Name: lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates
Uploaded: 2019-05-14T13:30:00
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この研究は、国立衛生研究所(R01-DK090490)とY.I.に対する米国糖尿病協会(1-17-IBS-132)によって財政的に支援されました。J.A.とY.I.は、イーグルス糖尿病研究センターの友愛会順によってサポートされています。A.B.は国立衛生研究所の研修助成金(T32NS45549)によってサポートされています。著者らは、NIDDKが出資する統合島流通プログラム(IIDP)が提供するヒト膵島を希望の都市(2UC4DK098085)で利用した。

研究開始に先立ち、アイオワ大学機関レビュー委員会がヒト被験者の研究判断を行い、その研究がヒト被験者研究の基準を満たしていないと判断した。研究の開始前に現地の審査委員会に相談して、島の供給源と計画された研究に事前の承認が必要かどうかを判断します。
注:通常、1,200~1,400個のヒト島(IEQ)は、96ウェルの超低アタッチメントプレートまたは1,...

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	<li>Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta+cell+mass+and+function+in+diabetes:+Recent+advances+in+knowledge+and+technologies+to+understand+disease+pathogenesis.">Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).</li><li>Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+flexible+system+for+glucose+homeostasis.">Stable and flexible system for glucose homeostasis.</a> Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).</li><li>Cryer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Glucagon+in+the+pathogenesis+of+hypoglycemia+and+hyperglycemia+in+diabetes.">Minireview: Glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes.</a> Endocrinology. 153 (3), 1039-1048 (2012).</li><li>Arrojo e Drigo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+architecture+of+the+islet+of+Langerhans:+a+focused+cross-species+assessment.">New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment.</a> Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).</li><li>Harata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+shRNA+via+lentivirus+in+human+pseudoislets+provides+a+model+to+test+dynamic+regulation+of+insulin+secretion+and+gene+function+in+human+islets.">Delivery of shRNA via lentivirus in human pseudoislets provides a model to test dynamic regulation of insulin secretion and gene function in human islets.</a> Physiological Reports. 6 (20), e13907 (2018).</li><li>Barbu, A. R., Akusjarvi, G., Welsh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+transduction+of+human+pancreatic+islets:+importance+of+adenoviral+genome+for+cell+viability+and+association+with+a+deficient+antiviral+response.">Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response.</a> Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).</li><li>Hughes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+to+improve+pancreatic+islet+transplantation+for+Type+1+diabetes+mellitus.">Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus.</a> Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).</li><li>Jimenez-Moreno, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+High+Efficiency+Intra-Islet+Transduction+Protocol+Using+Lentiviral+Vectors.">A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors.</a> Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).</li><li>Bonora, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+correlates+of+post-prandial+hyperglycaemia+in+a+large+sample+of+patients+with+type+2+diabetes+mellitus.">Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).</li><li>Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. L., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+reassociation+of+dispersed+adult+rat+pancreatic+islet+cells+into+aggregates+with+three-dimensional+architecture+typical+of+native+islets.">Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets.</a> Diabetes. 36 (7), 783-790 (1987).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+pseudoislets+form+efficiently+from+donated+tissue,+compare+favourably+with+native+islets+in+vitro+and+restore+normoglycaemia+in+mice.">Bioengineered human pseudoislets form efficiently from donated tissue, compare favourably with native islets in vitro and restore normoglycaemia in mice.</a> Diabetologia. 61 (9), 2016-2029 (2018).</li><li>Zuellig, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+physiological+properties+of+gravity-enforced+reassembled+rat+and+human+pancreatic+pseudo-islets.">Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).</li><li>Caton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+transduction+of+connexin+cDNAs+shows+level-+and+isoform-specific+alterations+in+insulin+secretion+of+primary+pancreatic+beta-cells.">Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells.</a> Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+beta+Cell+Function.">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li><li>Peiris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+human+diabetes-risk+gene+function+with+genetics+and+physiological+assays.">Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays.</a> Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).</li><li>Schlimgen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+Associated+With+Lentiviral+Vector+Exposures+and+Prevention+Strategies.">Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies.</a> Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+islet+for+improved+performance+by+optimized+reaggregation+in+alginate+gel+beads.">Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).</li><li>Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+re-aggregated+human+pancreatic+islets+for+secondary+drug+screening.">Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening.</a> British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).</li><li>Hilderink, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+aggregation+of+primary+human+pancreatic+islet+cells+leads+to+glucose-responsive+pseudoislets+comparable+to+native+islets.">Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).</li><li>Saunders, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectonucleoside+Triphosphate+Diphosphohydrolase-3+Antibody+Targets+Adult+Human+Pancreatic+beta+Cells+for+In+Vitro+and+In+Vivo+Analysis.">Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis.</a> Cell Metabolism. (18), (2018).</li><li>Reissaus, C. A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reestablishment+of+Glucose+Inhibition+of+Glucagon+Secretion+in+Small+Pseudoislets.">Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets.</a> Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).</li></ol>

ここで、96ウェル超低アタッチメントプレートまたはマイクロウェル培養プレートを用いてレンチウイルスによって誘導されるヒト擬似液を生成する詳細なプロトコルが提示される。擬似島は、天然ヒト島に類似した形態および分泌機能を示すために報告されており、インビトロ5、11、18で長期間培養することができる。?...

機能性β細胞塊の喪失は、1型および2型糖尿病1の両方の中心病理である。β細胞は膵島におけるインスリンの産生であるが、β細胞と非β細胞との間の通信は、インスリン分泌2の調節において重要な役割を果たす。また、グルカゴン分泌の調節不自由は糖尿病3における高血糖に寄与する。したがって、膵島内の細胞の遺伝子発現を調節し、糖尿病における膵島機能障害の発症のメカニズムに対処することに強い関心がある。トランスジェニックマウスを含む様々なアプローチは、マウス島の遺伝子発現を調節するために利用可能である。しかしながら、ヒトおよびマウスの島は、明確な内向性、細胞分布、β対α細胞の比率、および分泌物4に対する応答を示す。したがって、ヒト膵島における遺伝子機能の直接評価は、ヒト膵島の病態生理学を理解するために非常に重要である。
アデノウイルスベクターは、非分裂細胞におけるトランスダクションの高効率に起因するインビトロで膵島をトランスデュースするために最も広く使用されているウイルスベクターである。しかしながら、アデノウイルスは、特にヒト島5において効率的に島のコアに浸透せず、高用量6で細胞傷害性である。比較的、レンチウイルスベクターは細胞傷害性が低く、外因性遺伝子をポスト有人細胞の染色体に永久に産生し、遺伝子治療7の広くテストされた手段となる。しかしながら、無傷のヒト島のコアに侵入するレンチウイルスの能力も制限され、従って経誘導効率を高めるために酵素消化による部分的な分散を必要とする8。無傷のヒト島の分散に伴う注意点は、細胞および細胞マトリックス通信の中断であり、これはヒトにおけるグルコース恒常性の維持に不可欠なインスリン分泌の動的調節を損なう9。したがって、ヒト島のモデルにおける島機能の動的調節に対する遺伝子変調の影響を評価することは困難であった。
ヒトとげっ歯類の島から分散した島細胞が「擬似島」と呼ばれる島様構造に自律的に再凝集させることが知られている。擬似島は、原住民の島10、11と同様のβおよび非β細胞分布を示す。さらに、長期培養後、天然島は徐々に堅牢な第1相インスリン分泌5、10、11、12を失う。しかしながら、擬似島は、同じ培養期間5の後に天然島と比較してグルコースに応答して第1相インスリン分泌のより良い保存を実証した。インスリン分泌のより良い保存に加えて、低アタッチメントプレート11におけるヒトイヌレット細胞のサイズ制御再凝集は、その再凝集前にレンチウイルスベクターを導入する機会の窓を提供する。擬似島。いくつかの研究は、レンチウイルス媒介伝達伝達と組み合わせた擬似島の有用性を実証している。Caton et al. al. は13,レンチウイルスを発現する緑色蛍光タンパク質(GFP)の導入は、非感染対照と比較してラット擬似性のGFPの均質な発現を達成しながら、インスリン分泌にほとんど影響を及ぼさないことを報告した。彼らはまた、レンチウイルス13を介してコネキシン32、36、および43を過剰発現することにより、インスリン分泌に対する異なるコネキシンの特定の効果を実証した。市販の96ウェル超低アタッチメントプレートを用いて調製されたヒト擬似酵素は、転写因子SIX3のレンチウイルス媒介過剰発現が静的インキュベーション14によって評価されるインスリン分泌を改善することを実証した。最近では、96ウェルの超低アタッチメントプレートで調製したヒト擬似糸は、グルキナーゼをレンチウイルスショートヘアピンRNA(shRNA)を介して下方調整し、グルコース刺激インスリン分泌が減少することを示す原理の証明として用いられた。KCl刺激インスリン分泌は5を保存した。この研究はまた、ヒト擬似離島が遺伝子発現および分泌プロファイルにおける天然島に類似していることを実証し、さらに、島機能5の調節を解剖するヒト擬似島の有用性を支持する。多灌合は行われなかったが、最近市販されたバイオエンジニアリングマイクロウェル培養プレートは、レンチウイルス伝達に適合すると報告され、優れたインスリンを発揮するヒト擬似性を産生した。移植後のインビトロとインビボでの分泌11.集合的に、レンチウイルス伝達と組み合わせたヒト擬似スサイスレット形成は、ヒト島の病態生理学を調査するための簡単で効率的なアプローチであり、ヒト島における機械的研究を行うための貴重なツールを提供する。
本報告では、市販の2つのプラットフォームを用いてレンチウイルスで誘導されたヒト擬似性を形成するプロトコル、96ウェル超低アタッチメントプレートおよびマイクロウェル培養プレートが提示される。どちらも遺伝子発現の効率的な変調を実現し、静的インキュベーションやペリフュージョンを含む下流評価に対応するヒト擬似液を作成します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series Type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer, 40 micrometer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11530037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Trizol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marien Feld</td>
			<td>Neubauer-Improved Bright line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>11-350-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube, 1.5 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microwell culture plate</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>34411</td>
			<td>Aggrewell 400, 24 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motor-driven pestle</td>
			<td>GAMUT</td>
			<td>#399X644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-tissue culture treated dish, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 mm</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 5 mL</td>
			<td>DOT Scientific,</td>
			<td>667205B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 8-channel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#613-5253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>667210B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P10</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P200</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P1000</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteolytic and collagenolytic enzyme mixture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6965</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagent reservoir, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversible strainer, 37 micrometer</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>27251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket plate centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-14R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SX4750A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin syringe, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra low attachment microplate, 96 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4515</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates

糖尿病研究のために島の遺伝子の機能を解剖するために、げっ歯類の膵島の遺伝子を調節するための様々な遺伝的ツールが利用可能です。しかし、げっ歯類の島から得られたデータは、種間の島の構造と機能のよく知られた違いのために、ヒト島で完全に再現または適用可能でないことが多い。現在、ヒト島の遺伝子発現を操作するために利用できる技術は非常に限られている。アデノウイルス、プラスミド、オリゴヌクレオチドによる無傷の島へのトランスジーンの導入は、多くの場合、低効率および高毒性に苦しむ。低効率は、高効率を必要とする無傷の島における遺伝子ダウンレギュレーション研究において特に問題となる。酵素的に分散した島細胞は、擬似性と呼ばれるスフェロイドを形成する培養中に再凝集させることが知られている。ヒト島細胞のサイズ制御された再凝集は、長期培養後に動的な第1相インスリン分泌を維持し、毒性の低いレンチウイルスショートヘアピンRNA(shRNA)を効率的に導入する窓を提供する擬似的な物質を作成する。ここで、2つの市販のマルチウェルプレートを用いたレンチウイルス伝達後のヒト擬似液性の作成のための詳細なプロトコルについて説明する。プロトコルは容易に行うことができ、遺伝子の効率的なダウンレギュレーションとヒトのイレット細胞を使用したインスリン分泌のダイナミズムの評価を可能にする。したがって、レンチウイルス媒介遺伝子変調を有するヒト擬似性液は、ヒト島細胞内の遺伝子機能を評価するための強力で汎用性の高いモデルを提供する。

図1は、96ウェル超低アタッチメントプレートとマイクロウェル培養プレートを用いて擬似液を製造する上での重要なステップを示す。図2aは、96ウェル超低アタッチメントプレートにおける3 x 103ヒト島細胞からの擬似性細胞形成中の形態の逐次変化を示す。1日目に観察された細胞の単層または緩い塊は、5日目から7...

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Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

短いヘアピンRNA(shRNA)を運ぶレンチウイルスによってトランスネクションされた分散ヒトイストレット細胞から遺伝子改変ヒト擬似を作成するプロトコルが提示される。このプロトコルは、容易に入手可能な酵素および培養容器を利用し、容易に行うことができ、機能的および形態学的研究に適した遺伝子改変ヒト擬似性を産生する。

低アタッチメントプレートで調製されたヒト擬似スイスレットにおけるレンチウイルス媒介遺伝子サイレンシング

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

ヒト小島の遺伝子発現を調節することは困難であり、また、機能するヒト小島の減少は、遺伝子発現の調節後に大きな課題をもたらす。レンチウイルスを介してSHR8導入とヒト適当な小島の形成を組み合わせることにより。このプロトコルは、長期培養中に小細胞機能を維持しながら、標的遺伝子の効率的なダウンレギュレーションを可能にする。まず、出荷ボトルをそっと旋回して島をサスペンションに入れます。50ミリリットル円錐形遠心分離管に島を含む輸送媒体を移します。小島がチューブの底に落ち着くように、チューブを生物学的安全キャビネットに15分間座らせます。島のペレットを邪魔することなく、キャピラリーピペットを使用して、出荷媒体を優しく取り除きます。1ミリリットル当たり400個の島液換算の濃度に1%ヒト血清アルブミンを有するCMRL培地中の島ペレットを再懸濁する。小島を非組織培養処理皿に移し、一晩5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で培養する。一晩培養した後、人間の小島を15ミリリットル円錐形遠心管に移し、250倍gで遠心分離機を5分間振るバケットローターで行う。そして、島ペレットを乱すことなく毛細管ピペットで培地を吸引する。ペレットをチューブに10ミリリットルのPBSを加えて洗い、250倍gで5分間静かに遠心分離機を混ぜます。遠心分離後、島ペレットを乱さずにPBSを吸引する。ペレットを、あらかじめ温めたタンパク質分解酵素およびコラージュ分解酵素混合物の0.5ミリリットルに再懸濁します。ピペットは、ピペットを5回使用して、小島を混合するピペットを使用する。摂氏37度で5分間インキュベートします。インキュベーションの後、ピペットを上下に軽く混ぜます。単一細胞の曇りや、フレークまたは未消化の小島の数を確認します。35ミリメートルのシャーレに40ミクロンのストレーナーを入れ、10%の熱不活化牛血清でCMRL培地1ミリリットルを加え、1ミリリットルのシリンジプランジャーで落ち込んでストレーナーを濡らします。ストレーナーの上にすべての細胞懸濁液を移します。そして、新鮮な15ミリリットルのチューブに通過を収集します。新鮮なCMRL培地の0.5ミリリットルで小子消化に使用されるチューブを洗浄し、残った細胞を収集し、ストレーナーを通して洗浄を渡します。15ミリリットルのチューブに通過を組み合わせます。1 回繰り返します。ストレーナーに残っている未消化の小島を解震するには、ストレーナーに1ミリリットルのシリンジプランジャーを押します。もう一度通過を収集し、ストレーナーと皿から残りのすべての消化された小島を削除するために、新鮮なプレーンCMRL 1066培地でストレーナーを洗います。15ミリリットルのチューブにパスを追加します。細胞懸濁液の総体積を記録し、10マイクロリットルの細胞アリコートを取り、ヘモサイトメーター上の細胞数を数える。細胞懸濁液を200回gで5分間遠心した後、ペレットを乱さずに培地を取り除く。96ウェル超低添付プレートを用いて擬似小島を生成するために、まず、単一細胞懸濁液のミリリットル当たり10〜5番目の細胞に必要な総体積を算出する。次いで、30マイクロリットルの細胞懸濁液が3000個の細胞を有するように、10%熱不活化牛胎児血清を用いてCMRL培地中の小島ペレットを再懸濁する。次に、単一細胞懸濁液の必要量を15ミリリットルの新鮮なチューブに移す。目的の遺伝子または対照を標的とするSH-RNAを含むレンチウイルスの細胞当たり250の伝達単位で。ウイルスと細胞懸濁液を混合するために、P1000ピペットでピペットを5回穏やかにする。その後、8チャネルピペットを使用する場合は、混合細胞を50ミリリットルの滅菌試薬リザーバーに移します。8チャンネルピペットまたはP200ピペットを使用して、レンチウイルスと混合した細胞懸濁液のウェルあたり30マイクロリットルを各ウェルに分配します。次に、96ウェルプレートを室温で270倍gのスイングバケットプレート遠心分離機に7分間遠心する。加湿した5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で培養。インキュベーション後、インキュベーターから96ウェルプレートを取り出し、生物学的安全キャビネットに入れなさい。ピペット100マイクロリットル100マイクロリットルの10%高FBSCMRLを井戸に入れ、小島の乾燥を防止し、1週間培養を続ける。貯留層から疑似小島およびピペットに10%の不活化胎児ウシ血清を有するCMRL培地のウェル当たりピペット100マイクロリットルは、ウェルで2〜3回穏やかに上下して小島を持ち上げる。次いで、疑似小水を含むウェル内の培地を吸引し、10センチメートルのシャーレに排出する。すべての疑似小島を完全に取り除くかどうかを確認するために、光学顕微鏡でプレートを確認し、下流の実験に進みます。24ウェルマイクロウェル培養プレートを使用して擬似小島を製造するには、まず、抗付着リンス溶液のウェルあたり500マイクロリットルを加えます。振るバケットプレート遠心分離機で5分間1300回gで遠心分離機。次に、マイクロウェルから気泡を取り除くために、顕微鏡でプレートを観察します。生物学的安全キャビネットでは、ウェルから抗付着リンス溶液を吸引する。2ミリリットルの温かいプレーンCMRL 1066培地を1回ずつよくすすいでください。次いで、プレーンCMRL1066培地を吸引し、10%熱不活化ウシウシ血清を用いた温かいCMRLのウェルあたり0.5ミリリットルを使用予定の各ウェルに加える。各ウェルに必要なセルの総数を決定します。滅菌1.5ミリリットルチューブで10%熱不活化胎児ウシ血清でCMRL培地の0.8ミリリットルで単一細胞を再懸濁します。レンチウイルスによってトランスデューティされる擬似アイレットの1つの井戸を作成するには、1細胞当たり125のトランスダクションユニットを1細胞懸濁液に加え、ウイルスの量を0.2ミリリットル以下に抑えます。細胞とウイルスの混合物を摂氏37度で1時間穏やかに混合してインキュベートし、細胞の凝縮前にウイルスとの接触を可能にする。1時間後、10%の熱不活化ウシウシ血清でCMRL培地を添加することにより、1ミリリットルに小口細胞およびウイルス混合物の総体積を調整する。細胞が1時間後に塊を形成する場合、2〜3回穏やかで迅速なピペット処理によって単一の細胞懸濁液に分散する。細胞懸濁液を24ウェルマイクロウェル培養プレートの1つのウェルに移します。ピペット処理の直後に、室温で100倍gの遠心分離機を3分間、すべてのマイクロウェルに細胞を捕捉する。顕微鏡で観察し、細胞がすべてのマイクロウェルに均等に分布していることを確認します。小地の単細胞懸濁液をウェルに混合してよく加えた直後にマイクロウェルプレートを遠心分離することが重要です。96ウェル超低添付着プレートで作成された3000個のヒト小島細胞からの疑似島の形態の連続的な変化は、1週間で滑らかな丸い境界を持つ固体凝集体に変わった細胞の単層または緩い塊を示した。対照的に、マイクロウェル培養プレートでは、わずか500個の島細胞からの細胞および疑似小島の形成は、通常4日以内に見える。擬似小島の均一なサイズはテストグループ内の変動を減らし、測定ごとにわずか5個の疑似小島を使用して静的インキュベートを可能にします。インスリン応答のためのペリー融合アッセイは、培養7日後のグルコースに応答してヒト擬似小島が堅牢な第1相インスリン分泌を維持することを示した。ヒト脂肪トリグリセリドリパーゼまたはペリリピン5遺伝子を標的とするレンチウイルスを単一細胞懸濁液に導入することにより、イレット細胞の効率的かつ均質な転移が保証され、遺伝子の極めて効率的なダウンレギュレーションが実現されます。ヒトの小地を単一細胞に分散するのに要する時間は、サイズ、分布、ドナー特性などの多くの要因によって影響を受けることを覚えておくことが重要です。だから、消化中に人間の島の消失に細心の注意を払うことが重要です。プロトコル全体を通して、細胞の損失を避けるために、単一セルの懸濁液を穏やかに処理することが重要です。作成されているヒト擬似小島は、例えば、ウェスタンブロット、組織学的研究、酸素消費率の測定などの遺伝子変調の効果を決定するために、多くのアプリケーションに使用することができます。このプロトコルは、一般的なラボウェアと簡単な技術を使用して、島の健康とヒト島の機能の調節における標的遺伝子の低さを評価することができます。人間の島の使用は、地元の審査委員会からの事前承認を必要とする場合があります。調査を開始する前に、現地の審査委員会に相談してください。レンチウイルスは、バイオセーフティレベル2に分類される。レンチウイルスの使用開始前にバイオセーフティ委員会に連絡してください。

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

新たに単離したヒト絨毛細胞栄養芽層に対するsiRNAトランスフェクションおよびEMSA分析

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

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Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

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隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

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Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

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クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9 仲介の対象となる統合生体内で相同性を介した終わり参加ベースの戦略を使用して

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

細胞分裂に CRISPR/Cas9 を介した遺伝子ノックアウトのインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターの生産のためのプロトコル

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

クロマチンのループ構造の再編を CRISPR 媒介

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

レンチ ウイルス媒介トランスジェニック マウスの生産: シンプルで高効率な創設者の直接の研究法

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...