Name: lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates
Uploaded: 2019-05-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health to Y.I. (R01-DK090490) und der American Diabetes Association to Y.I. (1-17-IBS-132) finanziell unterstützt. J.A. und Y.I. werden vom Fraternal Order of Eagles Diabetes Research Center unterstützt. A.B. wird durch ein Stipendium der National Institutes of Health (T32NS45549) unterstützt. Die Autoren nutzten menschliche Pankreasinseln, die vom NIDDK-finanzierten Integrated Islet Distribution Program (IIDP) in City of Hope (2UC4DK098085) bereitgestellt wurden.

Vor Studienbeginn wurde eine Forschungsbestimmung für Humansubjekte durch das Institutional Review Board der University of Iowa getroffen, der feststellte, dass die Studie die Kriterien für die Forschung an menschlichen Probanden nicht erfüllte. Konsultieren Sie vor Beginn der Studie das örtliche Prüfungsgremium, um festzustellen, ob die Quelle der Inselchen und die geplante Studie einer vorherigen Genehmigung bedarf.
HINWEIS: Für die Bildung von 192 Pseudoislets in der ...

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	<li>Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta+cell+mass+and+function+in+diabetes:+Recent+advances+in+knowledge+and+technologies+to+understand+disease+pathogenesis.">Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).</li><li>Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+flexible+system+for+glucose+homeostasis.">Stable and flexible system for glucose homeostasis.</a> Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).</li><li>Cryer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Glucagon+in+the+pathogenesis+of+hypoglycemia+and+hyperglycemia+in+diabetes.">Minireview: Glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes.</a> Endocrinology. 153 (3), 1039-1048 (2012).</li><li>Arrojo e Drigo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+architecture+of+the+islet+of+Langerhans:+a+focused+cross-species+assessment.">New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment.</a> Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).</li><li>Harata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+shRNA+via+lentivirus+in+human+pseudoislets+provides+a+model+to+test+dynamic+regulation+of+insulin+secretion+and+gene+function+in+human+islets.">Delivery of shRNA via lentivirus in human pseudoislets provides a model to test dynamic regulation of insulin secretion and gene function in human islets.</a> Physiological Reports. 6 (20), e13907 (2018).</li><li>Barbu, A. R., Akusjarvi, G., Welsh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+transduction+of+human+pancreatic+islets:+importance+of+adenoviral+genome+for+cell+viability+and+association+with+a+deficient+antiviral+response.">Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response.</a> Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).</li><li>Hughes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+to+improve+pancreatic+islet+transplantation+for+Type+1+diabetes+mellitus.">Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus.</a> Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).</li><li>Jimenez-Moreno, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+High+Efficiency+Intra-Islet+Transduction+Protocol+Using+Lentiviral+Vectors.">A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors.</a> Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).</li><li>Bonora, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+correlates+of+post-prandial+hyperglycaemia+in+a+large+sample+of+patients+with+type+2+diabetes+mellitus.">Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).</li><li>Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. L., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+reassociation+of+dispersed+adult+rat+pancreatic+islet+cells+into+aggregates+with+three-dimensional+architecture+typical+of+native+islets.">Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets.</a> Diabetes. 36 (7), 783-790 (1987).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+pseudoislets+form+efficiently+from+donated+tissue,+compare+favourably+with+native+islets+in+vitro+and+restore+normoglycaemia+in+mice.">Bioengineered human pseudoislets form efficiently from donated tissue, compare favourably with native islets in vitro and restore normoglycaemia in mice.</a> Diabetologia. 61 (9), 2016-2029 (2018).</li><li>Zuellig, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+physiological+properties+of+gravity-enforced+reassembled+rat+and+human+pancreatic+pseudo-islets.">Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).</li><li>Caton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+transduction+of+connexin+cDNAs+shows+level-+and+isoform-specific+alterations+in+insulin+secretion+of+primary+pancreatic+beta-cells.">Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells.</a> Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+beta+Cell+Function.">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li><li>Peiris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+human+diabetes-risk+gene+function+with+genetics+and+physiological+assays.">Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays.</a> Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).</li><li>Schlimgen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+Associated+With+Lentiviral+Vector+Exposures+and+Prevention+Strategies.">Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies.</a> Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+islet+for+improved+performance+by+optimized+reaggregation+in+alginate+gel+beads.">Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).</li><li>Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+re-aggregated+human+pancreatic+islets+for+secondary+drug+screening.">Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening.</a> British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).</li><li>Hilderink, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+aggregation+of+primary+human+pancreatic+islet+cells+leads+to+glucose-responsive+pseudoislets+comparable+to+native+islets.">Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).</li><li>Saunders, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectonucleoside+Triphosphate+Diphosphohydrolase-3+Antibody+Targets+Adult+Human+Pancreatic+beta+Cells+for+In+Vitro+and+In+Vivo+Analysis.">Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis.</a> Cell Metabolism. (18), (2018).</li><li>Reissaus, C. A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reestablishment+of+Glucose+Inhibition+of+Glucagon+Secretion+in+Small+Pseudoislets.">Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets.</a> Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).</li></ol>

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung menschlicher Pseudoislets vorgestellt, die mit einer 96-Well-Ultra-Low-Attachment-Platte oder einer Mikrowell-Kulturplatte durch Lentivirus transduziert werden. Pseudoislets sollen Morphologie und sekretotische Funktionen ähnlich wie einheimische menschliche Inselchen demonstrieren und können über einen längeren Zeitraum in vitrokultiviertwerden 5,11,18. Im Gegensatz zu ein...

Der Verlust der funktionellen Beta-Zellmasse ist die zentrale Pathologie für Typ-1- und Typ-2-Diabetes1. Während Betazellen die Produzenten von Insulin in Pankreasinseln sind, spielt die Kommunikation zwischen Betazellen und Nicht-Beta-Zellen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Insulinsekretion2. Darüber hinaus trägt die Dysregulation der Glucagon-Sekretion zu Hyperglykämie bei Diabetes3bei. Daher besteht ein starkes Interesse daran, die Genexpression von Zellen innerhalb der Pankreasinseln zu modulieren, um den Mechanismus hinter der Entwicklung von Inselfunktionsstörungen bei Diabetes anzugehen. Es gibt eine Vielzahl von Ansätzen, einschließlich transgener Mäuse, um die Genexpression von Mausinseln zu modulieren. Jedoch, menschliche und Maus-Inseln zeigen deutliche Innervation, Zellverteilung, Verhältnis von Beta-Alpha-Zellen, und Reaktion auf Sekretagogen4. Daher ist die direkte Beurteilung der Genfunktion bei menschlichen Inseln äußerst wichtig für das Verständnis der Pathophysiologie menschlicher Pankreasinseln.
Adenoviraler Vektor ist der am weitesten verbreitete virale Vektor, um Pankreasinseln in vitro zu transducen, da die Transduktion in nicht teilenden Zellen hoch ist. Jedoch, Adenovirus dringt nicht in den Kern der Inselchen effizient, vor allem bei menschlichen Inseln5, und ist zytotoxisch bei hohen Dosen6. Im Vergleich dazu ist der lentivirale Vektor weniger zytotoxisch und liefert exogene Gene dauerhaft in das Chromosom postmitotischer Zellen, was ihn zu einem weithin getesteten Vehikel für die Gentherapiemacht 7. Allerdings ist auch die Fähigkeit des Lentivirus, in den Kern intakter menschlicher Inseln einzudringen, begrenzt, so dass eine partielle Dispersion durch enzymatische Verdauung erforderlich ist, um die Transduktionseffizienz zu erhöhen8. Der Vorbehalt mit der Dispersion intakter menschlicher Inseln ist die Unterbrechung der Zellzell- und Zellmatrixkommunikation, die die dynamische Regulierung der Insulinsekretion beeinträchtigt, die für die Aufrechterhaltung der Glukosehomöostase beim Menschen entscheidend ist9. Daher war es schwierig, die Auswirkungen der Genmodulation auf die dynamische Regulierung der Inselfunktion in einem Modell menschlicher Inselchen zu bewerten.
Es ist bekannt, dass sich zerstreute Inselzellen von menschlichen und Nagetierinseln autonom zu inselähnlichen Strukturen, sogenannten "Pseudoislets", zusammenschließen. Pseudoislets zeigen Beta- und Nicht-Beta-Zellverteilung ähnlich wie native Inselchen10,11. Zusätzlich verlieren einheimische Inselchen nach langfristiger Kultur nach und nach robuste Sendephase Insulinsekretion5,10,11,12. Dennoch zeigten Pseudoislets eine bessere Konservierung der Insulinsekretion der ersten Phase als Reaktion auf Glukose im Vergleich zu einheimischen Inselchen nach der gleichen Kulturperiode5. Neben einer besseren Konservierung der Insulinsekretion bietet die größengesteuerte Reaggregation menschlicher Isletzellen in niedrigen Anbauplatten11 eine Möglichkeit, Lentivirus-Vektoren vor ihrer Reaggregation in Pseudoislets. Mehrere Studien haben den Nutzen von Pseudoislets in Kombination mit lentiviral vermittelter Transduktion nachgewiesen. Caton et al.13 berichteten, dass die Einführung des grünen fluoreszierenden Proteins (GFP), das Lentivirus ausdrückt, wenig Einfluss auf die Insulinsekretion hatte, während eine homogene Expression von GFP in Rattenpseudoislets im Vergleich zur nicht infizierten Kontrolle erreicht wurde. Sie zeigten auch die spezifische Wirkung verschiedener Connexine auf die Insulinsekretion, indem sie die Connexine 32, 36 und 43 über das Lentivirus13überexzieren. Menschliche Pseudoislets, die mit einer handelsüblichen 96-Well-Ultra-Low-Attachment-Platte hergestellt wurden, zeigten, dass die lentiviral-vermittelte Überexpression des Transkriptionsfaktors SIX3 die Insulinsekretion verbessert, die durch statische Inkubation bewertet wird14. Kürzlich wurden menschliche Pseudoislets, die mit einer 96-well ultra-niedrigen Anbauplatte hergestellt wurden, verwendet, um Glukokkinase über lentivirale Kurzhaarnadel-RNA (shRNA) als Beweis für den Nachweis zu regulieren, dass die glukosestimulierte Insulinsekretion reduziert wird, während KCl-stimulierte Insulinsekretion wurde5erhalten. Die Studie zeigte auch, dass menschliche Pseudoislets nativen Inselchen in Genexpression und sekretoreichen Profilen ähneln, was den Nutzen menschlicher Pseudoislets zur Sezieren der Regulation der Inselfunktion5weiter unterstützt. Obwohl die Perifusion nicht durchgeführt wurde, wurde eine biotechnologische Mikrobrunnen-Kulturplatte, die vor kurzem kommerziell erhältlich war, auch als kompatibel für lentivirale Transduktion und produzierte menschliche Pseudoislets, die ausgezeichnete Insuline Sekretion in vitro und in vivo nach Transplantation11. Zusammen genommen ist die Bildung menschlicher Pseudoislet in Kombination mit der lentiviralen Transduktion ein einfacher und effizienter Ansatz zur Untersuchung der Pathophysiologie der menschlichen Insel und stellt ein wertvolles Werkzeug zur Durchführung mechanistischer Studien an menschlichen Inseln bereit.
Im aktuellen Bericht wird ein Protokoll zur Bildung menschlicher Pseudoislets, die mit Lentivirus über zwei kommerziell erhältliche Plattformen, eine 96-Well ultra-low Attachment Platte und eine Microwell-Kulturplatte transduziert wurden, vorgestellt. Beide erreichen eine effiziente Modulation der Genexpression und schaffen menschliche Pseudoislets, die für nachgelagerte Bewertungen, einschließlich statischer Inkubation und Perifusion, kompatibel sind.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series Type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer, 40 micrometer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11530037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Trizol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marien Feld</td>
			<td>Neubauer-Improved Bright line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>11-350-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube, 1.5 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microwell culture plate</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>34411</td>
			<td>Aggrewell 400, 24 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motor-driven pestle</td>
			<td>GAMUT</td>
			<td>#399X644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-tissue culture treated dish, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 mm</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 5 mL</td>
			<td>DOT Scientific,</td>
			<td>667205B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 8-channel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#613-5253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>667210B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P10</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P200</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P1000</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteolytic and collagenolytic enzyme mixture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6965</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagent reservoir, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversible strainer, 37 micrometer</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>27251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket plate centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-14R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SX4750A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin syringe, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra low attachment microplate, 96 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4515</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates

Verschiedene genetische Werkzeuge stehen zur Verfügung, um Gene in Pankreasinseln von Nagetieren zu modulieren, um die Funktion von Inselgenen für die Diabetesforschung zu sezieren. Die von Nagetierinseln gewonnenen Daten werden jedoch aufgrund bekannter Unterschiede in der Inselstruktur und -funktion zwischen den Arten oft nicht vollständig auf menschlichen Inseln reproduziert oder sind auf sie anwendbar. Derzeit sind Techniken, die zur Verfügung stehen, um die Genexpression menschlicher Inseln zu manipulieren, sehr begrenzt. Die Einführung von Transgen entumlässt durch Adenovirus, Plasmid und Oligonukleotide in intakte Inseln und leidet häufig unter geringer Effizienz und hoher Toxizität. Eine geringe Effizienz ist besonders problematisch in Gendownregulationsstudien an intakten Inselchen, die eine hohe Effizienz erfordern. Es ist bekannt, dass enzymatisch dispergierte Inselzellen sich in kulturbildenden Sphäroiden, die als Pseudoislets bezeichnet werden, neu anaggregieren. Die größengesteuerte Reaggregation menschlicher Inselzellen erzeugt Pseudoislets, die die dynamische Insulinsekretion der ersten Phase nach längerer Kultur aufrechterhalten und ein Fenster zur effizienten Einführung von lentiviraler Kurzhaarnadel-RNA (shRNA) mit geringer Toxizität bieten. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Herstellung menschlicher Pseudoislets nach lentiviraler Transduktion mit zwei handelsüblichen Mehrwellplatten beschrieben. Das Protokoll kann leicht durchgeführt werden und ermöglicht eine effiziente Downregulation von Genen und die Beurteilung der Dynamik der Insulinsekretion mit menschlichen Ischenzellen. So bieten menschliche Pseudoislets mit lentiviral vermittelter Genmodulation ein leistungsfähiges und vielseitiges Modell zur Beurteilung der Genfunktion in menschlichen Inselzellen.

Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Schritte bei der Herstellung von Pseudoislets mit einer 96-well ultra-niedrigen Befestigungsplatte und einer Mikrowell-Kulturplatte. Abbildung 2a zeigt sequenzielle Veränderungen in der Morphologie bei der Bildung von Pseudoislets aus 3 x 103 menschlichen Inselzellen in einer 96-well ultraniedrigen Befestigungsplatte. Monolayer oder lose Zellklumpen, die am tag 1 beobachtet wurden, ve...

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Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Ein Protokoll zur Erstellung genmodifizierter menschlicher Pseudoislets aus dispergierten menschlichen Inselzellen, die durch Lentivirus mit kurzer Haarnadel-RNA (shRNA) transduziert werden, wird vorgestellt. Dieses Protokoll verwendet leicht verfügbare Enzym- und Kulturgefäße, kann leicht durchgeführt werden und produziert genetisch veränderte menschliche Pseudoislets, die für funktionelle und morphologische Studien geeignet sind.

Lentiviral vermittelte Gen-Silencing in humanem Pseudoislet in niedrigen Befestigungsplatten zubereitet

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Es ist schwierig, die Genexpression in menschlichen Inseln zu modulieren, auch ein größerer Rückgang der funktionierenden menschlichen Inseln stellt nach der Modulation der Genexpression große Herausforderungen dar. Durch die Kombination der lentivirus vermittelten SHR8-Transduktion und der Bildung von humangeeigneten Inseln. Dieses Protokoll ermöglicht eine effiziente Downregulation eines zielgerichteten Gens bei gleichzeitiger Erhaltung der Isletfunktion während einer längeren Kultur.Zu Beginn, sanft wirbeln Sie die Versandflasche, um Inselchen in Suspension zu halten. Übertragen Sie das Versandmittel mit Inselchen auf ein 50 Milliliter konisches Zentrifugenrohr. Lassen Sie das Rohr 15 Minuten in einem biologischen Sicherheitsschrank sitzen, damit sich die Inselchen an der Unterseite des Rohres absetzen.Entfernen Sie das Versandmedium vorsichtig mit einer Kapillarpipette, ohne das Isletpellet zu stören. Setzen Sie das Isletpellet in CMRL-Medium mit 1%humanem Serumalbumin auf eine Konzentration von 400 Isletäquivalent enjekten pro Milliliter wieder aus. Übertragen Sie Inselchen in eine nicht-Gewebekultur behandelte Schale und Kultur sie bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator über Nacht.Nach der Nachtkultur menschliche Inselchen in ein 15 Milliliter kegelförmiges Zentrifugenrohr, Zentrifuge bei 250-fachm g für fünf Minuten in einem schwingenden Schaufelrotor übertragen. Und das Medium mit einer Kapillarpipette ansaugen, ohne das Inselpellet zu stören. Waschen Sie das Pellet meine Zugabe von 10 Milliliter PBS in das Rohr, mischen Sie sanft und Zentrifuge bei 250 mal g für fünf Minuten.Nach der Zentrifugation PBS aspirieren, ohne das Inselpellet zu stören. Das Pellet in 0,5 Milliliter n einer vorgewärmten proteolytischen und kollagenlytischen Enzymmischung wieder aufhängen. Pipette fünfmal mit einer P1000 Pipette, um Inselchen zu mischen.Bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten inkubieren. Mischen Sie nach der Inkubation pipette, die sanft auf und ab streichelt. Überprüfen Sie die Bewölkung einzelner Zellen und die Anzahl der Flocken oder unverdauten Inselchen.Legen Sie ein 40-Mikron-Sieb in eine 35-Millimeter-Petrischale und befeuchten Sie das Sieb, indem Sie einen Milliliter CMRL-Medium mit 10% hitzeaktiviertem fetalem Rinderserum hinzufügen und mit einem Ein-Milliliter-Spritzenkolben deprimieren. Übertragen Sie die gesamte Zellsuspension auf das Sieb. Und sammeln Sie den Pass in einem frischen 15 Milliliter Rohr.Waschen Sie das Rohr für die Vergärung der Islet mit 0,5 Millilitern frischem CMRL-Medium, um übrig gebliebene Zellen zu sammeln und die Wäsche durch das Sieb zu leiten. Kombinieren Sie den Durchgang in einem 15 Milliliter Rohr. Wiederholen Sie dies einmal.Um unverdaute, auf dem Sieb verbleibende Inselchen zu dissoziieren, drücken Sie das Sieb mit einem Ein-Milliliter-Spritzenkolben. Sammeln Sie den Pass wieder und waschen Sie das Sieb mit frischem einfachen CMRL 1066 Medium, um alle verbleibenden verdauten Inseln aus dem Sieb und der Schale zu entfernen. Fügen Sie den Pass in das 15-Milliliter-Rohr.Zeichnen Sie das Gesamtvolumen der Zellsuspension auf und nehmen Sie einen 10 Mikroliter Aliquot von Zellen, um die Zellzahl auf einem Hämozytometer zu zählen. Nach dem Zentrieren der Zellsuspension für fünf Minuten bei 200 mal g, entfernen Sie das Medium, ohne das Pellet zu stören. Um Pseudo-Inseln mit einer 96 gut ultra niedrigen Befestigungsplatte zu produzieren, berechnen Sie zunächst das Gesamtvolumen der erforderlichen ein mal 10 bis die fünften Zellen pro Milliliter der Einzelzellsuspension.Dann setzen Sie das Isletpellet in CMRL-Medium mit 10% Hitze inaktivierten fetalen Rinderserum wieder auf, so dass 30 Mikroliter der Zellsuspension 3000 Zellen haben. Als nächstes übertragen Sie das benötigte Volumen der Einzelzellensuspension in ein frisches 15-Milliliter-Rohr. Bei 250 Transduktionseinheiten pro Zelle eines Lentivirus, das SH-RNA enthält und auf ein Gen von Interesse oder eine Kontrolle abzielt.Um die Zellsuspension mit dem Virus zu mischen, Pipette vorsichtig fünf Mal mit einer P1000 Pipette. Dann übertragen Sie die gemischten Zellen in ein 50 Milliliter steriles Reagenzreservoir, wenn Sie eine Achtkanalpipette verwenden. Mit einer Achtkanalpipette oder einer P200-Pipette 30 Mikroliter pro Brunnen der mit Lentivirus vermischten Zellsuspension in jeden Brunnen geben.Als nächstes zentrifugieren Sie die 96-Wellplatte in einer schwingenden Schaufelplattenzentrifuge bei 270-fachg bei Raumtemperatur sieben Minuten lang. Kultur bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5% Kohlendioxid-Inkubator über Nacht. Nach der Inkubation die 96-Wellplatte aus dem Inkubator entfernen und in den biologischen Sicherheitsschrank legen.Pipette 100 Mikroliter pro Insel von 10%hohe FBSCMRL in einen Brunnen zu verhindern, trocknen von Inselchen und weiterhin Kultur für eine Woche. Pipette 100 Mikroliter pro Brunnen cmRL Medium mit 10% Hitze inaktivierten fetalen Rinderserum aus dem Reservoir zu den Pseudo-Inseln und Pipette auf und ab zwei bis drei Mal sanft im Brunnen, um Inselchen zu heben. Dann das Medium im Brunnen, das eine Pseudoinsel enthält, ansaugen und in eine 10 Zentimeter lange Petrischale auswerfen.Überprüfen Sie die Platte unter einem Lichtmikroskop, um die vollständige Entfernung aller Pseudo-Inseln sicherzustellen, und fahren Sie mit nachgelagerten Experimenten fort. Um Pseudo-Inseln mit einer 24 Well-Mikro-Well-Kulturplatte zu produzieren, fügen Sie zuerst 500 Mikroliter pro Brunnen einer Anti-Haft-Spüllösung hinzu. Zentrifuge bei 1300 mal g für fünf Minuten in einer schwingenden Schaufelplattenzentrifuge.Beobachten Sie dann die Platte unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass Luftblasen aus Mikrobrunnen entfernt werden. In einem biologischen Sicherheitsschrank die Anti-Haft-Spüllösung aus den Brunnen ansaugen. Spülen Sie jeden Brunnen mit zwei Milliliter warme ebene CMRL 1066 medium einmal.Dann aspirieren Sie die ebene CMRL 1066 medium und fügen Sie 0,5 Milliliter pro Brunnen warmes CMRL mit 10% Hitze inaktiviertfetales Rinderserum zu jedem gut geplanten für den Einsatz. Bestimmen Sie die Gesamtzahl der Zellen, die für jeden Brunnen benötigt werden. Setzen Sie die einzelzellen in 0,8 Milliliter CMRL-Medium mit 10% Hitze inaktivierten fetalen Rinderserum in einem sterilen 1,5 Milliliter-Rohr wieder auf.Um einen Brunnen von Pseudo-Islet durch ein Lentivirus transduziert zu erstellen, fügen Sie 125 Transduktionseinheiten pro Zelle zur Einzelzellsuspension hinzu, wodurch das Virusvolumen unter 0,2 Milliliter bleibt. Inkubieren Sie die Zell- und Virusmischung bei 37 Grad Celsius mit gelegentlicher sanfter Vermischung für eine Stunde, um den Kontakt von Zellen mit Viren vor kondensierender Zellen zu ermöglichen. Passen Sie nach einer Stunde das Gesamtvolumen der Ischenzelle und des Virusgemisches auf einen Milliliter an, indem Sie CMRL-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum hinzufügen.Wenn Zellen nach einer einstündigen Inkubation Klumpen bilden, dispergieren Sie sich in eine Einzelzellsuspension durch sanftes und schnelles Pipetieren zwei- bis dreimal. Übertragen Sie die Zellsuspension auf einen Brunnen der 24 Well-Mikro-Well-Kulturplatte. Unmittelbar nach der Pipettierung zentrifugieren Sie bei 100-facher g bei Raumtemperatur für drei Minuten, um Zellen in alle Mikrobrunnen einzufangen.Beobachten Sie unter dem Mikroskop, um zu überprüfen, ob die Zellen gleichmäßig in allen Mikrobrunnen verteilt sind. Es ist wichtig, die Mikro-Well-Platte sofort nach dem Hinzufügen des Brunnens, der die Einzelzellsuspension der Islet in die Brunnen mischt, zu zentrieren. Sequenzielle Veränderungen in der Morphologie von Pseudo-Inselchen aus 3000 menschlichen Inselzellen, die in einer 96 gut ultra niedrigen Befestigungsplatte erstellt wurden, zeigten monolayer oder lose Zellklumpen, die in einer Woche in feste Aggregate mit einem glatten runden Rahmen verwandelt wurden.Im Gegensatz dazu ist in einer Mikrobrunnenkulturplatte die Bildung von Zell- und Pseudoinseln aus nur 500 Inselzellen in der Regel innerhalb von vier Tagen sichtbar. Die einheitliche Größe von Pseudo-Inseln reduziert die Variation innerhalb einer Testgruppe und ermöglicht eine statische Inkubation mit nur fünf Pseudo-Inseln pro Messung. Der Perry Fusion Assay für Insulin-Antwort zeigte, dass menschliche Pseudo-Islets nach sieben Tagen Kultur eine robuste Insulinsekretion in der ersten Phase als Reaktion auf Glukose aufrechterhielten.Die Einführung des Lentivirus, das auf humane Fetttriglyceridlipase oder Perilipin fünf Gene in eine Einzelzellsuspension abzielt, gewährleistet eine effiziente und homogene Transduktion von Isletzellen und erreicht eine hocheffiziente Downregulation von Genen. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Zeit, die für die Dispergierung menschlicher Zelle in einzelne Zellen benötigt wird, durch viele Faktoren wie Größe, Verteilung und das Spendermerkmal beeinflusst wird. Daher ist es wichtig, während der Verdauung genau auf das Verschwinden menschlicher Inseln zu achten.Während des gesamten Protokolls ist es wichtig, die Einzelzellsuspension vorsichtig zu behandeln, um Zellverlust zu vermeiden. Die entstehenden menschlichen Pseudo-Inseln können für viele Anwendungen verwendet werden, um die Wirkung der Genmodulation zu bestimmen, wie:Western Blot, histologische Studie und die Messung der Sauerstoffverbrauchsraten. Dieses Protokoll ermöglicht die Bewertung des niedrigen Zielgens bei der Regulierung der Inselgesundheit und der Funktion in menschlichen Inselchen unter Verwendung gängiger Laborwaren und einfacher Techniken.Die Verwendung menschlicher Inselchen kann eine vorherige Genehmigung durch ein lokales Fachgremium erfordern. Bitte wenden Sie sich vor Beginn der Studie an die örtliche Überprüfungskommission. Lentivirus wird als Biosicherheitsstufe zwei eingestuft.Kontakt zum Ausschuss für biosicherheitssicherheit vor Beginn der Verwendung des Lentivirus.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

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Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Forschung

Genetik

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

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Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

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Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selektionsabhängige und unabhängige Erzeugung von CRISPR / Cas9-vermittelten Gen-Knockouts in Säugetierzellen

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Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

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Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

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Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

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As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Ein Protokoll für die Produktion der Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren für CRISPR/Cas9-vermittelte Gen Knockout in teilenden Zellen

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CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-vermittelten Reorganisation der Chromatinstruktur mit Schleife

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Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentivirale vermittelte Produktion von transgenen Mäusen: eine einfache und hocheffiziente Methode für die direkte Untersuchung der Gründer

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...