Name: lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates
Uploaded: 2019-05-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates at JoVE.com

Dit werk werd financieel gesteund door National Institutes of Health to Y.I. (R01-DK090490) en American Diabetes Association Y.I. (1-17-IBS-132). J.A. en Y.I. worden ondersteund door de broederlijke orde van het Eagles Diabetes Research Center. A.B. wordt gesteund door een National Institutes of Health Training Grant (T32NS45549). Auteurs gebruikten menselijke pancreas eilandjes geboden door het door NIDDK gefinancierde geïntegreerde Islet-distributieprogramma (IIDP) in City of Hope (2UC4DK098085).

Voorafgaand aan het begin van de studies, een menselijke onderwerpen onderzoek vastberadenheid werd gedaan door de Universiteit van Iowa institutioneel Review Board, die vastbesloten dat de studie niet voldeed aan de criteria voor menselijke onderwerpen onderzoek. Raadpleeg het lokale beoordelingsbord voordat het onderzoek is gestart om te bepalen of de bron van de eilandjes en de geplande studie vooraf moet worden goedgekeurd.
Opmerking: Typisch is 1200 − 1400 eilandje equi...

<ol>
	<li>Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta+cell+mass+and+function+in+diabetes:+Recent+advances+in+knowledge+and+technologies+to+understand+disease+pathogenesis.">Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).</li><li>Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+flexible+system+for+glucose+homeostasis.">Stable and flexible system for glucose homeostasis.</a> Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).</li><li>Cryer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Glucagon+in+the+pathogenesis+of+hypoglycemia+and+hyperglycemia+in+diabetes.">Minireview: Glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes.</a> Endocrinology. 153 (3), 1039-1048 (2012).</li><li>Arrojo e Drigo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+architecture+of+the+islet+of+Langerhans:+a+focused+cross-species+assessment.">New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment.</a> Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).</li><li>Harata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+shRNA+via+lentivirus+in+human+pseudoislets+provides+a+model+to+test+dynamic+regulation+of+insulin+secretion+and+gene+function+in+human+islets.">Delivery of shRNA via lentivirus in human pseudoislets provides a model to test dynamic regulation of insulin secretion and gene function in human islets.</a> Physiological Reports. 6 (20), e13907 (2018).</li><li>Barbu, A. R., Akusjarvi, G., Welsh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+transduction+of+human+pancreatic+islets:+importance+of+adenoviral+genome+for+cell+viability+and+association+with+a+deficient+antiviral+response.">Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response.</a> Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).</li><li>Hughes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+to+improve+pancreatic+islet+transplantation+for+Type+1+diabetes+mellitus.">Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus.</a> Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).</li><li>Jimenez-Moreno, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+High+Efficiency+Intra-Islet+Transduction+Protocol+Using+Lentiviral+Vectors.">A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors.</a> Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).</li><li>Bonora, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+correlates+of+post-prandial+hyperglycaemia+in+a+large+sample+of+patients+with+type+2+diabetes+mellitus.">Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).</li><li>Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. L., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+reassociation+of+dispersed+adult+rat+pancreatic+islet+cells+into+aggregates+with+three-dimensional+architecture+typical+of+native+islets.">Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets.</a> Diabetes. 36 (7), 783-790 (1987).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+pseudoislets+form+efficiently+from+donated+tissue,+compare+favourably+with+native+islets+in+vitro+and+restore+normoglycaemia+in+mice.">Bioengineered human pseudoislets form efficiently from donated tissue, compare favourably with native islets in vitro and restore normoglycaemia in mice.</a> Diabetologia. 61 (9), 2016-2029 (2018).</li><li>Zuellig, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+physiological+properties+of+gravity-enforced+reassembled+rat+and+human+pancreatic+pseudo-islets.">Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).</li><li>Caton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+transduction+of+connexin+cDNAs+shows+level-+and+isoform-specific+alterations+in+insulin+secretion+of+primary+pancreatic+beta-cells.">Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells.</a> Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+beta+Cell+Function.">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li><li>Peiris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+human+diabetes-risk+gene+function+with+genetics+and+physiological+assays.">Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays.</a> Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).</li><li>Schlimgen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+Associated+With+Lentiviral+Vector+Exposures+and+Prevention+Strategies.">Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies.</a> Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+islet+for+improved+performance+by+optimized+reaggregation+in+alginate+gel+beads.">Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).</li><li>Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+re-aggregated+human+pancreatic+islets+for+secondary+drug+screening.">Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening.</a> British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).</li><li>Hilderink, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+aggregation+of+primary+human+pancreatic+islet+cells+leads+to+glucose-responsive+pseudoislets+comparable+to+native+islets.">Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).</li><li>Saunders, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectonucleoside+Triphosphate+Diphosphohydrolase-3+Antibody+Targets+Adult+Human+Pancreatic+beta+Cells+for+In+Vitro+and+In+Vivo+Analysis.">Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis.</a> Cell Metabolism. (18), (2018).</li><li>Reissaus, C. A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reestablishment+of+Glucose+Inhibition+of+Glucagon+Secretion+in+Small+Pseudoislets.">Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets.</a> Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).</li></ol>

Hier, een gedetailleerd protocol voor het genereren van menselijke pseudoislets die door lentivirus worden getransduceerd met behulp van een 96-goed ultra-lage bevestigingsplaat of een micro well cultuur plaat wordt gepresenteerd. Pseudoislets zijn gemeld om morfologie en secretoire functies te demonstreren die vergelijkbaar zijn met inheemse menselijke eilandjes en kunnen worden gekweekt voor langere tijd in vitro5,11,18. In te...

Het verlies van functionele bèta celmassa is de centrale pathologie voor zowel type 1 als type 2 diabetes1. Terwijl beta-cellen zijn de producenten van insuline in alvleesklier eilandjes, communicatie tussen bètacellen en niet-bètacellen speelt een cruciale rol in de regulering van insuline secretie2. Bovendien, disregulatie van glucagonsecretie draagt bij aan hyperglycemie bij diabetes3. Er is dus sterke belangstelling om genexpressie van cellen binnen pancreas eilandjes te moduleren om het mechanisme achter de ontwikkeling van een eilandje dysfunctie bij diabetes aan te pakken. Een verscheidenheid aan benaderingen, waaronder transgene muizen, zijn beschikbaar om genexpressie van muis eilandjes te moduleren. Echter, menselijke en muis eilandjes vertonen verschillende innervatie, celverdeling, ratio van bèta aan Alfa cellen, en reactie op secretagogues4. Daarom is directe beoordeling van de genfunctie in menselijke eilandjes uitermate belangrijk voor het begrijpen van de pathofysiologie van de menselijke pancreas eilandjes.
Adenovirale vector is de meest gebruikte virale vector om pancreas eilandjes in vitro te leiden door de hoge efficiëntie van transductie in niet-scheidings cellen. Echter, adenovirus dringt niet naar de kern van de eilandjes efficiënt, vooral bij menselijke eilandjes5, en is cytotoxisch bij hoge doses6. Relatief is lentivirale vector minder cytotoxisch en levert het exogene genen permanent in het chromosoom van post-mitotische cellen, waardoor het een algemeen getest voertuig is voor gentherapie7. Het vermogen van het lentivirus om de kern van intacte menselijke eilandjes binnen te dringen is echter ook beperkt, waardoor gedeeltelijke dispersie door enzymatische spijsvertering nodig is om de transductie-efficiëntie8te verhogen. Het voorbehoud met de dispersie van intact menselijke eilandjes is de onderbreking van cel-cel en cel-matrix communicatie, die de dynamische regulering van insuline secretie kritisch voor het onderhoud van glucose homeostase bij de mens9compromitteert. Het is dus een uitdaging geweest om de impact van genmodulatie op de dynamische regulering van de eilandje-functie in een model van menselijke eilandjes te beoordelen.
Het is bekend dat verspreide eilandjes cellen van menselijke en knaagdieren autonoom reaggregate in eilandachtige structuren genaamd "pseudoislets". Pseudoislets tonen bèta-en niet-bèta-celverdeling vergelijkbaar met inheemse eilandjes10,11. Bovendien, na lange termijn cultuur, inheemse eilandjes geleidelijk verliezen robuuste eerste fase insuline secretie5,10,11,12. Toch toonden pseudo-eilandjes een beter behoud van de eerste fase insuline secretie in reactie op glucose in vergelijking met inheemse eilandjes na dezelfde cultuur periode5. Naast het hebben van een beter behoud van insuline secretie, maat gecontroleerde reaggregation van menselijke eilandje cellen in lage bijlage platen11 biedt een venster van de mogelijkheid om lentivirus vectoren voorafgaand aan hun reaggregation in te voeren pseudo-eilandjes. Verschillende studies hebben aangetoond dat het nut van pseudoislets gecombineerd met lentivirale gemedieerde transductie. Caton et al.13 meldde dat de introductie van het groene fluorescerende eiwit (GFP) dat lentivirus uitdrukt, weinig effect had op de insuline secretie, terwijl het een homogene expressie van GFP in rat pseudoislets in vergelijking met niet-geïnfecteerde controle had bereikt. Ze toonden ook het specifieke effect van verschillende connexinen op de insuline secretie door het overdrukken van connexinen 32, 36 en 43 via lentivirus13. Menselijke pseudo-eilandjes bereid met een in de handel verkrijgbare 96-well Ultra-Low-bevestigingsplaat toonden aan dat lentivirale gemedieerde overexpressie van transcriptiefactor SIX3 de insuline secretie verbetert die wordt beoordeeld door een statische incubatie14. Onlangs, menselijke pseudoislets bereid met een 96-goed ultra-lage bevestigingsplaat werden gebruikt om te downreguleren glucokinase via lentivirale korte haarspeld RNA (shRNA) als een bewijs van principe om te laten zien dat glucose-gestimuleerd insuline secretie wordt verlaagd, terwijl KCl-gestimuleerd insuline secretie werd bewaard5. De studie toonde ook aan dat menselijke pseudoislets vergelijkbaar zijn met inheemse eilandjes in genexpressie en secretoire profielen, waardoor het nut van menselijke pseudoislets om de regulering van de eilandje functie5te ontleden, verder wordt ondersteund. Hoewel de perifusie niet werd uitgevoerd, werd een biotechnologische micro well cultuur plaat die recentelijk commercieel beschikbaar werd, ook gerapporteerd als verenigbaar voor linvirale transductie en produceerde menselijke pseudoislets die uitstekende insuline vertoonden uitscheiding in vitro en in vivo na transplantatie11. Collectief, menselijke pseudo-eiland vorming gecombineerd met lentivirale transductie is een eenvoudige en efficiënte benadering om de pathofysiologie van het menselijk eilandje te onderzoeken, wat een waardevol hulpmiddel is om mechanistische studies in menselijke eilandjes uit te voeren.
In het huidige rapport wordt een protocol opgesteld om menselijke pseudoislets te vormen, met lentivirus met behulp van twee in de handel verkrijgbare platformen, een 96-well Ultra-Low-bevestigingsplaat en een micro well-kweek plaat. Beide bereiken een efficiënte modulatie van genexpressie en creëren menselijke pseudoislets die verenigbaar zijn voor downstreambeoordelingen, waaronder statische incubatie en perifusie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series Type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer, 40 micrometer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11530037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Trizol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marien Feld</td>
			<td>Neubauer-Improved Bright line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>11-350-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube, 1.5 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microwell culture plate</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>34411</td>
			<td>Aggrewell 400, 24 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motor-driven pestle</td>
			<td>GAMUT</td>
			<td>#399X644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-tissue culture treated dish, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 mm</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 5 mL</td>
			<td>DOT Scientific,</td>
			<td>667205B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 8-channel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#613-5253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>667210B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P10</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P200</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P1000</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteolytic and collagenolytic enzyme mixture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6965</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagent reservoir, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversible strainer, 37 micrometer</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>27251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket plate centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-14R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SX4750A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin syringe, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra low attachment microplate, 96 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4515</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates

Er zijn verschillende genetische hulpmiddelen beschikbaar om genen in pancreas eilandjes van knaagdieren te moduleren om de functie van eilandje genen voor diabetesonderzoek te ontleden. De gegevens van knaagdieren zijn echter vaak niet volledig gereproduceerd in of toepasbaar op menselijke eilandjes als gevolg van bekende verschillen in de structuur van het eiland en de functie tussen de soorten. Momenteel zijn technieken die beschikbaar zijn voor het manipuleren van genexpressie van menselijke eilandjes zeer beperkt. De introductie van transgen in intacte eilandjes door adenovirus, plasmide en oligonucleotiden lijdt vaak onder lage efficiëntie en hoge toxiciteit. Laag rendement is vooral problematisch in gendownregulatie studies in intacte eilandjes, die een hoge efficiëntie vereisen. Het is bekend dat enzymatisch verspreide eilandjes cellen reaggregate in cultuurvormende sferoïden genaamd pseudoislets. Maat gecontroleerde reaggregation van menselijke eilandjes cellen creëert pseudoislets die dynamische eerste fase insulineafscheiding na langdurige cultuur te handhaven en bieden een venster om efficiënt te introduceren lentivirale korte haarspeld RNA (shRNA) met lage toxiciteit. Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor het maken van menselijke pseudoislets na lentivirale transductie met behulp van twee in de handel verkrijgbare multi well-platen. Het protocol kan gemakkelijk worden uitgevoerd en zorgt voor een efficiënte Downregulatie van genen en de beoordeling van de dynamiek van de insuline secretie met behulp van menselijke eilandje cellen. Zo bieden menselijke pseudoislets met lentivirale gemedieerde genmodulatie een krachtig en veelzijdig model om de genfunctie binnen menselijke eilandjes cellen te beoordelen.

Figuur 1 illustreert de belangrijkste stappen in de productie van pseudoislets met behulp van een 96-well Ultra-Low-bevestigingsplaat en een micro well-kweek plaat. Figuur 2a toont sequentiële veranderingen in de morfologie tijdens de vorming van pseudo-eilandjes van 3 x 103 menselijke eilandje cellen in een 96-goed ultra-lage bevestigingsplaat. Monolayer of losse klonters cellen waargenomen in dag 1 veranderden in va...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates at JoVE.com

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Een protocol om gengemodificeerde menselijke pseudoislets te maken van verspreide menselijke eilandjes cellen die door lentivirus met korte haarspeld RNA (shRNA) worden weergegeven. Dit protocol maakt gebruik van direct beschikbare enzym-en kweekvaten, kan gemakkelijk worden uitgevoerd en produceert genetisch gemodificeerde humane pseudoislets die geschikt zijn voor functionele en morfologische studies.

Lentivirale gemedieerde gen-uitschakeling in humaan pseudo-eilandje bereid in lage bevestigings platen

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Het is moeilijk om de genexpressie in menselijke eilandjes te moduleren, ook een grotere afname van de functionerende menselijke eilandjes vormen grote uitdagingen na modulatie van genexpressie. Door het lentivirus te combineren bemiddelde SHR8 transductie en de vorming van menselijke geschikte eilandjes. Dit protocol maakt een efficiënte downregulatie van een gericht gen mogelijk met behoud van de eilandjesfunctie tijdens langdurige kweek.Om te beginnen, voorzichtig wervelen de scheepvaart fles om eilandjes te houden in schorsing. Breng het verzendmedium met eilandjes over naar een conische centrifugebuis van 50 milliliter. Laat de buis 15 minuten in een biologische veiligheidskast zitten, zodat eilandjes zich op de bodem van de buis nestelen.Verwijder het verzendmedium voorzichtig met behulp van een capillaire pipet zonder de eilandjespellet te verstoren. Schort de eilandjespellet in CMRL-medium opnieuw op met 1% menselijk serumalbumine tot een concentratie van 400 eilandjeequivalent per milliliter. Breng eilandjes in een niet-weefsel cultuur behandeld gerecht en cultuur ze op 37 graden Celsius in een 5% kooldioxide incubator 's nachts.Na 's nachts cultuur, breng menselijke eilandjes in een 15 milliliter conische centrifuge buis, centrifuge op 250 keer g gedurende vijf minuten in een swingende emmer rotor. En het medium aanzuigen met een capillaire pipet zonder de eilandjespellet te verstoren. Was de pellet mijn toe te voegen 10 milliliter PBS aan de buis, meng zachtjes en centrifuge op 250 keer g gedurende vijf minuten.Na centrifugatie, aspirate PBS zonder verstoring van de eilandjes pellet. Stel de pellet opnieuw op in 0,5 milliliter van een voorverwarmd proteolytisch en collagenolytisch enzymmengsel. Pipette vijf keer met behulp van een P1000 pipet om eilandjes te mengen.Incubeer op 37 graden celsius gedurende vijf minuten. Na de incubatie, meng pipet aaien op en neer zachtjes. Controleer op eencellige troebelheid en het aantal vlokken of onverteerd eilandjes.Plaats een 40 micron zeef in een 35 millimeter petrischaal en maak de zeef nat door een milliliter CMRL-medium toe te voegen met 10% warmte geïnactiveerd foetaal runderserum en deprimerend met een spuitzuiger van één milliliter. Breng alle celvering over op de zeef. En verzamel de doorgang in een verse buis van 15 milliliter.Was de buis die wordt gebruikt voor eilandjesvertering met 0,5 milliliter vers CMRL-medium om overgebleven cellen te verzamelen en de was door de zeef te laten gaan. Combineer de doorgang in een buis van 15 milliliter. Herhaal dit één keer.Om onverteerde eilandjes op de zeef te scheiden, drukt u op de zeef met een spuit plunger van één milliliter. Verzamel de pas er weerdoor en was de zeef met verse effen CMRL 1066 medium om alle resterende verteerde eilandjes uit de zeef en de schotel te verwijderen. Voeg de doorgang toe aan de buis van 15 milliliter.Noteer het totale volume van de celsuspensie en neem een 10 microliter aliquot van cellen om het celaantal op een hemocytometer te tellen. Na het centrifugeren van de celsuspensie gedurende vijf minuten bij 200 keer g, verwijder het medium zonder de pellet te storen. Voor het produceren van pseudo-eilandjes met behulp van een 96 goed ultra lage bevestiging plaat, eerst berekenen van het totale volume van de vereiste een keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter van de enkele cel suspensie.Hang vervolgens de eilandjespellet in CMRL-medium opnieuw op met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum, zodat 30 microliter van de celsuspensie 3000 cellen heeft. Breng vervolgens het vereiste volume van de eencellige suspensie over naar een verse buis van 15 milliliter. Bij 250 transductie-eenheden per cel van een lentivirus dat SH-RNA bevat dat zich richt op een gen van belang of een controle.Om de celsuspensie met het virus te mengen, pipet zachtjes vijf keer met een P1000 pipet. Breng vervolgens de gemengde cellen over in een 50 milliliter steriel reagensreservoir bij gebruik van een achtkanaals pipet. Met een achtkanaals pipet of een P200 pipet, afzien van 30 microliter per put van de cel suspensie gemengd met lentivirus in elke put.Vervolgens centrifuge de 96 put plaat in een swingende emmer plaat centrifuge op 270 keer g bij kamertemperatuur gedurende zeven minuten. Cultuur op 37 graden Celsius in een bevochtigde 5%kooldioxide incubator 's nachts. Verwijder na incubatie de 96 putplaat uit de couveuse en plaats deze in de biologische veiligheidskast.Pipette 100 microliter per eilandje van 10% hoge FBSCMRL in een put om het drogen van eilandjes te voorkomen en een week lang te blijven cultuuren. Pipette 100 microliters per put van CMRL medium met 10% warmte geïnactiveerd foetaal runderserum van het reservoir naar de pseudo-eilandjes en pipet op en neer twee tot drie keer zachtjes in de put op te tillen eilandjes omhoog. Dan, aspirate het medium in de put met een pseudo-eilandje en uitwerpen in een 10 centimeter petrischaal.Controleer de plaat onder een lichtmicroscoop om de volledige verwijdering van alle pseudo-eilandjes te garanderen en ga naar downstream experimenten. Om pseudo-eilandjes te produceren met behulp van een 24 goed micro put cultuurplaat, voeg eerst 500 microliter per put van een anti-aanhankelijkheid spoeloplossing. Centrifuge op 1300 keer g gedurende vijf minuten in een swingende emmer plaat centrifuge.Bekijk vervolgens de plaat onder een microscoop om ervoor te zorgen dat luchtbellen uit micro-putten worden verwijderd. In een biologische veiligheidskast, aspirate de anti-aanhankelijkheid spoeloplossing uit de putten. Spoel elk goed met twee milliliter warme vlakte CMRL 1066 medium een keer.Aspirate vervolgens het gewone CMRL 1066-medium en voeg 0,5 milliliter per bron van warme CMRL met 10% warmte geïnactiveerd foetaal runderserum toe aan elk goed gepland voor gebruik. Bepaal het totale aantal cellen dat nodig is voor elke put. Schors de enkele cellen opnieuw in 0,8 milliliter CMRL-medium met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum in een steriele buis van 1,5 milliliter.Om een put van pseudo-eilandje getransduceerd door een lentivirus te creëren, voeg 125 transductie-eenheden per cel aan de eencellige suspensie houden van het volume van het virus onder 0,2 milliliter. Incubeer het cel- en virusmengsel bij 37 graden Celsius met af en toe een uur zachtjes mengen om contact van cellen met het virus mogelijk te maken vóór condensatie van cellen. Pas na een uur het totale volume van de eilandjescel en het virusmengsel aan op één milliliter door CMRL-medium toe te voegen met 10% warmtegeactiveerd foetaal runderserum.Als cellen vormen klontjes na een uur incubatie verspreiden in een enkele cel suspensie door zachte en snelle pipetten twee tot drie keer. Breng de cel suspensie naar een put van de 24 goed micro-well kweekplaat. Onmiddellijk na het leidingen, centrifugeren op 100 keer g bij kamertemperatuur gedurende drie minuten om cellen vast te leggen in alle micro-putten.Observeer onder een microscoop om te controleren of cellen gelijkmatig zijn verdeeld in alle micro-putten. Het is van cruciaal belang om de micro-put plaat onmiddellijk te centrifugeren na het toevoegen van de put mengen van de eilandjelecell suspensie in de putten. Sequentiële veranderingen in de morfologie van pseudo-eilandjes van 3000 menselijke eilandjecellen gemaakt in een 96 goed ultra lage bevestigingsplaat toonden monolayer of losse klonten cellen omgezet in vaste aggregaten met een gladde ronde rand in een week.In tegenstelling, in een micro-well kweekplaat, is de vorming van cel en pseudo-eilandjes van slechts 500 eilandjecellen gewoonlijk zichtbaar binnen vier dagen. De uniforme grootte van pseudo-eilandjes vermindert de variatie binnen een testgroep en maakt statische incubatie met behulp van slechts vijf pseudo-eilandjes per meting mogelijk. De Perry Fusion Assay voor insuline respons toonde menselijke pseudo-eilandjes onderhouden robuuste eerste fase insuline afscheiding in reactie op glucose na zeven dagen van cultuur.De introductie van lentivirus gericht op menselijke vet triglyceride lipase of perilipin vijf genen in een eencellige suspensie zorgt voor een efficiënte en homogene transductie van eilandjecellen en bereikt een zeer efficiënte downregulatie van genen. Het is belangrijk om te onthouden dat de tijd die nodig is voor het verspreiden van menselijke eilandje in enkele cellen wordt beïnvloed door vele factoren zoals: grootte, distributie, en de donor kenmerk. Het is dus belangrijk om veel aandacht te besteden aan het verdwijnen van menselijke eilandjes tijdens de spijsvertering.Gedurende het protocol is het belangrijk om eencellige suspensie voorzichtig te behandelen om celverlies te voorkomen. De menselijke pseudo-eilandjes die worden gemaakt kunnen voor vele toepassingen worden gebruikt om het effect van genmodulatie zoals te bepalen: Westelijke Blot, histologische studie en de metingen van de tarieven van het zuurstofconsumptie. Dit protocol maakt het mogelijk om het laag van gericht gen in de regulatie van eilandje gezondheid en de functie in menselijke eilandjes te beoordelen met behulp van gemeenschappelijke lab ware en eenvoudige technieken.Het gebruik van menselijke eilandjes kan een voorafgaande goedkeuring van een lokale beoordelingscommissie vereisen. Raadpleeg de lokale beoordelingscommissie voor de start van het onderzoek. Lentivirus is geclassificeerd als bioveiligheid niveau twee.Neem contact op met de bioveiligheidscommissie voordat het gebruik van het lentivirus wordt gebruikt.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA Transfectie en EMSA Analyses op vers geïsoleerde Human Villous cytotrofoblasten

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallel Meting van de circadiane klok genexpressie en hormoon in Human primaire celculturen

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Grootbrengen en Double-stranded RNA-gemedieerde gen knock-down in het verbergen Kever,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selectieafhankelijke en onafhankelijke generatie van CRISPR / Cas9-gemedieerde Gene Knockouts in zoogdiercellen

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) Protocol voor lage-overvloed embryonale monsters

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Een standaard methodiek te onderzoeken ter plaatse mutageniteit als een functie van punt mutatie reparatie gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 en SsODN in menselijke cellen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-gemedieerde gerichte integratie In Vivo met behulp van een homologie-gemedieerde einde deelname aan gebaseerde strategie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Een Protocol voor de productie van Integrase-deficiënte lentivirale vectoren voor CRISPR/Cas9-gemedieerde Gene knock-out in cellen verdelen

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-gemedieerde reorganisatie van chromatine lusstructuur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentivirale gemedieerde productie van transgene muizen: een eenvoudige en zeer efficiënte methode voor directe studie van oprichters

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...