الخلية وخليط الفيروس في 37 درجة مئوية مع خلط لطيف في بعض الأحيان لمدة ساعة واحدة للسماح للاتصال من الخلايا مع الفيروس قبل تكثيف الخلايا. بعد ساعة واحدة، ضبط الحجم الإجمالي لخلية جزيرة وخليط فيروس إلى ملليلتر واحد عن طريق إضافة متوسط CMRL مع 10٪ من الحرارة تنشيط مصل البقرة الجنينية.إذا كانت الخلايا تشكل كتل بعد حضانة ساعة واحدة تفريق في تعليق خلية واحدة عن طريق الأنابيب لطيف وسريع مرتين إلى ثلاث مرات. نقل تعليق الخلية إلى بئر واحد من 24 جيدا لوحة ثقافة صغيرة جيدا. مباشرة بعد الأنابيب، الطرد المركزي في 100 مرة ز في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق لالتقاط الخلايا في جميع الآبار الدقيقة.مراقبة تحت المجهر للتحقق من أن يتم توزيع الخلايا بالتساوي في جميع الآبار الدقيقة. من المهم للغاية أن يتم طرد لوحة الدقيق في البئر مباشرة بعد إضافة البئر الذي يخلط تعليق الخلية المفردة في الآبار. وأظهرت التغيرات المتتالية في مورفولوجيا الجزر الزائفة من 3000 خلية جزرية بشرية تم إنشاؤها في لوحة مرفق منخفضة للغاية 96 طبقة أحادية أو فضفاضة من الخلايا تحولت إلى مجاميع صلبة مع حدود دائرية ناعمة في أسبوع واحد.في المقابل، في لوحة ثقافة الآبار الدقيقة، عادة ما يكون تشكيل الخلايا والجزر شبهية من 500 خلية جزيرة مرئية في غضون أربعة أيام. والحجم الموحد لليجريات الزائفة يقلل من الاختلاف داخل مجموعة الاختبار ويسمح باحتضان ساكن باستخدام أقل من خمس جزر شبهية لكل قياس. وأظهرت اختبار بيري فيوجن لاستجابة الأنسولين الجزر الزائفة البشرية الحفاظ على إفراز الأنسولين المرحلة الأولى قوية ردا على الجلوكوز بعد سبعة أيام من الثقافة.إدخال فيروس العدس التي تستهدف الدهون الدهنية ليبوزيل أو perilipin خمسة الجينات في تعليق خلية واحدة يضمن نقل كفاءة ومتجانسة من خلايا الجزيرة ويحقق كفاءة عالية downregulation الجينات. من المهم أن نتذكر أن الوقت اللازم لتفريق جزيرة الإنسان في خلايا مفردة يتأثر بالعديد من العوامل مثل: الحجم والتوزيع والسمة المانحة. لذلك ، من المهم إيلاء اهتمام وثيق لاختفاء الجزر البشرية أثناء الهضم.في جميع أنحاء البروتوكول من المهم التعامل مع تعليق خلية واحدة بلطف لتجنب فقدان الخلية. يمكن استخدام الجزر الزائفة البشرية التي يتم إنشاؤها للعديد من التطبيقات لتحديد تأثير تعديل الجينات مثل: لطخة غربية ودراسة النسيج وقياسات معدلات استهلاك الأكسجين. يسمح هذا البروتوكول بتقييم انخفاض الجينات المستهدفة في تنظيم صحة الجزيرت والوظائف في الجزر البشرية باستخدام الب اواع المختبرات الشائعة والتقنيات البسيطة.وقد يتطلب استخدام الجزر الصغيرة البشرية موافقة مسبقة من مجلس استعراض محلي. يرجى استشارة مجلس المراجعة المحلي قبل بدء الدراسة. ويصنف فيروس العدتين على أنه مستوى السلامة البيولوجية الثاني.اتصل بلجنة السلامة البيولوجية قبل البدء في استخدام فيروس العدس.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

سيرنا ترنسفكأيشن وEMSA تحاليل المعزولة حديثا أرومة غاذية خلوية زغبي الإنسان

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

قياس موازية التعبير الإيقاعية جين ساعة وهرمون إفراز في مزارع الخلايا الأولية البشرية

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

تربية ومزدوجة الذين تقطعت بهم السبل بوساطة الحمض النووي الريبي الجينات ضربة قاضية في إخفاء بيتل،<em&gt; Dermestes المبقعة</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

جيل يعتمد على الاختيار ومستقل من كريسبر / كاس 9 بوساطة جين نوكوتس في خلايا الثدييات

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) بروتوكول لعينات جنينية وفرة منخفضة

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

منهجية موحدة لدراسة المحدثة للطفرات في الموقع كدالة لإصلاح نقطة تحور تحفزها كريسبر/Cas9 وسودن في الخلايا البشرية

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

كريسبر/Cas9-بوساطة التكامل المستهدفة في فيفو استخدام استراتيجية تستند إلى الانضمام إلى التماثل بوساطة نهاية

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

بروتوكول لإنتاج ناقلات لينتيفيرال إينتيجراسي التي تفتقر لخروج المغلوب كريسبر/Cas9-بوساطة الجينات في تقسيم الخلايا

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

كريسبر بوساطة إعادة تنظيم هيكل حلقة الكروماتين

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

لينتيفيرال توسط إنتاج فئران المحورة وراثيا: طريقة بسيطة وذات كفاءة عالية للدراسة مباشرة من مؤسسي

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...