Name: lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates
Uploaded: 2019-05-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates at JoVE.com

Ce travail a été soutenu financièrement par les National Institutes of Health to Y.I. (R01-DK090490) et l'American Diabetes Association to Y.I. (1-17-IBS-132). J.A. et Y.I. sont soutenus par le Centre fraternel de recherche sur le diabète de l'Ordre des Aigles. A.B. est soutenu par une subvention de formation des National Institutes of Health (T32NS45549). Les auteurs ont utilisé des îlots pancréatiques humains fournis par le Programme intégré de distribution des îlots (IIDP) financé par le NIDDK à la Ville de l'espoir (2UC4DK098085).

Avant le début des études, une détermination de la recherche sur les sujets humains a été faite par la Commission d'examen institutionnel de l'Université de l'Iowa, qui a déterminé que l'étude ne répondait pas aux critères de recherche sur les sujets humains. Consultez la commission d'examen locale avant le début de l'étude afin de déterminer si la source des îlots et l'étude prévue doivent être approuvées au préalable.
REMARQUE: En règle générale, 1 200...

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	<li>Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta+cell+mass+and+function+in+diabetes:+Recent+advances+in+knowledge+and+technologies+to+understand+disease+pathogenesis.">Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).</li><li>Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+flexible+system+for+glucose+homeostasis.">Stable and flexible system for glucose homeostasis.</a> Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).</li><li>Cryer, P. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+physiological+properties+of+gravity-enforced+reassembled+rat+and+human+pancreatic+pseudo-islets.">Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).</li><li>Caton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+transduction+of+connexin+cDNAs+shows+level-+and+isoform-specific+alterations+in+insulin+secretion+of+primary+pancreatic+beta-cells.">Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells.</a> Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+beta+Cell+Function.">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li><li>Peiris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+human+diabetes-risk+gene+function+with+genetics+and+physiological+assays.">Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays.</a> Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).</li><li>Schlimgen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+Associated+With+Lentiviral+Vector+Exposures+and+Prevention+Strategies.">Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies.</a> Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+islet+for+improved+performance+by+optimized+reaggregation+in+alginate+gel+beads.">Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).</li><li>Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+re-aggregated+human+pancreatic+islets+for+secondary+drug+screening.">Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening.</a> British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).</li><li>Hilderink, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+aggregation+of+primary+human+pancreatic+islet+cells+leads+to+glucose-responsive+pseudoislets+comparable+to+native+islets.">Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).</li><li>Saunders, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectonucleoside+Triphosphate+Diphosphohydrolase-3+Antibody+Targets+Adult+Human+Pancreatic+beta+Cells+for+In+Vitro+and+In+Vivo+Analysis.">Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis.</a> Cell Metabolism. (18), (2018).</li><li>Reissaus, C. A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reestablishment+of+Glucose+Inhibition+of+Glucagon+Secretion+in+Small+Pseudoislets.">Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets.</a> Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).</li></ol>

Ici, un protocole détaillé pour générer des pseudoislets humains qui sont transducés par lentivirus à l'aide d'une plaque d'attachement ultra-faible de 96 puits ou d'une plaque de culture de micropuits est présenté. Pseudoislets ont été rapportés pour démontrer la morphologie et les fonctions sécrétrices semblables aux îlots humains indigènes et peuvent être cultivés pendant une période prolongée in vitro5,11,18</s...

La perte de masse cellulaire bêta fonctionnelle est la pathologie centrale pour le diabète de type 1 et de type 21. Alors que les cellules bêta sont les producteurs d'insuline dans les îlots pancréatiques, la communication entre les cellules bêta et les cellules non bêta joue un rôle critique dans la régulation de la sécrétion d'insuline2. En outre, la dysrégulation de la sécrétion de glucagon contribue à l'hyperglycémie dans le diabète3. Ainsi, il y a un grand intérêt à moduler l'expression génique des cellules dans les îlots pancréatiques pour aborder le mécanisme derrière le développement du dysfonctionnement d'îlots dans le diabète. Une variété d'approches comprenant des souris transgéniques sont disponibles pour moduler l'expression de gène des îlots de souris. Cependant, les îlots humains et de souris montrent l'innervation distincte, la distribution cellulaire, le rapport de bêta aux cellules alpha, et la réponse aux sécréagogues4. Par conséquent, l'évaluation directe de la fonction génique dans les îlots humains est extrêmement importante pour comprendre la pathophysiologie des îlots pancréatiques humains.
Le vecteur adénoviral est le vecteur viral le plus largement utilisé pour transduire les îlots pancréatiques in vitro en raison de la forte efficacité de la transduction dans les cellules non-divisantes. Cependant, l'adénovirus ne pénètre pas efficacement au cœur des îlots, en particulier dans les îlots humains5, et est cytotoxique à fortes doses6. En comparaison, le vecteur lentiviral est moins cytotoxique et délivre des gènes exogènes de façon permanente dans le chromosome des cellules post-mitotiques, ce qui en fait un véhicule largement testé pour la thérapie génique7. Cependant, la capacité du lentivirus à pénétrer le noyau des îlots humains intacts est également limitée, nécessitant ainsi une dispersion partielle par digestion enzymatique pour augmenter l'efficacité de la transduction8. La mise en garde avec la dispersion des îlots humains intacts est l'interruption de la communication cellule-cellule et cellule-matrice,qui compromet la régulation dynamique de la sécrétion d'insuline critique pour le maintien de l'homéostasie de glucose chez l'homme 9. Ainsi, il a été difficile d'évaluer l'impact de la modulation des gènes sur la régulation dynamique de la fonction des îlots dans un modèle d'îlots humains.
On sait que les cellules des îlots dispersés des îlots humains et des rongeurs se réagroupent de façon autonome en structures semblables à des îlots appelées « pseudoislets ». Pseudoislets montrent la distribution des cellules bêta et non bêta similaire aux îlots indigènes10,11. En outre, après la culture à long terme, les îlots indigènes perdent progressivement la sécrétion robuste d'insuline de première phase5,10,11,12. Pourtant, les pseudoislets ont démontré une meilleure conservation de la sécrétion d'insuline de première phase en réponse au glucose comparé aux îlots indigènes après la même période de culture5. En plus d'avoir une meilleure conservation de la sécrétion d'insuline, la réagrégation contrôlée par la taille des cellules des frayons humains dans les plaques à faible attachement11 offre une fenêtre d'opportunité pour introduire des vecteurs de lentivirus avant leur réaggrégement dans pseudoislets. Plusieurs études ont démontré l'utilité des pseudoislets combinés à la transduction médiée par lentiviral. Caton et coll.13 ont signalé que l'introduction de la protéine fluorescente verte (GFP) exprimant le lentivirus avait peu d'effet sur la sécrétion d'insuline tout en atteignant l'expression homogène du GFP dans les pseudoislets de rat comparés au contrôle non-infecté. Ils ont également démontré l'effet spécifique de différentes connexines sur la sécrétion d'insuline en surexprimant connexins 32, 36, et 43 par l'intermédiaire de lentivirus13. Les pseudoislets humains préparés avec une plaque d'attachement ultra-faible de 96 puits disponible dans le commerce ont démontré que la surexpression par le facteur de transcription SIX3 améliore la sécrétion d'insuline évaluée par incubation statique14. Récemment, des pseudoislets humains préparés avec une plaque d'attachement ultra-faible de 96 puits ont été utilisés pour réguler la glucokinase par l'intermédiaire de l'ARN lentiviral à épingle à cheveux courte (arsh) comme preuve de principe pour montrer que la sécrétion d'insuline stimulée par le glucose est réduite, tandis que La sécrétion d'insuline stimulée par KCl a été préservée5. L'étude a également démontré que les pseudoislets humains sont semblables aux îlots indigènes dans l'expression des gènes et les profils sécréteurs, soutenant davantage l'utilité des pseudoislets humains pour disséquer la régulation de la fonction d'îlots5. Bien que la perifusion n'ait pas été effectuée, une plaque de culture de micropuits bioengineered qui est récemment devenue commercialement disponible, a été également rapportée pour être compatible pour la transduction lentivirale et a produit des pseudoislets humains qui ont exhibé l'excellente insuline sécrétion in vitro et in vivo après la transplantation11. Collectivement, la formation de pseudoislet humain combinée à la transduction lentivirale est une approche simple et efficace pour étudier la pathophysiologie humaine d'îlots, fournissant un outil valable pour effectuer des études mécanistes dans les îlots humains.
Dans le rapport actuel, un protocole pour former des pseudoislets humains transduiré s'est transduifait avec le lentivirus à l'aide de deux plates-formes disponibles dans le commerce, une plaque d'attachement ultra-faible de 96 puits et une plaque de culture de micropuits est présentée. Les deux permettent de modulation efficace de l'expression génique et de créer des pseudoislets humains compatibles pour les évaluations en aval, y compris l'incubation statique et la perifusion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series Type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer, 40 micrometer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11530037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Trizol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marien Feld</td>
			<td>Neubauer-Improved Bright line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>11-350-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube, 1.5 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microwell culture plate</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>34411</td>
			<td>Aggrewell 400, 24 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motor-driven pestle</td>
			<td>GAMUT</td>
			<td>#399X644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-tissue culture treated dish, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 mm</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 5 mL</td>
			<td>DOT Scientific,</td>
			<td>667205B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 8-channel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#613-5253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>667210B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P10</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P200</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P1000</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteolytic and collagenolytic enzyme mixture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6965</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagent reservoir, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversible strainer, 37 micrometer</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>27251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket plate centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-14R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SX4750A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin syringe, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra low attachment microplate, 96 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4515</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates

Divers outils génétiques sont disponibles pour moduler les gènes dans les îlots pancréatiques des rongeurs pour disséquer la fonction des gènes des îlots pour la recherche sur le diabète. Cependant, les données obtenues à partir d'îlots de rongeurs ne sont souvent pas entièrement reproduites ou applicables aux îlots humains en raison de différences bien connues dans la structure et la fonction des îlots entre les espèces. Actuellement, les techniques qui sont disponibles pour manipuler l'expression génique des îlots humains sont très limitées. L'introduction du transgène dans les îlots intacts par l'adénovirus, le plasmide et les oligonucléotides souffre souvent d'une faible efficacité et d'une toxicité élevée. La faible efficacité est particulièrement problématique dans les études de dérégulation des gènes dans les îlots intacts, qui exigent une grande efficacité. On sait que les cellules d'îlots enzymatiquement dispersées se réagrégent dans la culture formant des sphéroïdes appelés pseudoislets. La réaggrége des cellules humaines d'îlots contrôlées par la taille crée des pseudoislets qui maintiennent la sécrétion dynamique d'insuline de première phase après une culture prolongée et fournissent une fenêtre pour introduire efficacement l'ARN lentiviral à épingle à cheveux courte (ARSH) avec une faible toxicité. Ici, un protocole détaillé pour la création des pseudoislets humains après la transduction lentivirale utilisant deux plaques multiwell disponibles dans le commerce est décrit. Le protocole peut être facilement exécuté et permet une régulation efficace des gènes et l'évaluation du dynamisme de la sécrétion d'insuline à l'aide de cellules d'înets humains. Ainsi, les pseudoislets humains avec la modulation médiée de gène lentiviral fournissent un modèle puissant et polyvalent pour évaluer la fonction de gène dans les cellules humaines d'îlots.

La figure 1 illustre les étapes clés de la production de pseudoislets à l'aide d'une plaque d'attachement ultra-faible de 96 puits et d'une plaque de culture de micropuits. La figure 2a montre des changements séquentiaux dans la morphologie pendant la formation de pseudoislets à partir de 3 x 103 cellules d'îlots humains dans une plaque d'attachement ultra-faible de 96 puits. Monolayer ou amas lâches de cellules...

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Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Un protocole pour créer des pseudoislets humains modifiés de gène des cellules humaines dispersées d'îlots qui sont transduced par lentivirus portant l'ARN court d'épingle à cheveux (shRNA) est présenté. Ce protocole utilise des vaisseaux d'enzymes et de culture facilement disponibles, peut être exécuté facilement, et produit des pseudoislets humains génétiquement modifiés appropriés pour des études fonctionnelles et morphologiques.

Le silençage du gène médiévirus lentiviral dans le pseudoislet humain préparé dans les plaques à faible attachement

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Il est difficile de moduler l’expression des gènes dans les îlots humains, aussi un plus grand déclin des îlots humains fonctionnels posent des défis majeurs après la modulation de l’expression des gènes. En combinant le lentivirus médié transduction SHR8 et la formation d’îlots humains appropriés. Ce protocole permet une downregulation efficace d’un gène ciblé tout en préservant la fonction des îlots pendant la culture prolongée.Pour commencer, faites pivoter doucement la bouteille d’expédition pour garder les îlots en suspension. Transférer le milieu d’expédition contenant des îlots dans un tube de centrifugeuse conique de 50 millilitres. Laissez le tube reposer dans une armoire de sécurité biologique pendant 15 minutes afin que les îlots se déposent au fond du tube.Retirer délicatement le milieu d’expédition à l’aide d’une pipette capillaire sans déranger la pastille de l’îlot. Suspendre à nouveau la pastille d’îlot dans le milieu CMRL avec 1% d’albumine de sérum humain à une concentration de 400 islet équivalent par millilitre. Transférez les îlots dans un plat traité par culture non tissulaire et culturez-les à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5 % pendant la nuit.Après la culture de nuit, transférer les îlots humains dans un tube de centrifugeuse conique de 15 millilitres, centrifugeuse à 250 fois g pendant cinq minutes dans un rotor balançant seau. Et aspirer le milieu avec une pipette capillaire sans déranger la pastille de l’îlot. Laver la pastille mon ajout de 10 millilitres de PBS au tube, mélanger doucement et centrifugeuse à 250 fois g pendant cinq minutes.Après centrifugation, aspirer PBS sans déranger la pastille de l’îlot. Suspendre à nouveau la pastille en 0,5 millilitres d’un mélange d’enzymes protéolytiques et collagènes préchauffées. Pipette cinq fois à l’aide d’une pipette P1000 pour mélanger les îlots.Incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l’incubation, mélanger la pipette en caressant de haut en bas doucement. Vérifiez s’il y a une seule nébulosité cellulaire et le nombre de flocons ou d’îlots non digérés.Placer une passoire de 40 microns dans une boîte de Pétri de 35 millimètres et mouiller la passoire en ajoutant un millilitre de milieu CMRL avec un sérum bovin fœtal inactivé à 10 % de chaleur et déprimant avec un piston à seringues d’un millilitre. Transférer toute la suspension cellulaire sur le dessus de la passoire. Et recueillir le passage à travers dans un tube frais de 15 millilitres.Lavez le tube utilisé pour la digestion des îlots avec 0,5 millilitres de milieu CMRL frais pour recueillir les restes de cellules et passer le lavage à travers la passoire. Mélanger le passage dans un tube de 15 millilitres. Répétez une fois.Pour dissocier les îlots non digérés qui restent sur la passoire, appuyez sur la passoire à l’effet d’un piston à seringues d’un millilitre. Recueillir le passage à nouveau et laver la passoire avec frais plaine CMRL 1066 milieu pour enlever tous les îlots digérés restants de la passoire et le plat. Ajouter le passage dans le tube de 15 millilitres.Enregistrez le volume total de la suspension cellulaire et prenez un aliquot de 10 microlitres de cellules pour compter le numéro de cellule sur un hémocytomètre. Après avoir centrifugé la suspension cellulaire pendant cinq minutes à 200 fois g, retirer le milieu sans déranger la pastille. Pour produire des pseudo-îlots à l’aide d’une plaque de fixation 96 puits ultra faible, calculez d’abord le volume total des cellules nécessaires une fois 10 à la cinquième par millilitre de la suspension à cellule unique.Ensuite, suspendre à nouveau la pastille d’îlot dans le milieu CMRL avec 10% de chaleur inactivée sérum bovin fœtal de sorte que 30 microlitres de la suspension cellulaire a 3000 cellules. Ensuite, transférez le volume requis de la suspension à cellule unique dans un tube frais de 15 millilitres. À 250 unités de transduction par cellule d’un lentivirus contenant de l’ARN SH ciblant un gène d’intérêt ou un contrôle.Pour mélanger la suspension cellulaire avec le virus, pipette doucement cinq fois avec une pipette P1000. Transférez ensuite les cellules mélangées dans un réservoir stérile de reagent de 50 millilitres si vous utilisez une pipette à huit canaux. À l’aide d’une pipette à huit canaux ou d’une pipette P200, distribuez 30 microlitres par puits de suspension cellulaire mélangés à du lentivirus dans chaque puits.Ensuite, centrifuger la plaque de puits 96 dans une centrifugeuse de plaque baquet balançante à 270 fois g à température ambiante pendant sept minutes. Culture à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié de dioxyde de carbone de 5% pendant la nuit. Après l’incubation, retirer la plaque de puits 96 de l’incubateur et la placer dans l’armoire de sécurité biologique.Pipette 100 microlitres par îlot de 10% de haut FBSCMRL dans un puits pour empêcher le séchage des îlots et continuer à la culture pendant une semaine. Pipette 100 microlitres par puits de milieu CMRL avec 10% de sérum bovin fœtal inactivé de chaleur du réservoir aux pseudo-îlots et pipette de haut en bas deux à trois fois doucement dans le puits pour soulever les îlots vers le haut. Ensuite, aspirez le milieu dans le puits contenant un pseudo-îlot et éjectez-le dans une boîte de Pétri de 10 centimètres.Vérifiez la plaque au microscope léger pour vous assurer de l’enlèvement complet de tous les pseudo-îlots et procédez à des expériences en aval. Pour produire des pseudo-îlots à l’aide d’une plaque de culture de puits de puits de 24 puits, ajoutez d’abord 500 microlitres par puits d’une solution de rinçage anti-adhérence. Centrifugeuse à 1300 fois g pendant cinq minutes dans une centrifugeuse de plaque de seau balançante.Ensuite, observez la plaque au microscope pour vous assurer que les bulles d’air sont retirées des micro-puits. Dans un cabinet de sécurité biologique, aspirer la solution de rinçage anti-adhérence des puits. Rincez chaque puits avec deux millilitres de CMRL chaud uni 1066 moyen une fois.Ensuite, aspirez le milieu carré cmrl 1066 et ajoutez 0,5 millilitre par puits de CMRL chaud avec 10% de sérum bovin fœtal inactivé à chaque bien planifié pour une utilisation. Déterminer le nombre total de cellules nécessaires pour chaque puits. Suspendre à nouveau les cellules individuelles dans 0,8 millilitres de milieu CMRL avec un sérum bovin fœtal inactivé à 10 % dans un tube stérile de 1,5 millilitre.Pour créer un puits de pseudo-îlot transduit par un lentivirus, ajoutez 125 unités de transduction par cellule à la suspension à cellule unique en maintenant le volume du virus en dessous de 0,2 millilitres. Incuber le mélange cellulaire et le mélange de virus à 37 degrés Celsius avec mélange doux occasionnel pendant une heure pour permettre le contact des cellules avec le virus avant la condensation des cellules. Après une heure, ajuster le volume total du mélange de cellules d’îlots et de virus à un millilitre en ajoutant le milieu CMRL avec 10 % de sérum bovin fœtal inactivé à chaleur.Si les cellules forment des touffes après une incubation d’une heure se dispersent en une seule suspension cellulaire par pipetting doux et rapide deux à trois fois. Transférer la suspension cellulaire dans un puits de la plaque de culture de 24 puits de micro-puits. Immédiatement après le pipetage, centrifugeuse à 100 fois g à température ambiante pendant trois minutes pour capturer les cellules dans tous les micro-puits.Observez au microscope pour vérifier que les cellules sont réparties uniformément dans tous les micro-puits. Il est essentiel de centrifuger la plaque de micro-puits immédiatement après avoir ajouté le puits mélangeant la suspension à cellule unique de l’îlot dans les puits. Les changements séquentiels dans la morphologie des pseudo-îlots de 3000 cellules humaines d’îlot créées dans une plaque d’attachement 96 puits ultra bas ont montré des touffes monolayer ou lâches de cellules transformées en agrégats solides avec une bordure ronde lisse en une semaine.En revanche, dans une plaque de culture micro-puits, la formation de cellules et de pseudo-îlots à partir de seulement 500 cellules d’îlots est généralement visible dans les quatre jours. La taille uniforme des pseudo-îlots réduit la variation au sein d’un groupe d’essai et permet l’incubation statique en utilisant aussi peu que cinq pseudo-îlots par mesure. L’essai de fusion de Perry pour la réponse d’insuline a montré que les pseudo-îlots humains ont maintenu la sécrétion robuste d’insuline de première phase en réponse au glucose après sept jours de culture.L’introduction du lentivirus ciblant la lipase adipeuse adipeuse humaine ou perilipin cinq gènes en une seule suspension cellulaire assure la transduction efficace et homogène des cellules des îlots et permet une downregulation très efficace des gènes. Il est important de se rappeler que le temps nécessaire pour disperser l’îlot humain en cellules individuelles est affecté par de nombreux facteurs tels que: la taille, la distribution et la caractéristique du donneur. Il est donc important d’accorder une attention particulière à la disparition des îlots humains pendant la digestion.Tout au long du protocole, il est important de manipuler la suspension à cellule unique doucement pour éviter la perte de cellules. Les pseudo-îlots humains créés peuvent être utilisés pour de nombreuses applications afin de déterminer l’effet de la modulation des gènes tels que : la tache occidentale, l’étude histologique et les mesures des taux de consommation d’oxygène. Ce protocole permet d’évaluer le faible teneur en gènes ciblés dans la régulation de la santé des îlots et la fonction dans les îlots humains en utilisant des produits de laboratoire communs et des techniques simples.L’utilisation d’îlots humains peut nécessiter l’approbation préalable d’une commission d’examen locale. Veuillez consulter le comité d’examen local avant le début de l’étude. Le lentivirus est classé comme biosécurité niveau deux.Contactez le comité de biosécurité avant le début de l’utilisation du lentivirus.

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