Name: lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates
Uploaded: 2019-05-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates at JoVE.com

עבודה זו היתה נתמכת כספית על ידי מכוני הבריאות הלאומיים לY.I. (R01-DK090490) והאגודה האמריקנית לסוכרת Y.I. (1-17-IBS-132). דביק ja ו-Y.I. נתמכים על ידי המרכז לחקר הסוכרת של הנשרים מסדר אחווה. א יהושע נתמך על ידי המכון הלאומי של מענק הכשרה בריאות (T32NS45549). מחברים מנוצל האדם הלבלב איונים שסופקו על ידי התוכנית הפצה משולבת של איון NIDDK במימון (IIDP) בעיר של תקווה (2UC4DK098085).

לפני תחילת הלימודים, מחקר של נושאים אנושיים נקבע על ידי מועצת המחקר המוסדי של אוניברסיטת איווה, אשר קבע כי המחקר לא עמד בקריטריונים למחקר הנבדקים האנושיים. עיין בלוח הסקירה המקומי לפני החניכה של המחקר כדי לקבוע אם מקור האיים והמחקר המתוכנן דורשים אישור מראש.
הערה: ?...

<ol>
	<li>Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta+cell+mass+and+function+in+diabetes:+Recent+advances+in+knowledge+and+technologies+to+understand+disease+pathogenesis.">Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).</li><li>Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+flexible+system+for+glucose+homeostasis.">Stable and flexible system for glucose homeostasis.</a> Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).</li><li>Cryer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Glucagon+in+the+pathogenesis+of+hypoglycemia+and+hyperglycemia+in+diabetes.">Minireview: Glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes.</a> Endocrinology. 153 (3), 1039-1048 (2012).</li><li>Arrojo e Drigo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+architecture+of+the+islet+of+Langerhans:+a+focused+cross-species+assessment.">New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment.</a> Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).</li><li>Harata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+shRNA+via+lentivirus+in+human+pseudoislets+provides+a+model+to+test+dynamic+regulation+of+insulin+secretion+and+gene+function+in+human+islets.">Delivery of shRNA via lentivirus in human pseudoislets provides a model to test dynamic regulation of insulin secretion and gene function in human islets.</a> Physiological Reports. 6 (20), e13907 (2018).</li><li>Barbu, A. R., Akusjarvi, G., Welsh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+transduction+of+human+pancreatic+islets:+importance+of+adenoviral+genome+for+cell+viability+and+association+with+a+deficient+antiviral+response.">Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response.</a> Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).</li><li>Hughes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+to+improve+pancreatic+islet+transplantation+for+Type+1+diabetes+mellitus.">Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus.</a> Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).</li><li>Jimenez-Moreno, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+High+Efficiency+Intra-Islet+Transduction+Protocol+Using+Lentiviral+Vectors.">A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors.</a> Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).</li><li>Bonora, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+correlates+of+post-prandial+hyperglycaemia+in+a+large+sample+of+patients+with+type+2+diabetes+mellitus.">Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).</li><li>Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. L., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+reassociation+of+dispersed+adult+rat+pancreatic+islet+cells+into+aggregates+with+three-dimensional+architecture+typical+of+native+islets.">Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets.</a> Diabetes. 36 (7), 783-790 (1987).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+pseudoislets+form+efficiently+from+donated+tissue,+compare+favourably+with+native+islets+in+vitro+and+restore+normoglycaemia+in+mice.">Bioengineered human pseudoislets form efficiently from donated tissue, compare favourably with native islets in vitro and restore normoglycaemia in mice.</a> Diabetologia. 61 (9), 2016-2029 (2018).</li><li>Zuellig, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+physiological+properties+of+gravity-enforced+reassembled+rat+and+human+pancreatic+pseudo-islets.">Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).</li><li>Caton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+transduction+of+connexin+cDNAs+shows+level-+and+isoform-specific+alterations+in+insulin+secretion+of+primary+pancreatic+beta-cells.">Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells.</a> Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+beta+Cell+Function.">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li><li>Peiris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+human+diabetes-risk+gene+function+with+genetics+and+physiological+assays.">Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays.</a> Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).</li><li>Schlimgen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+Associated+With+Lentiviral+Vector+Exposures+and+Prevention+Strategies.">Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies.</a> Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+islet+for+improved+performance+by+optimized+reaggregation+in+alginate+gel+beads.">Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).</li><li>Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+re-aggregated+human+pancreatic+islets+for+secondary+drug+screening.">Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening.</a> British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).</li><li>Hilderink, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+aggregation+of+primary+human+pancreatic+islet+cells+leads+to+glucose-responsive+pseudoislets+comparable+to+native+islets.">Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).</li><li>Saunders, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectonucleoside+Triphosphate+Diphosphohydrolase-3+Antibody+Targets+Adult+Human+Pancreatic+beta+Cells+for+In+Vitro+and+In+Vivo+Analysis.">Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis.</a> Cell Metabolism. (18), (2018).</li><li>Reissaus, C. A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reestablishment+of+Glucose+Inhibition+of+Glucagon+Secretion+in+Small+Pseudoislets.">Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets.</a> Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).</li></ol>

כאן, פרוטוקול מפורט כדי ליצור מדומה האנושי כי הם התמרה על ידי וירוס באמצעות מ96-ובכן אולטרה נמוך מצורף צלחת או לוחית התרבות מוצג. פסאודו איים דיווחו להפגין מורפולוגיה ופונקציות הפרשה דומה האיים האנושיים הילידים יכולים להיות מתורבתים לזמן ממושך בתוך מבחנה5,11...

ההפסד של מסה תא ביתא פונקציונלי הוא הפתולוגיה המרכזית עבור שני סוג 1 וסוכרת סוג 21. בעוד תאי ביתא הם המפיקים של האינסולין באיים הלבלב, תקשורת בין תאי ביתא ותאים שאינם ביתא ממלא תפקיד קריטי בוויסות הפרשת האינסולין2. בנוסף, דיסתקנה של הפרשת גלוקגון תורמת להירגליקמיה בסוכרת3. כך, יש עניין חזק לווסת את הביטוי הגנטי של תאים בתוך איונים הלבלב כדי לטפל במנגנון מאחורי התפתחות של התפקוד של איון בסוכרת. מגוון רחב של גישות כולל עכברים טרנסגניים זמינים כדי לווסת את הביטוי הגנטי של איונים של העכבר. עם זאת, איונים אנושיים ועכברים להראות אינבציה שונה, התפלגות התא, היחס של ביתא לתאי אלפא, ואת התגובה הסוד4. לכן, הערכה ישירה של הפונקציה גנטי באיים האנושיים הוא חשוב מאוד להבנת הפתופסולוגיה של איולי הלבלב האנושי.
וקטור אדנונגיפי הוא וקטור ויראלי הנפוץ ביותר כדי לשנות את איולי הלבלב בחוץ בגלל היעילות הגבוהה של התמרה בתאים שאינם מפרידים. עם זאת, אדנווירוס לא לחדור לליבה של איונים ביעילות, במיוחד באיים האנושיים5, ו ציטוטוקסינים במינון גבוה6. יחסית, וקטור לנטינגיל הוא פחות ציטוטוקסיני ומספק גנים אקסוגניים לצמיתות לתוך כרומוזום של התאים post-mitotic, מה שהופך אותו רכב נבדק נרחב עבור טיפול גנטי7. עם זאת, את היכולת של הנגיף כדי לחדור את הליבה של איים אנושיים שלמים הוא גם מוגבל, ובכך דורשים פיזור חלקי על ידי העיכול אנזימטי כדי להגביר את יעילות התמרה8. האזהרה עם הפיזור של איים אנושיים שלמים היא ההפרעה של תא תא ותקשורת תא מטריקס, אשר מתפשר על הרגולציה הדינמית של הפרשת אינסולין קריטית לתחזוקת הומאוסטזיס גלוקוז בבני אדם9. לכן, זה כבר מאתגר להעריך את ההשפעה של אפנון גנטי על הרגולציה הדינמית של הפונקציה איון במודל של איונים אנושיים.
זה כבר ידוע כי מפוזרים תאים איון מ בני אדם מכרסמים באופן עצמאי מחדש לתוך מבנים כמו איון שנקרא "פסבדו". פסאודו איים להראות ביתא ולא התפלגות תא ביתא דומה הילידים10,11. בנוסף, לאחר תרבות ארוכת טווח, האיים המקומיים מאבדים בהדרגה את הפרשת האינסולין הראשונית בשלב הראשון5,10,11,12. עם זאת, פסבדו-מוח הפגינו שימור טוב יותר של הפרשת האינסולין בשלב הראשון בתגובה לגלוקוז לעומת איונים מקומיים לאחר אותה תקופה של תרבות5. בנוסף לשימור טוב יותר של הפרשת אינסולין, לצבור מבוקר גודל של תאים איון האדם בלוחות מצורף נמוך11 מספק חלון של הזדמנות להציג וקטורים וירוס לפני הצבירה שלהם לתוך . מאוד מאיים מספר מחקרים הוכיחו את כלי השירות של הפסבדו בשילוב עם התמרה מתווכת. Caton ואח '13 דיווחו כי המבוא של חלבון פלורסנט ירוק (gfp) הביעה הבעה וירוס היתה השפעה קטנה על הפרשת אינסולין תוך השגת ביטוי הומוגנית של gfp ב מדומה לחולדה לעומת שליטה לא נגוע. הם גם הפגינו את ההשפעה הספציפית של connexins שונים על הפרשת אינסולין על ידי הבעת היתר connexins 32, 36, ו 43 באמצעות הנגיף13. מדומה האנושי הכין עם מסחרית זמין 96-ובכן אולטרה נמוך מצורף צלחת הראו כי הבעה ויראלי-מתווכת הביטוי של שעתוק גורם SIX3 משפר את הפרשת האינסולין המוערך על ידי דגירה סטטי14. לאחרונה, מדומה של האדם שהוכן בלוח ההחזקות ה96-והטוב אולטרה-נמוך, שימשו לצמצום השימוש בגלוקינאז דרך רנ א קצר ויראלי (שרין) כהוכחה לעיקרון כדי להראות כי הפרשת אינסולין מגורה מופחתת, בעוד הפרשת אינסולין מאולצת נשמרה ב-5. המחקר הראה גם כי מדומה האנושי דומים לאיונים מקומיים בביטוי גנים ופרופילי הפרשה, תמיכה נוספת של השירות של פסאודו האדם כדי לנתח את הרגולציה של הפונקציה איון5. למרות הפריזיה לא בוצעה, צלחת תרבות המיקרוגל ביולוגי שלאחרונה הפך להיות זמין מסחרית, דווח גם להיות תואם התמרה ויראלית והפיק מדומה ומיוצר האנושי הציג אינסולין מעולה הפרשה במבחנה ובvivo לאחר השתלת11. באופן קולקטיבי, היווצרות מדומה האדם בשילוב עם התמרה ויראלית היא גישה פשוטה ויעילה כדי לחקור את האי האנושי פתופסולוגיה, מתן כלי רב ערך לבצע מחקרים מכניסטיים באיונים אנושיים.
בדוח הנוכחי, פרוטוקול ליצירת מגוון מדומה של האדם עם וירוס באמצעות שתי פלטפורמות זמינות מסחרית, a 96-היטב אולטרה מצורף לוחית החיבור ולוח תרבות המיקרוגל מוצג. שניהם להשיג אפנון יעיל של ביטוי גנים וליצור מדומה אנושי התואמים הערכות במורד הזרם כולל דגירה סטטי הפריזיה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series Type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer, 40 micrometer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11530037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Trizol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marien Feld</td>
			<td>Neubauer-Improved Bright line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>11-350-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube, 1.5 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microwell culture plate</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>34411</td>
			<td>Aggrewell 400, 24 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motor-driven pestle</td>
			<td>GAMUT</td>
			<td>#399X644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-tissue culture treated dish, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 mm</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 5 mL</td>
			<td>DOT Scientific,</td>
			<td>667205B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 8-channel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#613-5253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>667210B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P10</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P200</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P1000</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteolytic and collagenolytic enzyme mixture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6965</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagent reservoir, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversible strainer, 37 micrometer</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>27251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket plate centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-14R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SX4750A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin syringe, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra low attachment microplate, 96 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4515</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates

כלים גנטיים שונים זמינים לווסת גנים באיים הלבלב של מכרסמים כדי לנתח פונקציה של גנים איון למחקר סוכרת. עם זאת, הנתונים שהושגו מתוך איולי מכרסמים הם לעתים קרובות לא לשכפל במלואו או ישים לאיים האנושיים בשל הבדלים ידועים במבנה איון ותפקוד בין המינים. כיום, טכניקות הזמינות כדי לתמרן ביטוי הגנים של האיים האנושיים מוגבלים מאוד. מבוא של הטרנסגנים אל איונים שלמים על ידי אדנווירוס, פלסמיד, ו פורוזימטר לעתים קרובות סובל מיעילות נמוכה רעילות גבוהה. יעילות נמוכה היא בעייתית במיוחד במחקרים להוריד גנים באיונים שלמים, אשר דורשים יעילות גבוהה. ידוע כי התאים הפזורים בתוך הפיזור מחדש התפזרו בתרבות היוצרים הספרואידים שנקרא פסבדו. גודל מבוקר צבירה מחדש של תאים איון האדם יוצר מדומה כי לשמור על הפרשה דינמית בשלב הראשון אינסולין לאחר תרבות ממושכת ולספק חלון כדי להציג ביעילות את ה-RNA הקצר ויראלי (שרין) עם רעילות נמוכה. כאן, פרוטוקול מפורט ליצירת הפסבדו האנושי לאחר התמרה ויראלית באמצעות שתי צלחות מסחריות הזמינות בשני הלוחות מתוארות. הפרוטוקול ניתן לבצע בקלות ומאפשר להוריד יעיל של גנים והערכה של דינמיות של הפרשת אינסולין באמצעות תאים איון האדם. כך, מדומה אנושי עם אפנון גנטית מתווכת בתיווך לספק מודל רב עוצמה ורב תכליתי כדי להעריך את תפקוד הגנים בתוך תאי איון האדם.

איור 1 ממחיש את צעדי המפתח בייצור מדומה באמצעות לוחית הצמדה 96-ובכן-נמוך במיוחד ולוחית התרבות של המיקרוגל. איור 2a מראה שינויים רציפים במבנה מורפולוגיה במהלך היווצרות של מדומה 3 x 103 תאים איון האדם ב 96-ובכן אולטרה נמוך מצורף לוחית. מונאו?...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates at JoVE.com

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

פרוטוקול כדי ליצור גנים שונה האדם מדומה מפוזרים תאים איון האדם התפזרו על ידי וירוס לנשיאת RNA קצר (מרין) מוצג. פרוטוקול זה מנצל את כלי האנזים והתרבות הזמינים, ניתן לבצע בקלות, והוא מייצר מדומה מבחינה גנטית מדומה המתאים ללימודים פונקציונליים ומורפולוגיים.

לנטינגינה ג'ין מתווכת השתקה האדם פסאודו איון מוכן לוחות מצורף נמוך

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

קשה לווסת את ביטוי הגנים באזורים אנושיים, גם ירידה גדולה יותר של איונים אנושיים מתפקדים מציבים אתגרים גדולים לאחר אפנון ביטוי הגנים. על ידי שילוב של טרנסדוקציה SHR8 מתווך SHR8 היווצרות של איונים מתאימים אנושיים. פרוטוקול זה מאפשר רגולציה יעילה של גן ממוקד תוך שמירה על תפקוד איון במהלך תרבות ממושכת.כדי להתחיל, בעדינות מערבולת בקבוק המשלוח כדי לשמור על איונים בהשעיה. העבר את מדיום המשלוח המכיל איונים לצינור צנטריפוגה חרוט 50 מיליליטר. תן לצינור לשבת בארון בטיחות ביולוגי במשך 15 דקות, כך איים להתיישב לתחתית הצינור.הסר את מדיום המשלוח בעדינות באמצעות פיפטה נימי מבלי להפריע גלולת איון. להשעות מחדש את גלולת איון במדיום CMRL עם אלבומין סרום אנושי 1% לריכוז של 400 איון שווה ערך למיליליטר. מעבירים איונים לתבשיל שאינו רקמה ומתייחסים אליהם בתרבות ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו-חמצני בן לילה.לאחר תרבות הלילה, להעביר איונים אנושיים לתוך צינור צנטריפוגה חרוט 15 מיליליטר, צנטריפוגה ב 250 פעמים g במשך חמש דקות רוטור דלי מתנדנד. ושואפים את המדיום עם פיפטה נימית מבלי להפריע לכדור איון. לשטוף את גלולה שלי הוספת 10 מיליליטר של PBS לצינור, לערבב בעדינות צנטריפוגה ב 250 פעמים g במשך חמש דקות.לאחר צנטריפוגה, שאף PBS מבלי להפריע גלולת איון. להשעות מחדש את גלולה ב 0.5 מיליליטר של תערובת אנזימים פרוטאוליטית וקולגנוליטית מחומם מראש. פיפטה חמש פעמים באמצעות פיפטה P1000 לערבב איונים.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר הדגירה, מערבבים את הפיפטה מלטפת מעלה ומטה בעדינות. בדוק אם יש עננות של תא יחיד ומספר הפתיתים או איונים לא מעוכלים.מניחים מסננת 40 מיקרון בצלחת פטרי 35 מילימטר והרטיבו את מסננת על ידי הוספת מיליליטר אחד של מדיום CMRL עם 10% חום סרום חזיר עוברי מושבת ומדכא עם בוכנה מזרק מיליליטר אחד. להעביר את כל ההשעיה התא על גבי מסננת. ולאסוף את המעבר דרך בצינור טרי 15 מיליליטר.לשטוף את הצינור המשמש לעיכול איון עם 0.5 מיליליטר של מדיום CMRL טרי כדי לאסוף שאריות תאים ולהעביר את לשטוף דרך מסננת. לשלב את המעבר בצינור 15 מיליליטר. חזור פעם אחת.כדי לנטרל איונים לא מעוכלים שנותרו על מסננת, לחץ על מסננת עם בוכנה מזרק מיליליטר אחד. לאסוף את המעבר שוב לשטוף את מסננת עם טרי רגיל CMRL 1066 בינוני כדי להסיר את כל איונים מתעכלים הנותרים מן מסננת ואת המנה. מוסיפים את המעבר לצינור 15 מיליליטר.הקלט את הנפח הכולל של ההשעיה התא ולקחת aliquot 10 microliter של תאים לספור את מספר התא על המוציטמטר. לאחר צנטריפוגה ההשעיה התא במשך חמש דקות ב 200 פעמים g, להסיר את המדיום מבלי להפריע את גלולה. כדי לייצר פסאודו-איונים באמצעות לוחית התקשרות נמוכה במיוחד של 96 בארות, חשב תחילה את הנפח הכולל של הדרוש פעם אחת 10 לתאים החמישיים למיליליטר של ההשעיה של תא יחיד.לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולת איון במדיום CMRL עם 10% חום בלתי מואט סרום חזיר העוברי, כך 30 microliters של ההשעיה התא יש 3000 תאים. לאחר מכן, להעביר את הנפח הנדרש של ההשעיה תא יחיד לצינור טרי 15 מיליליטר. ב 250 יחידות התמרה לכל תא של lentivirus המכיל SH-RNA מיקוד גן של עניין או שליטה.כדי לערבב את ההשעיה התא עם הנגיף, פיפטה בעדינות חמש פעמים עם פיפטה P1000. לאחר מכן להעביר את התאים המעורבים לתוך מאגר 50 מיליליטר סטרילי ריג'נט אם באמצעות פיפטה שמונה ערוצים. עם פיפטה שמונה ערוצים או פיפטה P200, לוותר על 30 microliters ל הבאר של ההשעיה התא מעורבב עם lentivirus לתוך כל באר.לאחר מכן, צנטריפוגה צלחת 96 גם בצנטריפוגה צלחת דלי מתנדנד ב 270 פעמים גרם בטמפרטורת החדר במשך שבע דקות. תרבות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח 5%פחמן דו חמצני בן לילה. לאחר הדגירה, מוציאים את צלחת ה-96 היטב מהחמה ומ מניחים אותה בארון הבטיחות הביולוגי.פיפטה 100 מיקרוליטר לכל אי של 10% גבוה FBSCMRL לתוך באר כדי למנוע ייבוש של איונים ולהמשיך תרבות במשך שבוע אחד. פיפטה 100 מיקרוליטרים לבא של מדיום CMRL עם 10% חום סרום חזיר עוברי מושבת מהמאגר לפסאודו-איונים ופיפט למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש פעמים בעדינות באר כדי להרים איונים למעלה. לאחר מכן, שאף את המדיום היטב המכיל פסאודו-איון ופלט לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ.בדוק את הצלחת תחת מיקרוסקופ אור כדי להבטיח הסרה מלאה של כל פסאודו איונים ולהמשיך לניסויים במורד הזרם. כדי לייצר פסאודו-איונים באמצעות צלחת תרבות מיקרו באר 24 באר, תחילה להוסיף 500 microliters לבא של פתרון שטיפה נגד דבקות. צנטריפוגה ב 1300 פעמים g במשך חמש דקות בצנטריפוגה צלחת דלי מתנדנד.לאחר מכן, להתבונן בצלחת תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח כי בועות אוויר מוסרים מיקרו בארות. בארון בטיחות ביולוגי, שאפו את פתרון שטיפה נגד דבקות מה בארות. יש לשטוף כל באר עם שני מיליליטר של CMRL רגיל וחם 1066 בינוני פעם אחת.לאחר מכן, שאפו את המדיום CMRL 1066 הפשוט והוסיפו 0.5 מיליליטר ל-CMRL חם עם 10% חום מושבת בסרום חזיר עוברי לכל אחד מתוכנן היטב לשימוש. קבע את המספר הכולל של התאים הדרושים עבור כל באר. להשעות מחדש את התאים הבודדים ב 0.8 מיליליטר של מדיום CMRL עם 10% חום מושבת סרום חזיר עוברי בצינור סטרילי 1.5 מיליליטר.כדי ליצור באר אחת של פסאודו-איון שהותמר על ידי lentivirus, להוסיף 125 יחידות שכפול לכל תא מתלים תא יחיד שמירה על נפח הנגיף מתחת 0.2 מיליליטר. הדגירה את תערובת התאים והווירוסים ב 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין מדי פעם במשך שעה אחת כדי לאפשר מגע של תאים עם וירוס לפני עיבוי של תאים. לאחר שעה אחת, להתאים את הנפח הכולל של תא איון ותערובת וירוסים למיליליטר אחד על ידי הוספת מדיום CMRL עם 10%חום מושבת סרום חזיר עוברי.אם תאים יוצרים גושים לאחר דגירה של שעה אחת מתפזרים לתוך מתלה תא יחיד על ידי צינורות עדינים ומהירים פעמיים עד שלוש פעמים. העבר את ההשעיה התא ל הבאר אחת של 24 גם צלחת תרבות מיקרו היטב. מיד לאחר צינורות, צנטריפוגה ב 100 פעמים g בטמפרטורת החדר במשך שלוש דקות כדי ללכוד תאים לתוך כל מיקרו בארות.שימו לב תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שתאים מופצים באופן שווה בכל המיקרו-בארות. זה קריטי כדי צנטריפוגה צלחת מיקרו באר מיד לאחר הוספת גם ערבוב המתלה תא יחיד איון לתוך הבאר. שינויים רציפים במורפולוגיה של פסאודו-איונים מ-3,000 תאי איון אנושיים שנוצרו בצלחת התקשרות נמוכה במיוחד של 96 באר הראו גושים מונוליים או רופפים של תאים שהפכו לאגרגטים מוצקים עם גבול עגול חלק בשבוע אחד.לעומת זאת, בצלחת תרבות מיקרו-באר, היווצרות תאים ופסאודו-איונים מ-500 תאי איון בלבד נראית בדרך כלל בתוך ארבעה ימים. הגודל האחיד של פסאודו-איונים מקטין את השונות בתוך קבוצת בדיקה ומאפשר דגירה סטטית תוך שימוש בחמישה פסאודו-איונים לכל מדידה. פרי פיוז'ן Assay לתגובת אינסולין הראה פסאודו-איונים אנושיים שמרו על הפרשת אינסולין חזקה בשלב הראשון בתגובה לגלוקוז לאחר שבעה ימים של תרבות.כניסתה של lentivirus מיקוד שומן אנושי טריגליצרידים ליפאז או perilipin חמישה גנים לתוך השעיה תא יחיד מבטיח טרנסדוקציה יעילה הומוגנית של תאי איון ומשיגה ירידה יעילה מאוד של גנים. חשוב לזכור כי הזמן הנדרש לפיזור איון אנושי לתאים בודדים מושפע מגורמים רבים כגון: גודל, הפצה ומאפיין התורם. לכן, חשוב לשים לב להיעלמותם של איונים אנושיים במהלך העיכול.לאורך כל הפרוטוקול חשוב לטפל בהשעיית תא יחיד בעדינות כדי למנוע אובדן תאים. פסאודו-איונים אנושיים שנוצרו יכול לשמש עבור יישומים רבים כדי לקבוע את ההשפעה של אפנון גנים כגון: כתם מערבי, מחקר היסטולוגי ואת המדידות של שיעורי צריכת חמצן. פרוטוקול זה מאפשר להעריך את הנמוך של הגן הממוקד בוויסות בריאות איון ואת הפונקציה של איונים אנושיים באמצעות כלי מעבדה נפוצים וטכניקות פשוטות.השימוש באיים אנושיים עשוי לדרוש אישור מוקדם של ועדת בדיקה מקומית. אנא התייעצו עם ועדת הביקורת המקומית לפני תחילת המחקר. Lentivirus מסווג כרמה ביו-בטיחותית 2.צור קשר עם ועדת בטיחות ביולוגית לפני תחילת השימוש של lentivirus.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

ניתוח Transfection siRNA ו Emsa על Cytotrophoblasts Villous אדם המבודד טרי

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ&quot;א סתר החיפושית,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-מתווכת אינטגרציה יישוב In Vivo באמצעות אסטרטגיה מבוסס על הצטרפות סוף בתיווך הומולוגיה

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

פרוטוקול עבור הייצור של וקטורים Lentiviral חשוכת-Integrase עבור CRISPR/Cas9-מתווכת נוקאאוט גנטי חלוקת תאים

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR בתיווך ארגון מחדש של הכרומטין לולאה

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentiviral מתווכת הייצור של העכברים הטרנסגניים: שיטה פשוטה ויעילה מאוד עבור לימוד ישיר של המייסדים

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...