Name: lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates
Uploaded: 2019-05-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates at JoVE.com

Dette arbejde blev finansielt støttet af National Institutes of Health til Y.I. (R01-DK090490) og American diabetes Association til Y.I. (1-17-IBS-132). J.A. og Y.I. understøttes af den broderlige orden af Eagles Diabetes Research Center. A.B. støttes af et nationalt Institut for sundhedsuddannelse (T32NS45549). Forfattere udnyttet menneskelige pancreas Holme leveres af NIDDK-finansierede integreret Islet distribution program (IIDP) på City of Hope (2UC4DK098085).

Forud for påbegyndelse af undersøgelser, en menneskelig forskning beslutsomhed blev foretaget af University of Iowa institutionel revision bestyrelsen, der fastslået, at undersøgelsen ikke opfyldte kriterierne for human forskning. Konsultér den lokale revisions bestyrelse, før undersøgelsen påbegyndes, for at afgøre, om kilden til Holme og planlagt undersøgelse kræver forudgående godkendelse.
Bemærk: Typisk er der behov for 1200 − 1400-øgenækvivalenter (iEQ) a...

<ol>
	<li>Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta+cell+mass+and+function+in+diabetes:+Recent+advances+in+knowledge+and+technologies+to+understand+disease+pathogenesis.">Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).</li><li>Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+flexible+system+for+glucose+homeostasis.">Stable and flexible system for glucose homeostasis.</a> Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).</li><li>Cryer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Glucagon+in+the+pathogenesis+of+hypoglycemia+and+hyperglycemia+in+diabetes.">Minireview: Glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes.</a> Endocrinology. 153 (3), 1039-1048 (2012).</li><li>Arrojo e Drigo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+architecture+of+the+islet+of+Langerhans:+a+focused+cross-species+assessment.">New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment.</a> Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).</li><li>Harata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+shRNA+via+lentivirus+in+human+pseudoislets+provides+a+model+to+test+dynamic+regulation+of+insulin+secretion+and+gene+function+in+human+islets.">Delivery of shRNA via lentivirus in human pseudoislets provides a model to test dynamic regulation of insulin secretion and gene function in human islets.</a> Physiological Reports. 6 (20), e13907 (2018).</li><li>Barbu, A. R., Akusjarvi, G., Welsh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+transduction+of+human+pancreatic+islets:+importance+of+adenoviral+genome+for+cell+viability+and+association+with+a+deficient+antiviral+response.">Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response.</a> Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).</li><li>Hughes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+to+improve+pancreatic+islet+transplantation+for+Type+1+diabetes+mellitus.">Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus.</a> Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).</li><li>Jimenez-Moreno, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+High+Efficiency+Intra-Islet+Transduction+Protocol+Using+Lentiviral+Vectors.">A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors.</a> Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).</li><li>Bonora, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+correlates+of+post-prandial+hyperglycaemia+in+a+large+sample+of+patients+with+type+2+diabetes+mellitus.">Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).</li><li>Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. L., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+reassociation+of+dispersed+adult+rat+pancreatic+islet+cells+into+aggregates+with+three-dimensional+architecture+typical+of+native+islets.">Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets.</a> Diabetes. 36 (7), 783-790 (1987).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+pseudoislets+form+efficiently+from+donated+tissue,+compare+favourably+with+native+islets+in+vitro+and+restore+normoglycaemia+in+mice.">Bioengineered human pseudoislets form efficiently from donated tissue, compare favourably with native islets in vitro and restore normoglycaemia in mice.</a> Diabetologia. 61 (9), 2016-2029 (2018).</li><li>Zuellig, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+physiological+properties+of+gravity-enforced+reassembled+rat+and+human+pancreatic+pseudo-islets.">Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).</li><li>Caton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+transduction+of+connexin+cDNAs+shows+level-+and+isoform-specific+alterations+in+insulin+secretion+of+primary+pancreatic+beta-cells.">Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells.</a> Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+beta+Cell+Function.">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li><li>Peiris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+human+diabetes-risk+gene+function+with+genetics+and+physiological+assays.">Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays.</a> Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).</li><li>Schlimgen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+Associated+With+Lentiviral+Vector+Exposures+and+Prevention+Strategies.">Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies.</a> Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+islet+for+improved+performance+by+optimized+reaggregation+in+alginate+gel+beads.">Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).</li><li>Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+re-aggregated+human+pancreatic+islets+for+secondary+drug+screening.">Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening.</a> British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).</li><li>Hilderink, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+aggregation+of+primary+human+pancreatic+islet+cells+leads+to+glucose-responsive+pseudoislets+comparable+to+native+islets.">Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).</li><li>Saunders, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectonucleoside+Triphosphate+Diphosphohydrolase-3+Antibody+Targets+Adult+Human+Pancreatic+beta+Cells+for+In+Vitro+and+In+Vivo+Analysis.">Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis.</a> Cell Metabolism. (18), (2018).</li><li>Reissaus, C. A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reestablishment+of+Glucose+Inhibition+of+Glucagon+Secretion+in+Small+Pseudoislets.">Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets.</a> Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).</li></ol>

Her præsenteres en detaljeret protokol til at generere humane pseudoisletter, der er transduceret af lentivirus ved hjælp af en 96-brønd ultra-lav fastgørelsesplade eller en strips med mikrobrønde kultur plade. Pseudoislets er blevet rapporteret til at demonstrere morfologi og sekretoriske funktioner svarende til indfødte menneskelige Holme og kan dyrkes i længere tid in vitro5,11,18. I modsætning til indfødte menneskel...

Tabet af funktionel beta cellemasse er den centrale patologi for både type 1-og type 2-diabetes1. Mens beta celler er producenter af insulin i bugspytkirtlen Holme, kommunikation mellem beta celler og ikke-beta celler spiller en afgørende rolle i reguleringen af insulinsekretion2. Desuden, dysregulering af Glucagon sekretion bidrager til hyperglykæmi i diabetes3. Således er der stor interesse for at moduere genekspression af celler inden for pancreas-Holme for at løse mekanismen bag udviklingen af ø-dysfunktion i diabetes. En række forskellige tilgange, herunder Transgene mus er tilgængelige til at moduere genekspression af mus Holme. Men, menneskelige og mus Holme viser særskilte innervation, celle fordeling, forholdet mellem Beta til Alpha celler, og respons på secretagogues4. Derfor er direkte vurdering af gen funktion i menneskelige Holme er yderst vigtigt for forståelsen af Patofysiologi af humane pancreas Holme.
Adenoviral vektor er den mest udbredte virale vektor til transduce pancreas Holme in vitro på grund af den høje effektivitet af transduktion i ikke-dividere celler. Men, adenovirus ikke trænge ind i kernen af Holme effektivt, især i humane Holme5, og er cytotoksisk ved høje doser6. Forholdsvis, lentiviral vektor er mindre cytotoksisk og leverer eksogene gener permanent i kromosom af post-mitotiske celler, hvilket gør det til et bredt afprøvet køretøj til genterapi7. Men, evnen af lentivirus at trænge ind i kernen af intakt humane Holme er også begrænset, hvilket kræver delvis dispersion ved enzymatisk fordøjelse at øge transduktiviteten8. Den advarsel med spredningen af intakt menneskelige Holme er afbrydelse af celle-celle og celle-matrix kommunikation, som kompromitterer den dynamiske regulering af insulinsekretion kritisk for opretholdelse af glucosehomøostase i mennesker9. Derfor har det været udfordrende at vurdere virkningen af genmodulering på den dynamiske regulering af ø-funktionen i en model af menneskelige Holme.
Det har været kendt, at spredte ø-celler fra menneskelige og gnavere Holme selvstændigt reaggregate i Islet-lignende strukturer kaldet "pseudoislets". Pseudoislets viser beta-og ikke-beta-celle distribution svarende til native Holme10,11. Desuden, efter langsigtet kultur, indfødte Holme gradvist miste robust første fase insulinsekretion5,10,11,12. Endnu, pseudoislets demonstreret bedre bevaring af første fase insulinsekretion som reaktion på glukose sammenlignet med indfødte Holme efter den samme kultur periode5. Ud over at have bedre bevarelse af insulinsekretionen, størrelses kontrolleret reaggregation af menneskelige ø-celler i lave vedhæftnings plader11 giver et vindue af muligheder for at introducere lentivirus vektorer før deres reaggregation i pseudoislets. Flere undersøgelser har påvist nytten af pseudoisletter kombineret med lentiviral medieret transduktion. Caton et al.13 rapporterede, at indførelsen af det grønne fluorescerende protein (gfp), der udtrykker lentivirus, havde ringe effekt på insulinsekretionen, samtidig med at man opnåede homogen ekspression af gfp i rotte pseudoisletter sammenlignet med ikke-inficeret kontrol. De viste også den specifikke virkning af forskellige connexiner på insulinsekretionen ved at overtale connexins 32, 36 og 43 via lentivirus13. Humane pseudoisletter fremstillet med en kommercielt tilgængelig 96-brønd ultra-lav vedhæftnings plade viste, at lentiviral-mediated overekspression af transkriptionsfaktor SIX3 forbedrer insulinsekretionen vurderet ved statisk inkubation14. For nylig blev humane pseudoisletter tilberedt med en 96-brønd ultra-lav fastgørelsesplade brugt til at nedregulere glucokinase via lentiviral kort hårnål RNA (shRNA) som et bevis på princippet for at vise, at glukose-stimuleret insulinsekretion er reduceret, mens KCl-stimuleret insulinsekretion blev bevaret5. Undersøgelsen viste også, at humane pseudoisletter ligner indfødte Holme i genekspression og sekretoriske profiler, yderligere støtte nytten af humane pseudoislets at dissekere reguleringen af ø funktion5. Selvom perifusion ikke blev udført, blev en biokonstrueret mikrobrønd kultur plade, der for nylig blev kommercielt tilgængelig, også rapporteret at være kompatibel for lentiviral transduktion og producerede humane pseudoislets, der udviste fremragende insulin sekretion in vitro og in vivo efter transplantation11. Kollektivt er menneskelig pseudo-ø dannelse kombineret med lentiviral transduktion en enkel og effektiv tilgang til at undersøge den menneskelige ø Patofysiologi, hvilket giver et værdifuldt værktøj til at udføre Mekanistiske undersøgelser i humane Holme.
I den nuværende rapport, en protokol til at danne humane pseudoislets transduceret med lentivirus ved hjælp af to kommercielt tilgængelige platforme, en 96-godt ultra-lav fastgørelse plade og en strips med mikrobrønde kultur plade er præsenteret. Begge opnår effektiv graduering af genekspression og skaber humane pseudoisletter, der er kompatible til downstream-vurderinger, herunder statisk inkubation og perifusion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series Type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer, 40 micrometer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11530037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Trizol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marien Feld</td>
			<td>Neubauer-Improved Bright line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>11-350-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube, 1.5 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microwell culture plate</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>34411</td>
			<td>Aggrewell 400, 24 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motor-driven pestle</td>
			<td>GAMUT</td>
			<td>#399X644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-tissue culture treated dish, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 mm</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 5 mL</td>
			<td>DOT Scientific,</td>
			<td>667205B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 8-channel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#613-5253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>667210B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P10</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P200</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P1000</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteolytic and collagenolytic enzyme mixture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6965</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagent reservoir, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversible strainer, 37 micrometer</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>27251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket plate centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-14R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SX4750A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin syringe, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra low attachment microplate, 96 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4515</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates

Forskellige genetiske værktøjer er tilgængelige til at moduere gener i bugspytkirtlen Holme af gnavere at dissekere funktion af ø gener for diabetes forskning. Imidlertid er de data, der er indhentet fra gnaver Holme, ofte ikke helt gengivet i eller gældende for menneskelige øer på grund af velkendte forskelle i øens struktur og funktion mellem arterne. I øjeblikket er teknikker, der er tilgængelige til at manipulere genekspression af menneskelige Holme, meget begrænsede. Indførelse af transgene i intakt Holme af adenovirus, plasmid, og oligonukleotider ofte lider af lav effektivitet og høj toksicitet. Lav effektivitet er især problematisk i gene downregulation undersøgelser i intakt Holme, som kræver høj effektivitet. Det har været kendt, at enzymatisk spredte ø-celler reaggregate i kultur danner sfæroider betegnes pseudoislets. Størrelses kontrolleret reaggregation af menneskelige ø-celler skaber pseudoisletter, der opretholder dynamisk første fase insulinsekretion efter langvarig kultur og giver et vindue til effektivt at introducere lentiviral kort hårnål RNA (shRNA) med lav toksicitet. Her beskrives en detaljeret protokol til oprettelse af humane pseudoisletter efter lentiviral transduktion ved hjælp af to kommercielt tilgængelige multiwell-plader. Protokollen kan let udføres og giver mulighed for effektiv downregulation af gener og vurdering af dynamikken i insulinsekretionen ved hjælp af humane ø-celler. Således, humane pseudoisletter med lentiviral medieret gen modulation giver en kraftfuld og alsidig model til at vurdere genfunktion inden for menneskelige ø-celler.

Figur 1 illustrerer de vigtigste trin i produktionen af pseudoislets ved hjælp af en 96-brønd ultra-lav fastgørelsesplade og en strips med mikrobrønde kultur plade. Figur 2a viser sekventielle ændringer i morfologi under dannelsen af pseudoislets fra 3 x 103 menneskelige ø-celler i en 96-brønd ultra-lav fastgørelsesplade. Monolayer eller løse klumper af celler observeret i dag 1 skiftede til solide aggregater ...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates at JoVE.com

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

En protokol til oprettelse af genetisk modificerede humane pseudoisletter fra spredte humane ø-celler, der er transduceret af lentivirus med kort hårnål RNA (shRNA), er præsenteret. Denne protokol udnytter let tilgængelige enzym og kultur fartøjer, kan udføres nemt, og producerer genetisk modificerede humane pseudoisletter egnet til funktionelle og morfologiske undersøgelser.

Lentiviral medieret genhæmning i humant Pseudoø fremstillet i lave fastgørelses plader

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Det er svært at modulere genekspressionen i menneskelige øer, også større nedgang i de fungerende menneskelige holme udgør store udfordringer efter graduering af genekspression. Ved at kombinere lentivirus medieret SHR8 transduktion og dannelsen af menneskelige egnede øer. Denne protokol muliggør effektiv nedregulering af et målrettet gen, samtidig med at øens funktion bevares under langvarig kultur.Til at begynde, forsigtigt hvirvle forsendelsesflasken til at holde holme i suspension. Transporter forsendelsesmediet med holme til et konisk centrifugerør på 50 milliliter. Lad røret sidde i et biologisk sikkerhedsskab i 15 minutter, så holmene sætter sig til bunden af røret.Fjern forsigtigt forsendelsesmediet ved hjælp af en kapillær pipette uden at forstyrre øpillerpellet. Re-suspendere øen pellet i CMRL medium med 1% human serum albumin til en koncentration på 400 ø ækvivalent per milliliter. Overførsel holme i en ikke-vævskultur behandlet fad og kultur dem på 37 grader celsius i en 5% kuldioxid inkubator natten over.Efter nattens kultur overføres menneske holmene til et 15 milliliter konisk centrifugerør, centrifuge ved 250 gange g i fem minutter i en svingende spandrotor. Og aspirere mediet med en kapillær pipette uden at forstyrre øpille. Vask pellet min tilføje 10 milliliter PBS til røret, bland forsigtigt og centrifuge ved 250 gange g i fem minutter.Efter centrifugering aspireres PBS uden at forstyrre øpillerpellet. Re-suspendere pellet i 0,5 milliliter af en forvarmret proteolytisk og collagenolytisk enzym blanding. Pipette fem gange ved hjælp af en P1000 pipette til at blande holme.Inkubere ved 37 grader celsius i fem minutter. Efter inkubationen blandes pipettet, der klapper forsigtigt op og ned. Kontroller, om der er en enkelt celleskydhed, og hvor mange flager eller ufordøjede holme der er.Anvend en 40 mikron si i en 35 millimeter petriskål og våd sieren ved at tilføje en milliliter CMRL medium med 10% varme inaktiveret føtal kvæg serum og deprimerende med en milliliter sprøjte stemplet. Overfør alle celle suspension på toppen af sern. Og saml passet igennem i et friskt 15 milliliterrør.Vask det rør, der anvendes til fordøjelse af vogne, med 0,5 milliliter frisk CMRL-medium for at indsamle rester celler og passere vasken gennem s sien. Kombiner passet igennem i et 15 milliliterrør. Gentag en gang.Hvis du vil adskille ufordøjede holme, der forbliver på sien, skal du trykke på sien med et sprøjtestempel på en milliliter. Opsaml passet igennem igen og vask s si med frisk almindelig CMRL 1066 medium for at fjerne alle resterende fordøjede holme fra s si og skålen. Tilsæt passet igennem til 15 milliliter røret.Optag det samlede volumen af cellesuspensionen, og tag en 10 mikroliter aliquot af celler for at tælle cellenummeret på et hæmocytometer. Efter centrifugering af cellesuspensionen i fem minutter ved 200 gange g fjernes mediet uden at forstyrre pellets. For at producere pseudo-holme ved hjælp af en 96 godt ultra lav vedhæftet fil plade, først beregne det samlede volumen af de krævede en gange 10 til den femte celler pr milliliter af enkelt celle suspension.Derefter re-suspendere øen pellet i CMRL medium med 10% varme inaktiveret føtal kvæg serum, således at 30 mikroliter af celle suspensionen har 3000 celler. Dernæst overføres det nødvendige volumen af enkeltcellesuspensionen til et friskt 15 milliliterrør. Ved 250 transduktionsenheder pr. celle i en lentivirus, der indeholder SH-RNA, der er rettet mod et gen af interesse eller en kontrol.For at blande celle suspension med virus, pipette forsigtigt fem gange med en P1000 pipette. Derefter overføres de blandede celler til en 50 milliliter steril reagensbeholder, hvis du bruger en otte-kanals pipette. Med en pipette på otte kanaler eller en P200-pipette skal der dispenseres 30 mikroliter pr. brønd af cellesuspensionen blandet med lentivirus i hver brønd.Dernæst centrifuge 96 godt plade i en svingende spand plade centrifuge ved 270 gange g ved stuetemperatur i syv minutter. Kultur på 37 grader celsius i en befugtet 5% kuldioxid inkubator natten over. Efter inkubation fjernes 96 brøndpladen fra inkubatoren, og den sættes i det biologiske sikkerhedsskab.Pipette 100 mikroliter pr. ø på 10% høj FBSCMRL i en brønd for at forhindre tørring af holme og fortsætte med at kultur i en uge. Pipette 100 mikroliter pr. brønd CMRL-medium med 10 % varmeaktiveret føtalt kvægserum fra reservoiret til pseudo-holmene og pipette op og ned to til tre gange forsigtigt i brønden for at løfte holmene op. Derefter aspirere mediet i brønden, der indeholder en pseudo-ø og skubbe ind i en 10 centimeter petriskål.Kontroller pladen under et let mikroskop for at sikre fuldstændig fjernelse af alle pseudo-holme og gå videre til downstream eksperimenter. For at producere pseudo-holme ved hjælp af en 24 godt mikro brøndkulturplade, skal du først tilføje 500 mikroliter pr. brønd af en anti-overholdelsesskylningsopløsning. Centrifuge ved 1300 gange g i fem minutter i en svingende spand plade centrifuge.Derefter observere pladen under et mikroskop for at sikre, at luftbobler fjernes fra mikro-brønde. I et biologisk sikkerhedsskab aspirere anti-overholdelse skylleopløsningen fra brøndene. Skyl hver brønd med to milliliter varmt almindeligt CMRL 1066 medium én gang.Derefter aspirere almindeligt CMRL 1066 medium og tilsæt 0,5 milliliter pr brønd af varm CMRL med 10% varme inaktiveret føtal kvæg serum til hver godt planlagt til brug. Bestem det samlede antal celler, der er nødvendige for hver brønd. Enkeltcellerne suspenderes igen i 0,8 milliliter CMRL-medium med 10 % inaktiveret føtalt kvægserum i et sterilt 1,5 milliliterrør.For at skabe en brønd af pseudo-ø transduced af en lentivirus, tilføjes 125 transduktionsenheder pr. celle til en enkelt celle suspension holde mængden af virus under 0,2 milliliter. Inkuber celle- og virusblandingen ved 37 grader celsius med lejlighedsvis skånsom blanding i en time for at tillade kontakt med celler med virus før kondensering af celler. Efter en time justeres det samlede volumen af øcelle- og virusblandingen til en milliliter ved at tilsætte CMRL-medium med 10 % inaktiveret fosterknæs.Hvis celler danner klumper efter en time inkubation spredes i en enkelt celle suspension ved blid og hurtig pipettering to til tre gange. Overfør cellesuspensionen til en brønd af den 24 brønde mikro-brøndkulturplade. Umiddelbart efter pipettering, centrifuge ved 100 gange g ved stuetemperatur i tre minutter for at fange celler i alle mikro-brønde.Overhold under et mikroskop for at kontrollere, at cellerne er jævnt fordelt i alle mikrobæde. Det er afgørende at centrifuge mikro-godt plade umiddelbart efter tilsætning af godt blande øen enkelt celle suspension i brøndene. Sekventielle ændringer i morfologi af pseudo-holme fra 3000 humane holme celler skabt i en 96 godt ultra lav vedhæftet fil plade viste monolag eller løse klumper af celler omdannet til faste aggregater med en glat rund kant i en uge.I modsætning hertil er dannelsen af celle- og pseudo-holme fra kun 500 holme i en mikro-brøndkulturplade normalt synlig inden for fire dage. Den ensartede størrelse af pseudo-holme reducerer variationen i en testgruppe og tillader statisk inkubation ved hjælp af så lidt som fem pseudo-holme pr. måling. Perry Fusion Assay for insulin respons viste humane pseudo-holme opretholdt robust første fase insulin sekretion som reaktion på glukose efter syv dages kultur.Indførelsen af lentivirus rettet mod humant fedttætfordlipase eller perilipin fem gener i en enkelt celle suspension sikrer en effektiv og homogen transduktion af ø-celler og opnår meget effektiv nedregulering af gener. Det er vigtigt at huske, at den tid, der kræves for at sprede den menneskelige ø i enkelte celler påvirkes af mange faktorer såsom: størrelse, distribution, og donor karakteristisk. Så det er vigtigt at være meget opmærksom på forsvinden af menneskelige øer under fordøjelsen.I hele protokollen er det vigtigt at håndtere enkelt celle suspension forsigtigt for at undgå celletab. De menneskelige pseudo-holme, der skabes, kan bruges til mange applikationer til at bestemme effekten af genmodulering såsom: Western Blot, histologisk undersøgelse og målinger af iltforbrugshastigheder. Denne protokol gør det muligt at vurdere den lave af målrettede gen i reguleringen af øens sundhed og funktionen i menneskelige holme ved hjælp af fælles lab ware og enkle teknikker.Brugen af menneskelige holme kan kræve en forudgående godkendelse fra en lokal review board. Kontakt det lokale klagenævn, før undersøgelsen påbegyndes. Lentivirus er klassificeret som biosikkerhed niveau to.Kontakt udvalget for biosikkerhed, før brugen af lentivirus påbegyndes.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA transfektion og EMSA Analyser på frisk isoleret humant villus cytotrophoblaster

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallel Måling af døgnrytmen ur genekspression og hormon sekretion i Human primære cellekulturer

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Opdræt og dobbelt-strenget RNA-medieret Gene Knockdown i Skjul Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Udvælgelsesafhængig og uafhængig generering af CRISPR / Cas9-medierede Gene Knockouts i Pattedyrceller

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokol for lav-overflod embryonale prøver

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En standardmetode til at undersøge ejendommen mutagenicitet som en funktion af punkt Mutation reparation katalyseret af CRISPR/Cas9 og SsODN i humane celler

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-medieret målrettede Integration In Vivo ved hjælp af en homologi-medieret End at deltage-baseret strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

En protokol til produktion af Integrase-mangelfuld Lentiviral vektorer for CRISPR/Cas9-medieret gen Knockout i dividere celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-medieret reorganisering af kromatin løkke struktur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentiviral medieret produktion af Transgene mus: en enkel og meget effektiv metode til direkte undersøgelse af grundlæggerne

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...