Name: lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates
Uploaded: 2019-05-14T13:30:00
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Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dai National Institutes of Health to Y.I. (R01-DK090490) e dall'American Diabetes Association a Y.I. (1-17-IBS-132). J.A. e Y.I. sono supportati dal Centro di ricerca sul diabete dell'Ordine Fraterno delle Aquile. A.B. è sostenuto da una sovvenzione di formazione dei National Institutes of Health (T32NS45549). Gli autori hanno utilizzato isole pancreatiche umane fornite dal programma integrato di distribuzione dell'isola (IIDP) finanziato dalla NIDDK a City of Hope (2UC4DK098085).

Prima dell'inizio degli studi, l'University of Iowa Institutional Review Board ha determinato che lo studio non soddisfaceva i criteri per la ricerca sui soggetti umani. Consultare il comitato di revisione locale prima dell'avvio dello studio per determinare se la fonte delle issolte e lo studio pianificato richiedono l'approvazione preventiva.
 NOT:</</c0> Tipicamente, sono necessari 1.200-1.400 isolotti equivalenti (IEQ) di isolotti umani per la formazione di 192 pseudoislets delle d...

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	<li>Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta+cell+mass+and+function+in+diabetes:+Recent+advances+in+knowledge+and+technologies+to+understand+disease+pathogenesis.">Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).</li><li>Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+flexible+system+for+glucose+homeostasis.">Stable and flexible system for glucose homeostasis.</a> Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).</li><li>Cryer, P. 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R., Akusjarvi, G., Welsh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+transduction+of+human+pancreatic+islets:+importance+of+adenoviral+genome+for+cell+viability+and+association+with+a+deficient+antiviral+response.">Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response.</a> Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).</li><li>Hughes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+to+improve+pancreatic+islet+transplantation+for+Type+1+diabetes+mellitus.">Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus.</a> Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).</li><li>Jimenez-Moreno, C. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+physiological+properties+of+gravity-enforced+reassembled+rat+and+human+pancreatic+pseudo-islets.">Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).</li><li>Caton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+transduction+of+connexin+cDNAs+shows+level-+and+isoform-specific+alterations+in+insulin+secretion+of+primary+pancreatic+beta-cells.">Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells.</a> Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+beta+Cell+Function.">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li><li>Peiris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+human+diabetes-risk+gene+function+with+genetics+and+physiological+assays.">Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays.</a> Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).</li><li>Schlimgen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+Associated+With+Lentiviral+Vector+Exposures+and+Prevention+Strategies.">Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies.</a> Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+islet+for+improved+performance+by+optimized+reaggregation+in+alginate+gel+beads.">Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).</li><li>Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+re-aggregated+human+pancreatic+islets+for+secondary+drug+screening.">Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening.</a> British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).</li><li>Hilderink, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+aggregation+of+primary+human+pancreatic+islet+cells+leads+to+glucose-responsive+pseudoislets+comparable+to+native+islets.">Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).</li><li>Saunders, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectonucleoside+Triphosphate+Diphosphohydrolase-3+Antibody+Targets+Adult+Human+Pancreatic+beta+Cells+for+In+Vitro+and+In+Vivo+Analysis.">Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis.</a> Cell Metabolism. (18), (2018).</li><li>Reissaus, C. A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reestablishment+of+Glucose+Inhibition+of+Glucagon+Secretion+in+Small+Pseudoislets.">Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets.</a> Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).</li></ol>

Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per generare pseudoislets umani che vengono tradotti da lentivirus utilizzando una piastra di fissaggio ultra-bassa 96-pozzetti o una piastra di coltura microwell. Gli pseudoislets sono stati segnalati per dimostrare la morfologia e le funzioni secretorie simili agli isolotti umani nativi e possono essere coltivati per un tempo prolungato in vitro5,11,18. A differenza delle isole u...

La perdita di massa funzionale delle cellule beta è la patologia centrale sia per il diabete di tipo 1 che per il diabete di tipo 21. Mentre le cellule beta sono i produttori di insulina in isole pancreatiche, la comunicazione tra le cellule beta e le cellule non beta svolge un ruolo critico nella regolazione della secrezione di insulina2. Inoltre, la disregolazione della secrezione glucagone contribuisce all'iperglicemia nel diabete3. Quindi, c'è un forte interesse a modulare l'espressione genica delle cellule all'interno delle isole pancreatiche per affrontare il meccanismo alla base dello sviluppo della disfunzione delle isole nel diabete. Sono disponibili una varietà di approcci, tra cui i topi transgenici, per modulare l'espressione genica delle isole del topo. Tuttavia, gli isolotti umani e murini mostrano l'innervazione distinta, la distribuzione cellulare, il rapporto tra le cellule beta e alfa e la risposta a secretagoghi4. Pertanto, la valutazione diretta della funzione genica nelle isole umane è estremamente importante per comprendere la fisiopatologia delle isole pancreatiche umane.
Il vettore adenovirale è il vettore virale più utilizzato per trasdurare le isole pancreatiche in vitro a causa dell'elevata efficienza della trasduzione nelle cellule non dividendo. Tuttavia, l'adenovirus non penetra nel nucleo delle isole in modo efficiente, soprattutto nelle isole umane5, ed è citotossico a dosi elevate6. Comparativamente, il vettore lentivirale è meno citotossico e fornisce geni esogeni permanentemente nel cromosoma delle cellule post-mitotiche, rendendolo un veicolo ampiamente testato per la terapia genica7. Tuttavia, anche la capacità del lentivirus di penetrare nel nucleo delle isole umane intatte è limitata, richiedendo così una dispersione parziale per digestione ezimatica per aumentare l'efficienza della trasduzione8. L'avvertenza con la dispersione di isolotti umani intatti è l'interruzione della comunicazione cellulare-cellula e cellula-matrice, che compromette la regolazione dinamica della secrezione di insulina critica per il mantenimento dell'omeostasi del glucosio negli esseri umani9. Pertanto, è stato difficile valutare l'impatto della modulazione genica sulla regolazione dinamica della funzione delle isole in un modello di isole umane.
È noto che le cellule di isole disperse provenienti da isole umane e roditori si reaggregano autonomamente in strutture simili a isole chiamate "pseudoislets". Gli pseudoislets mostrano la distribuzione di celle beta e non beta simile alle islet native10,11. Inoltre, dopo la cultura a lungo termine, le isole native perdono progressivamente robusta secrezione di insulina in prima fase5,10,11,12. Tuttavia, gli pseudoislets hanno dimostrato una migliore conservazione della secrezione di insulina della prima fase in risposta al glucosio rispetto alle isole native dopo lo stesso periodo di coltura5. Oltre ad avere una migliore conservazione della secrezione di insulina, la riaggregazione a dimensione delle cellule dell'isolotto umano in piastre a basso attaccamento11 fornisce una finestra di opportunità per introdurre vettori di lentivirus prima della loro riaggregazione in pseudoislets. Diversi studi hanno dimostrato l'utilità di pseudoislets combinati con la trasduzione mediata lentivirale. Caton et al.13 ha riferito che l'introduzione della proteina fluorescente verde (GFP) che esprime lentivirus ha avuto poco effetto sulla secrezione di insulina, ottenendo al contempo un'espressione omogenea della GFP nelle pseudoislets di ratto rispetto al controllo non infetto. Hanno anche dimostrato l'effetto specifico di diverse connessine sulla secrezione di insulina sovraesprimendo connexins 32, 36 e 43 tramite lentivirus13. Gli pseudoislets umani preparati con una piastra di fissaggio ultra-bassa disponibile in commercio hanno dimostrato che la sovraespressione mediata di lentivirale del fattore di trascrizione SIX3 migliora la secrezione dell'insulina valutata dall'incubazione statica14. Recentemente, sono stati utilizzati pseudoislets umani preparati con una piastra di fissaggio ultra-bassa di 96 pozzetti per ridurre la glucokinasi tramite RNA di forcina corta lentivirale (shRNA) come prova di principio per dimostrare che la secrezione di insulina stimolata dal glucosio è ridotta, mentre La secrezione di insulina stimolata da KCl è stata conservata5. Lo studio ha anche dimostrato che gli pseudoislets umani sono simili agli isolotti nativi nell'espressione genica e nei profili secretoria, sostenendo ulteriormente l'utilità degli pseudoislets umani per sezionare la regolazione della funzione islet5. Anche se la perifusione non è stata eseguita, una piastra di coltura di microwell bioingegnerizzata che recentemente è diventata disponibile in commercio, è stata anche segnalata per essere compatibile per la trasduzione lentivirale e ha prodotto pseudoislets umane che presentano eccellenti insulina secrezione in vitro e in vivo dopo il trapianto11. Collettivamente, la formazione dello pseudoislet umano combinata con la trasduzione lentivirale è un approccio semplice ed efficiente per studiare la fisiopatologia delle isole umane, fornendo uno strumento prezioso per eseguire studi meccanicistici nelle isole umane.
Nella relazione attuale, viene presentato un protocollo per formare pseudoislets umane tradusse con lentivirus utilizzando due piattaforme disponibili in commercio, una piastra di fissaggio ultra-bassa 96-pozzetto e una piastra di coltura microwell. Entrambi ottengono un'efficace modulazione dell'espressione genica e creano pseudoislets umane compatibili per le valutazioni a valle, tra cui l'incubazione statica e la perifusione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series Type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer, 40 micrometer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11530037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Trizol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marien Feld</td>
			<td>Neubauer-Improved Bright line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>11-350-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube, 1.5 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microwell culture plate</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>34411</td>
			<td>Aggrewell 400, 24 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motor-driven pestle</td>
			<td>GAMUT</td>
			<td>#399X644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-tissue culture treated dish, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 mm</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 5 mL</td>
			<td>DOT Scientific,</td>
			<td>667205B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 8-channel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#613-5253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>667210B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P10</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P200</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P1000</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteolytic and collagenolytic enzyme mixture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6965</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagent reservoir, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversible strainer, 37 micrometer</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>27251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket plate centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-14R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SX4750A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin syringe, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra low attachment microplate, 96 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4515</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates

Sono disponibili vari strumenti genetici per modulare i geni nelle isole pancreatiche dei roditori per sezionare la funzione dei geni dell'isolotto per la ricerca sul diabete. Tuttavia, i dati ottenuti dalle isole di roditori spesso non sono completamente riprodotti o applicabili alle isole umane a causa di ben note differenze nella struttura e nella funzione delle isole tra le specie. Attualmente, le tecniche disponibili per manipolare l'espressione genica delle isole umane sono molto limitate. L'introduzione del transgene in isole intatte mediante adenovirus, plasmide e oligonucleotidi spesso soffre di bassa efficienza e di elevata tossicità. La bassa efficienza è particolarmente problematica negli studi di downregulation genica in isole intatte, che richiedono un'elevata efficienza. È noto che le cellule di isole enzimaticamente disperse si riaggregano nella coltura formando sferoidi chiamato pseudoislets. La riaggregazione controllata dalle dimensioni delle cellule dell'isolotto umano crea pseudoislets che mantengono la secrezione dinamica dell'insulina della prima fase dopo una coltura prolungata e forniscono una finestra per introdurre in modo efficiente l'RNA a tornante corto lentivirale (shRNA) con bassa tossicità. Qui, viene descritto un protocollo dettagliato per la creazione di pseudoislets umane dopo la trasduzione lentivirale utilizzando due piastre multiwell disponibili in commercio. Il protocollo può essere facilmente eseguito e consente una svalutazione efficiente dei geni e la valutazione del dinamismo della secrezione di insulina utilizzando cellule di isolazione umana. Pertanto, gli pseudoislets umani con modulazione genica mediata lentivirale forniscono un modello potente e versatile per valutare la funzione genica all'interno delle cellule dell'isolele umana.

La figura 1 illustra i passaggi chiave nella produzione di pseudoislets utilizzando una piastra di fissaggio ultra-bassa di 96 pozzetti e una piastra di coltura microwell. La figura 2a mostra cambiamenti sequenziali nella morfologia durante la formazione di pseudoislets da 3 x 103 cellule di isolotto umano in una piastra di fissaggio ultra-bassa di 96 pozzetti. Il monostrato o i ciuffi sciolti di cellule osservate nel ...

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Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Viene presentato un protocollo per creare pseudoislets umani modificati in gene da cellule di isole umane disperse che vengono tradusse da lentivirus che trasportano RNA a forcina corta (shRNA). Questo protocollo utilizza vasi enzimatici e di coltura prontamente disponibili, può essere eseguito facilmente e produce pseudoislets umani geneticamente modificati adatti per studi funzionali e morfologici.

Lentiviral mediato gene silenziamento in pseudoislet umano preparato in piastre a basso attaccamento

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

È difficile modulare l'espressione genica negli isolotti umani, anche un maggiore declino degli isolotti umani funzionanti pone grandi sfide dopo la modulazione dell'espressione genica. Combinando la trasduzione mediata da lentivirus SHR8 e la formazione di isolotti adatti all'uomo. Questo protocollo consente un'efficiente downregulation di un gene mirato preservando la funzione isolotto durante la coltura prolungata.Per iniziare, ruotare delicatamente la bottiglia di spedizione per mantenere gli isolotti in sospensione. Trasferire il mezzo di spedizione contenente isolotti in un tubo di centrifuga conico da 50 millilitri. Lasciare riposare il tubo in un armadietto di sicurezza biologico per 15 minuti in modo che gli isolotti si sistemino sul fondo del tubo.Rimuovere delicatamente il mezzo di spedizione utilizzando una pipetta capillare senza disturbare il pellet di isolotto. Sospendere di nuovo il pellet di isolotto nel mezzo CMRL con albumina siere umana all'1% a una concentrazione di 400 isolotti equivalenti per millilitro. Trasferire gli isolotti in un piatto trattato con coltura non tissutale e coltarli a 37 gradi celsius in un incubatore di anidride carbonica del 5% durante la notte.Dopo la coltura notturna, trasferire isolotti umani in un tubo di centrifuga conico da 15 millilitri, centrifugare a 250 volte g per cinque minuti in un rotore a secchio oscillante. E aspirare il mezzo con una pipetta capillare senza disturbare il pellet di isolotto. Lavare il pellet aggiungendo 10 millilitri di PBS al tubo, mescolare delicatamente e centrifugare a 250 volte g per cinque minuti.Dopo la centrifugazione, aspirare PBS senza disturbare il pellet di isolotto. Sospendere di nuovo il pellet in 0,5 millilitri di una miscela enzimatica proteolitica e collagenolitica prerimpita. Pipetta cinque volte utilizzando una pipetta P1000 per mescolare isolotti.Incubare a 37 gradi celsius per cinque minuti. Dopo l'incubazione, mescolare delicatamente la pipetta che accarezza su e giù. Verificare la nuvolosità a singola cella e il numero di fiocchi o isolotti non digeriti.Mettere un colino da 40 micron in una piastra di Petri di 35 millimetri e bagnare il colino aggiungendo un millilitro di mezzo CMRL con siero bovino fetale inattivato al calore del 10% e deprimente con uno stantuffo per siringhe da un millilitro. Trasferire tutte le sospensioni cellulari sopra il filtro. E raccogliere il passaggio attraverso in un tubo fresco da 15 millilitri.Lavare il tubo utilizzato per la digestione dell'isolotto con 0,5 millilitri di mezzo CMRL fresco per raccogliere le cellule rimanenti e passare il lavaggio attraverso il colino. Unire il passaggio in un tubo da 15 millilitri. Ripeti una volta.Per dissociare gli isolotti non digeriti rimasti sul colino, premere il colino con uno stantuffo per siringhe millilitro. Raccogliere nuovamente il passaggio e lavare il colino con un mezzo CMRL 1066 fresco e semplice per rimuovere tutti gli isolotti digeriti rimanenti dal colino e dal piatto. Aggiungere il passaggio al tubo da 15 millilitri.Registrare il volume totale della sospensione cellulare e prendere un'aliquota di 10 microliter di cellule per contare il numero di cellulare su un emocitometro. Dopo aver centrifugato la sospensione cellulare per cinque minuti a 200 volte g, rimuovere il mezzo senza disturbare il pellet. Per produrre pseudo-isolotti utilizzando una piastra di attacco 96 ben ultra bassa, prima calcola il volume totale delle celle richieste una volta 10 alla quinta per millilitro della sospensione a singola cella.Quindi, sospendere di nuovo il pellet di isolotto nel mezzo CMRL con siero bovino fetale inattivato al calore del 10% in modo che 30 microlitri della sospensione cellulare abbia 3000 cellule. Successivamente, trasferire il volume richiesto della sospensione a cella singola in un tubo fresco da 15 millilitri. A 250 unità di trasduzione per cellula di un lentivirus contenente SH-RNA che prende di mira un gene di interesse o un controllo.Per mescolare la sospensione cellulare con il virus, pipettare delicatamente cinque volte con una pipetta P1000. Quindi trasferire le cellule miste in un serbatoio di reagente sterile da 50 millilitri se si utilizza una pipetta a otto canali. Con una pipetta a otto canali o una pipetta P200, erogare 30 microlitri per pozzo della sospensione cellulare mescolata con lentivirus in ogni pozzo.Quindi, centrifugare la piastra del pozzo 96 in una centrifuga a benna oscillante a 270 volte g a temperatura ambiente per sette minuti. Coltura a 37 gradi celsius in un incubatore umidificato del 5% di anidride carbonica durante la notte. Dopo l'incubazione, rimuovere la piastra del pozzo 96 dall'incubatrice e posizionarla nell'armadio di sicurezza biologico.Pipetta 100 microlitri per isolotto di FBSCMRL alto 10% in un pozzo per evitare l'essiccazione degli isolotti e continuare a coltura per una settimana. Pipetta 100 microlitri per pozzo di mezzo CMRL con siero bovino fetale inattivato al calore del 10% dal serbatoio agli pseudo-isolotti e pipetta su e giù da due a tre volte delicatamente nel pozzo per sollevare gli isolotti. Quindi, aspirare il mezzo nel pozzo contenente uno pseudo-isolotto ed espellere in una piastra di petri di 10 centimetri.Controllare la piastra al microscopio luminoso per garantire la completa rimozione di tutti gli pseudo-isolotti e procedere agli esperimenti a valle. Per produrre pseudo-isolotti utilizzando una piastra di coltura di 24 micro pozzi, aggiungere prima 500 microlitri per pozzo di una soluzione di risciacquo anti-aderenza. Centrifuga a 1300 volte g per cinque minuti in una centrifuga a benna oscillante.Quindi, osservare la piastra al microscopio per assicurarsi che le bolle d'aria vengano rimosse dai micro-pozzi. In un armadio di sicurezza biologico, aspirare la soluzione di risciacquo anti-aderenza dai pozzi. Risciacquare ogni bene con due millilitri di caldo mezzo CMRL 1066 una volta.Quindi, aspirare il semplice mezzo CMRL 1066 e aggiungere 0,5 millilitro per pozzo di CMRL caldo con siero bovino fetale inattivato al 10% a ciascuno ben pianificato per l'uso. Determinare il numero totale di celle necessarie per ogni pozzo. Sospendere di nuovo le singole cellule in 0,8 millilitri di mezzo CMRL con siero bovino fetale inattivato al calore al 10% in un tubo sterile da 1,5 millilitri.Per creare un pozzo di pseudo-isolotto trasdotto da un lentivirus, aggiungere 125 unità di trasduzione per cellula alla sospensione a singola cellula mantenendo il volume del virus al di sotto di 0,2 millilitri. Incubare la miscela cellulare e virale a 37 gradi Celsius con miscelazione delicata occasionale per un'ora per consentire il contatto delle cellule con il virus prima della condensazione delle cellule. Dopo un'ora, regolare il volume totale della cellula isolotto e della miscela virale su un millilitro aggiungendo il mezzo CMRL con siero bovino fetale inattivato al calore del 10%.Se le cellule formano grumi dopo un'ora di incubazione, disperdersi in una singola sospensione cellulare mediante pipettazione delicata e rapida da due a tre volte. Trasferire la sospensione cellulare in un pozzo della piastra di coltura del micro-pozzo da 24 pozzi. Immediatamente dopo la pipettazione, centrifugare a 100 volte g a temperatura ambiente per tre minuti per catturare le cellule in tutti i micro-pozzi.Osservare al microscopio per verificare che le cellule siano distribuite uniformemente in tutti i micro-pozzi. È fondamentale centrifugare la piastra del micro-pozzo subito dopo aver aggiunto il pozzo mescolando la sospensione a cella singola dell'isolotto nei pozzi. I cambiamenti sequenziali nella morfologia degli pseudo-isolotti da 3000 cellule isolotti umane creati in una piastra di attacco ben ultra bassa hanno mostrato monostrato o ciuffi sciolti di cellule trasformate in aggregati solidi con un bordo rotondo liscio in una settimana.Al contrario, in una piastra di coltura di micro-pozzi, la formazione di cellule e pseudo-isolotti da sole 500 cellule isolotti è solitamente visibile entro quattro giorni. La dimensione uniforme degli pseudo-isolotti riduce la variazione all'interno di un gruppo di prova e consente l'incubazione statica utilizzando solo cinque pseudo-isolotti per misurazione. Il Perry Fusion Assay per la risposta all'insulina ha mostrato che gli pseudo-isolotti umani hanno mantenuto una robusta secrezione di insulina della prima fase in risposta al glucosio dopo sette giorni di coltura.L'introduzione del lentivirus che prende di mira la trigliceridi lipasi adiposa umana o perilipin cinque geni in una sospensione a singola cellula garantisce la trasduzione efficiente e omogenea delle cellule isolottiche e raggiunge una downregulation altamente efficiente dei geni. È importante ricordare che il tempo necessario per disperdere l'isolotto umano in singole cellule è influenzato da molti fattori come: dimensioni, distribuzione e caratteristica del donatore. Quindi, è importante prestare molta attenzione alla scomparsa degli isolotti umani durante la digestione.In tutto il protocollo è importante gestire delicatamente la sospensione a cella singola per evitare la perdita di cellule. Gli pseudo-isolotti umani creati possono essere usati per molte applicazioni per determinare l'effetto della modulazione genica come:Western Blot, studio istologico e misurazioni dei tassi di consumo di ossigeno. Questo protocollo consente di valutare il basso livello di gene mirato nella regolazione della salute degli isolotti e la funzione negli isolotti umani utilizzando software da laboratorio comuni e tecniche semplici.L'uso di isolotti umani può richiedere l'approvazione preventiva di un comitato di revisione locale. Si prega di consultare il comitato di revisione locale prima dell'inizio dello studio. Il lentivirus è classificato come livello di biosicurezza due.Contattare il comitato di biosicurezza prima dell'inizio dell'uso del lentivirus.

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