Name: lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates
Uploaded: 2019-05-14T13:30:00
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이 작품은 Y.I.에 건강의 국립 연구소에 의해 재정적으로 지원되었다 (R01-DK090490) Y.I.에 미국 당뇨병 협회 (1-17-IBS-132). J.A. 및 Y.I.는 이글스 당뇨병 연구 센터의 형제 순서에 의해 지원됩니다. A.B.는 국립 보건원 교육 교부금(T32NS45549)의 지원을 받고 있습니다. 저자는 희망의 도시 (2UC4DK098085)에서 NIDDK 자금 통합 섬 분배 프로그램 (IIDP)에 의해 제공되는 인간의 췌도를 활용.

연구의 개시하기 전에, 인간 과목 연구 결정은 아이오와 대학 기관 검토 위원회에 의해 만들어졌다, 누가 연구가 인간 과목 연구에 대한 기준을 충족하지 않는 결정. 연구가 시작되기 전에 지역 검토 위원회에 문의하여 섬및 계획된 연구의 출처가 사전 승인이 필요한지 확인하십시오.
참고: 일반적으로, 인간 작은 섬의 1,200-1,400 섬 등가물 (IEQ)는 96 웰 초저 부착 플...

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	<li>Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta+cell+mass+and+function+in+diabetes:+Recent+advances+in+knowledge+and+technologies+to+understand+disease+pathogenesis.">Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).</li><li>Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+flexible+system+for+glucose+homeostasis.">Stable and flexible system for glucose homeostasis.</a> Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).</li><li>Cryer, P. 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R., Akusjarvi, G., Welsh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+transduction+of+human+pancreatic+islets:+importance+of+adenoviral+genome+for+cell+viability+and+association+with+a+deficient+antiviral+response.">Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response.</a> Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).</li><li>Hughes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+to+improve+pancreatic+islet+transplantation+for+Type+1+diabetes+mellitus.">Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus.</a> Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).</li><li>Jimenez-Moreno, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+High+Efficiency+Intra-Islet+Transduction+Protocol+Using+Lentiviral+Vectors.">A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors.</a> Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).</li><li>Bonora, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+correlates+of+post-prandial+hyperglycaemia+in+a+large+sample+of+patients+with+type+2+diabetes+mellitus.">Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).</li><li>Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+physiological+properties+of+gravity-enforced+reassembled+rat+and+human+pancreatic+pseudo-islets.">Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).</li><li>Caton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+transduction+of+connexin+cDNAs+shows+level-+and+isoform-specific+alterations+in+insulin+secretion+of+primary+pancreatic+beta-cells.">Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells.</a> Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+beta+Cell+Function.">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li><li>Peiris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+human+diabetes-risk+gene+function+with+genetics+and+physiological+assays.">Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays.</a> Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).</li><li>Schlimgen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+Associated+With+Lentiviral+Vector+Exposures+and+Prevention+Strategies.">Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies.</a> Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+islet+for+improved+performance+by+optimized+reaggregation+in+alginate+gel+beads.">Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).</li><li>Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+re-aggregated+human+pancreatic+islets+for+secondary+drug+screening.">Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening.</a> British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).</li><li>Hilderink, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+aggregation+of+primary+human+pancreatic+islet+cells+leads+to+glucose-responsive+pseudoislets+comparable+to+native+islets.">Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).</li><li>Saunders, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectonucleoside+Triphosphate+Diphosphohydrolase-3+Antibody+Targets+Adult+Human+Pancreatic+beta+Cells+for+In+Vitro+and+In+Vivo+Analysis.">Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis.</a> Cell Metabolism. (18), (2018).</li><li>Reissaus, C. A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reestablishment+of+Glucose+Inhibition+of+Glucagon+Secretion+in+Small+Pseudoislets.">Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets.</a> Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).</li></ol>

여기서, 96웰 초저부착플레이트 또는 마이크로웰 배양판을 이용하여 렌티바이러스에 의해 트랜스화된 인간 의사를 생성하는 상세한 프로토콜이 제시된다. 가성이슬렛은 네이티브 인간 섬과 유사한 형태 및 분비 기능을 입증하는 것으로 보고되었으며 시험관내 5,11,18에서장기간 배양될 수 있다. 크기의 넓은 변화를 보여주는 ?...

기능성 베타 세포 질량의 손실은 타입-1과 타입-2 당뇨병둘다를 위한 중앙 병리1입니다. 베타 세포는 췌도에서 인슐린의 생산자인 반면, 베타 세포와 비베타 세포 간의 통신은 인슐린 분비제2의 조절에 중요한 역할을 한다. 또한, 글루카곤 분비의 dysregulation는 당뇨병에 있는 고혈당증에 기여합니다3. 따라서, 췌도 내 세포의 유전자 발현을 조절하여 당뇨병에서 췌도 기능 장애의 발병 의 배후에 있는 기전을 해결하는 데 큰 관심이 있다. 형질전환 마우스를 포함하여 접근의 각종은 마우스 작은 섬의 유전자 발현을 조절하기 위하여 유효합니다. 그러나, 인간과 마우스 섬은 뚜렷한 내분, 세포 분포, 베타와 알파 세포의비율, 및 분비에 대한 반응을 보여준다 4. 따라서, 인간 췌도에서 유전자 기능의 직접적인 평가는 인간 췌도의 병리생리학을 이해하는 데 매우 중요하다.
아데노바이러스 벡터는 비분열 세포에서 의한 고효율의 형질전환으로 인해 시험관내에서 췌도를 트랜스듀서하는 데 가장 널리 사용되는 바이러스 벡터이다. 그러나, 아데노바이러스는 특히 인간 섬 5에서 효율적으로 작은섬의 중심부에 침투하지 않으며, 고용량6에서세포 독성이다. 비교적, 렌티바이러스 벡터는 세포독성이 적고 유사분열 후 세포의 염색체내로 외인성 유전자를 영구적으로 전달하여 유전자치료 7에 대해 널리 테스트된 비히클입니다. 그러나, 렌티바이러스가 그대로 인간 섬의 코어를 관통하는 능력도 제한되어, 따라서 효소 소화에 의한 부분분산이 요구되어감전 효율을 증가시킨다 8. 본래 인간 아일의 분산과 주의되는 것은 세포-세포-세포-매트릭스 통신의 중단이며, 이는 인간에서 포도당 항상성의 유지에 중요한 인슐린분비의 동적 조절을 손상시키는 9. 따라서, 인간 섬 모델에서 아일렛 기능의 동적 조절에 대한 유전자 변조의 영향을 평가하는 것이 어려웠습니다.
인간과 설치류 섬으로부터 분산된 섬 세포가 자율적으로 "의사"라고 불리는 작은 섬과 같은 구조로 재집계되는 것으로 알려져 있습니다. 슈도이스렛은 네이티브 아일렛10,11과유사한 베타 및 비베타 세포 분포를 보여준다. 또한, 장기 배양 후, 네이티브 아일렛은 점차적으로 강력한제 1 상 인슐린 분비를 잃게 5,10,11,12. 그러나, 의사이스렛은 동일한 배양 기간5이후 네이티브 아일렛에 비해 포도당에 반응하여 제1상 인슐린 분비의 더 나은 보존을 입증했다. 인슐린 분비의 더 나은 보존을 갖는 것 이외에, 낮은 부착 플레이트(11)에 있는 인간 적인 작은 세트 세포의 크기 통제한 재응계는 그들의 재응집에 의하여 lentivirus 벡터를 소개하는 기회의 창을 제공합니다 의사 입니다. 여러 연구는 렌티 바이러스 매개 전이와 결합 된 의사 이스틀릿의 유용성을 입증했다. Caton 등 13은 렌티바이러스를 발현하는 녹색 형광 단백질(GFP)의 도입이 비감염 대조군과 비교하여 쥐 의사에서 GFP의 균질발현을 달성하면서 인슐린 분비에 거의 영향을 미치지 않았다고 보고했다. 그(것)들은 또한 lentivirus13를통해 connexins 32, 36 및 43를 과발현하여 인슐린 분비에 다른 connexins의 특정 효력을 설명했습니다. 시판되는 96웰 초저부착플레이트로 제조된 인간 의사이슬렛은 렌티바이러스-매개된 전사 인자의 과발현이 정적 배양에 의해평가된 인슐린 분비를 향상시킨다는 것을 입증하였다 14. 최근, 96웰 초저부착플레이트로 제조된 인간 의사이스제임제는 글루코코키나제를 렌티바이러스 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 통해 글루코키나제를 하향조절하는 데 사용되었으며, 이는 포도당 자극인슐린 분비가 감소한다는 것을 입증하는 원리의 증거로서, KCl 자극된 인슐린 분비는5. 이 연구는 또한 인간의 의사가 유전자 발현 및 분비 프로파일에서 네이티브 아일렛과 유사하다는 것을 입증했으며, 더 나아가 아일렛 기능의조절을 해부하는 인간 의사들의 유용성을 뒷받침한다 5. 회음이 수행되지 는 않았지만, 최근 상용화 된 생체 공학 마이크로 웰 배양 판은 렌티 바이러스 트랜스덕션과 호환되며 우수한 인슐린을 나타내는 인간 의사 를 생산하는 것으로 보고되었습니다. 이식 후 생체외 및 생체내 분비물11. Lentiviral transduction과 결합된 인간 의사 형성은 인간 섬 병리생리학을 조사하는 간단하고 효율적인 접근법이며, 인간 아일레에서 기계론적 연구를 수행하는 귀중한 도구를 제공합니다.
현재 보고서에서는 상용 두 개의 플랫폼을 사용하여 렌티바이러스로 트랜스화된 인간 의사를 형성하는 프로토콜, 96웰 초저 부착 플레이트 및 마이크로웰 배양판이 제시된다. 둘 다 유전자 발현의 능률적인 변조를 달성하고 정적 배양 및 회수를 포함하여 다운스트림 평가에 호환되는 인간 의사 를 만듭니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series Type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer, 40 micrometer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11530037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Trizol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marien Feld</td>
			<td>Neubauer-Improved Bright line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>11-350-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube, 1.5 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microwell culture plate</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>34411</td>
			<td>Aggrewell 400, 24 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motor-driven pestle</td>
			<td>GAMUT</td>
			<td>#399X644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-tissue culture treated dish, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 mm</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 5 mL</td>
			<td>DOT Scientific,</td>
			<td>667205B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 8-channel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#613-5253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>667210B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P10</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P200</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P1000</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteolytic and collagenolytic enzyme mixture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6965</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagent reservoir, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversible strainer, 37 micrometer</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>27251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket plate centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-14R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SX4750A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin syringe, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra low attachment microplate, 96 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4515</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates

다양한 유전 도구는 당뇨병 연구를위한 췌도 유전자의 기능을 해부설치류의 췌도에서 유전자를 조절할 수 있습니다. 그러나 설치류 섬으로부터 얻은 데이터는 종 간의 섬 구조 및 기능의 잘 알려진 차이로 인해 인간 섬에 완전히 재현되거나 인체에 적용되지 않는 경우가 많습니다. 현재, 인간 적인 작은 섬의 유전자 발현을 조작하기 위하여 유효한 기술은 아주 제한됩니다. 아데노바이러스, 플라스미드 및 올리고뉴클레오티드에 의한 천체 섬으로의 이식유전자 도입은 종종 낮은 효율과 높은 독성을 갖는다. 낮은 효율은 고효율을 요구하는 온전한 작은 섬에 있는 유전자 다운조절 연구에서 특히 문제가 됩니다. 효소적으로 분산된 섬 세포가 슈도이슬이라고 불리는 스페로이드를 형성하는 배양에서 재집계되는 것으로 알려져 있다. 인간 섬 세포의 크기 조절 재연은 장기간 배양 후 동적 첫 번째 단계 인슐린 분비를 유지하고 독성이 낮은 렌티바이러스 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 효율적으로 도입할 수있는 창을 제공하는 의사 를 생성합니다. 여기서, 2개의 상업적으로 이용 가능한 멀티웰 플레이트를 사용하여 렌티바이러스 환전 후 인간 의사구성의 생성을 위한 상세한 프로토콜이 기재되어 있다. 이 프로토콜은 쉽게 수행될 수 있으며 인간 아일렛 세포를 사용하여 인슐린 분비의 역동성및 유전자의 효율적인 하향 조절을 가능하게 한다. 따라서, 렌티바이러스 매개 유전자 변조를 가진 인간 의사세포는 인간 섬 세포 내의 유전자 기능을 평가하는 강력하고 다양한 모델을 제공한다.

도 1은 96웰 초저 부착 플레이트 및 마이크로웰 배양 플레이트를 사용하여 의사이슬렛의 제조에 있는 주요 단계를 도시한다. 도 2a는 96웰 초저 부착 플레이트에서 3 x 103 인간 섬 세포로부터의 의사 형성 동안 형태학의 순차적 변화를 나타낸다. 1일째에 관찰된 세포의 단층 또는 느슨한 덩어리는 5일째부터 7일째까지 매끄...

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Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 운반하는 렌티바이러스에 의해 형화되는 분산된 인간 섬 세포로부터 유전자 변형된 인간 의사구성을 생성하는 프로토콜이 제시된다. 이 프로토콜은 쉽게 사용할 수있는 효소 및 배양 혈관을 활용하고, 쉽게 수행 할 수 있으며, 기능 및 형태 학적 연구에 적합한 유전자 변형 인간 의사 를 생산합니다.

렌티 바이러스는 낮은 부착 플레이트에 준비 인간의 의사에 유전자 침묵 중재

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

인간 섬에 있는 유전자 발현을 조절하는 것은 어렵고, 또한 기능하는 인간 섬의 더 중대한 쇠퇴는 유전자 발현의 변조 후에 중요한 도전을 제기합니다. 렌즈피바이러스를 결합하여 SHR8 트랜스듀션 및 인간 적합한 섬형성을 결합하였다. 이 프로토콜은 장기간 배양 중에 아일렛 기능을 보존하면서 표적 유전자의 효율적인 다운 레그규제를 허용합니다.시작하려면, 부드럽게 현탁액에 섬을 유지하기 위해 배송 병을 소용돌이. 섬이 함유된 배송 배지를 50밀리리터 원심분리기 튜브로 이송합니다. 튜브가 15분 동안 생물학적 안전 캐비닛에 앉아 섬이 튜브 바닥에 정착하도록 하십시오.모세관 파이펫을 사용하여 모세관 파이펫을 사용하여 선적 매체를 부드럽게 제거하십시오. CMRL 배지에서 1%의 인간 혈청 알부민으로, 밀리리터당 400개의 이슬레를 다시 중단한다. 섬들을 비조직 배양으로 옮기고 하룻밤 사이에 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양한다.하룻밤 문화 후, 인간 섬을 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고, 원심분리기는 스윙 버킷 로터에서 5분 동안 250배 g로 옮긴다. 그리고 섬 펠릿을 방해하지 않고 모세관 파이펫으로 매체를 흡인한다. 펠릿을 튜브에 10 밀리리터를 추가하여 부드럽게 섞고 원심분리기를 250배 g에서 5분간 섞습니다.원심 분리 후, 섬 펠릿을 방해하지 않고 PBS를 흡인. 미리 데워진 프로테오리틱 및 콜라주 용 효소 혼합물의 0.5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 파이펫은 P1000 파이펫을 사용하여 섬을 혼합합니다.섭씨 37도에서 5분간 배양하세요. 인큐베이션 후 파이펫을 위아래로 부드럽게 섞는다. 단일 셀 흐림및 플레이크 수 또는 소화되지 않은 섬수를 확인합니다.40 미크론 여과기를 35mm 페트리 접시에 넣고 CMRL 배지 1밀리리터를 10%의 열 불활성 태아 소 혈청으로 추가하고 1밀리리터 주사기 플런저로 우울하게 하여 스트레이너를 적시세요. 스트레이너 위에 있는 모든 셀 서스펜션을 전송합니다. 그리고 신선한 15 밀리리터 튜브에서 패스를 수집합니다.섬 소화에 사용되는 튜브를 신선한 CMRL 배지0.5 밀리리터로 세척하여 남은 세포를 수집하고 여과기를 통해 세척을 전달합니다. 15 밀리리터 튜브에 패스를 결합합니다. 한 번 반복합니다.스트레이너에 남아 있는 소화되지 않은 섬을 분리하려면 스트레이너를 1밀리리터 주사기 플런저로 누릅니다. 패스를 다시 수집하고 스트레이너를 신선한 일반 CMRL 1066 배지로 세척하여 남은 소화된 모든 섬을 여조및 접시에서 제거합니다. 패스를 15 밀리리터 튜브에 넣습니다.세포 현탁액의 총 부피를 기록하고 혈종계에 세포 수를 계산하기 위해 세포의 10 마이크로 리터 알리쿼트를 복용. 200배 g에서 5분간 세포 현탁액을 원심분리한 후, 펠릿을 방해하지 않고 배지를 제거한다. 96개의 음극저 부착판을 사용하여 의사 섬을 생성하기 위해, 먼저 단일 셀 서스펜션의 밀리리터당 10내지 10분의 1의 총 부피를 계산한다.이어서, CMRL 배지에서 섬 펠릿을 10%의 열불불성 태아소 혈청으로 다시 일시 중단하여 세포 현탁액의 30 마이크로리터가 3000개의 세포를 갖는다. 다음으로, 단일 셀 서스펜션의 필요한 부피를 신선한 15 밀리리터 튜브로 전송합니다. 관심 또는 대조군의 유전자를 표적으로 하는 SH-RNA를 포함하는 렌즈바이러스의 세포 당 250개의 전이 단위에서.세포 현탁액을 바이러스와 혼합하려면 P1000 파이펫과 부드럽게 5회 피펫을 섞습니다. 그런 다음 8개의 채널 파이펫을 사용하는 경우 혼합 세포를 50 밀리리터 멸균 시약 저장소로 이송합니다. 8개의 채널 파이펫 또는 P200 파이펫을 사용하면 렌즈티바이러스와 혼합된 셀 서스펜션의 웰당 30마이크로리터를 각 웰에 분배합니다.다음으로, 7분 동안 실온에서 270배 의 스윙 버킷 플레이트 원심분리기에서 96웰 플레이트를 원심분리합니다. 하룻밤 동안 가습 된 5 %의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도의 문화. 인큐베이션 후 인큐베이터에서 96 개의 웰 플레이트를 제거하고 생물학적 안전 캐비닛에 놓습니다.섬당 파이펫 100 마이크로리터는 10% 높은 FBSCMRL의 섬내 건조를 방지하고 1주일 동안 계속 배양합니다. 파이프 100 마이크로 리터CMRL 매체의 우물 당 10%의 열 불활성 태아 소 혈청저수지에서 의사 섬과 파이펫을 2~3배 위아래로 부드럽게 들어 올려 섬이 들어 올립니다. 그런 다음, 의사 섬이 들어 있는 우물에서 배지를 흡인하고 10센티미터 페트리 접시로 배출한다.모든 의사 섬의 완전한 제거를 보장하기 위해 가벼운 현미경에서 플레이트를 확인하고 다운 스트림 실험을 진행합니다. 24 마이크로 웰 배양 플레이트를 사용하여 의사 섬을 생성하려면 먼저 안티 준수 헹구는 용액의 웰 당 500 마이크로 리터를 추가하십시오. 1300배 g의 원심분리기는 스윙 버킷 플레이트 원심분리기에서 5분간.그런 다음 현미경으로 플레이트를 관찰하여 기포가 마이크로 웰에서 제거되도록 합니다. 생물학적 안전 캐비닛에서, 우물에서 안티 준수 헹도 방지 용액을 흡인. 한 번 따뜻한 일반 CMRL 1066 매체의 두 밀리리터와 함께 각각 잘 헹구는.그런 다음, 일반 CMRL 1066 배지를 흡인하고 10%의 열 불활성 태아 소 혈청을 사용하여 따뜻한 CMRL의 웰당 0.5 밀리리터를 추가합니다. 각 웰에 필요한 총 셀 수를 결정합니다. 멸균 1.5 밀리리터 튜브에서 10%의 열 불활성 태아 소 혈청으로 CMRL 배지의 0.8 밀리리터에서 단일 세포를 다시 중단합니다.렌티바이러스에 의해 변환된 의사 섬 의 한 우물을 만들려면, 0.2 밀리리터 이하의 바이러스의 양을 유지하는 단세포 현탁액에 세포 당 125 개의 변환 단위를 추가합니다. 세포의 응축 전에 바이러스와 세포의 접촉을 허용하기 위해 1 시간 동안 가끔 부드러운 혼합과 37 섭씨에서 세포와 바이러스 혼합물을 배양. 1시간 후, 10%의 열 불활성 태아 소 혈청을 가진 CMRL 배지를 추가하여 1밀리리터로 아슬렛 세포 및 바이러스 혼합물의 총 부피를 조정한다.세포가 1시간 배양 후 덩어리를 형성하면 2~3회 부드럽고 빠른 파이펫을 사용하여 단일 셀 현탁액으로 분산됩니다. 셀 현탁액을 24개의 잘 미세웰 배양 플레이트 중 하나의 웰로 이송한다. 파이펫팅 직후, 원심분리기는 실온에서 100배 g에서 3분 동안 모든 마이크로 웰에 세포를 포획합니다.현미경으로 관찰하여 세포가 모든 마이크로 웰에 균등하게 분포되어 있는지 확인하십시오. 그것은 우물에 있는 islet 단 세포 현탁액을 잘 혼합하는 것을 추가한 후에 즉시 마이크로 웰 플레이트를 원심분리하는 것이 중요합니다. 96개의 매우 낮은 부착 플레이트에서 생성된 3000개의 인간 섬 세포로부터의 의사 섬 형태에 대한 순차적 변화는 1주일 만에 매끄러운 둥근 테두리를 가진 단층 또는 느슨한 세포 덩어리로 변했다.대조적으로, 마이크로 웰 배양 판에서, 단지 500 섬 세포에서 세포와 의사 섬의 형성은 일반적으로 4 일 이내에 볼 수 있습니다. 의사 섬의 균일한 크기는 테스트 그룹 내의 변동을 줄이고 측정당 5개의 의사 섬을 사용하여 정적 인큐베이션을 허용합니다. 인슐린 반응을 위한 페리 융합 분석은 인간 의사 섬이 문화의 7 일 후에 포도당에 응하여 강력한 첫번째 단계 인슐린 분비를 유지한 것을 보여주었습니다.단일 세포 현탁액에 인간 지방 트리글리세라이드 리파제 또는 페리핀 5개의 유전자를 대상으로 하는 렌티바이러스의 도입은 islet 세포의 효율적이고 균일한 변환을 보장하고 유전자의 고효율 다운레그렌을 달성한다. 인간 적인 아슬렛을 단일 세포로 분산시키는 데 필요한 시간은 크기, 분포 및 기증자 특성과 같은 많은 요인에 의해 영향을 받는다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 소화 중에 인간 섬이 사라지는 데 세심한 주의를 기울이는 것이 중요합니다.프로토콜 전반에 걸쳐 세포 손실을 피하기 위해 단일 세포 현탁액을 부드럽게 처리하는 것이 중요합니다. 생성되는 인간 의사 섬은 다음과 같은 유전자 변조의 효과를 결정하기 위해 많은 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다 :웨스턴 블롯, 조직학적 연구 및 산소 소비율의 측정. 이 프로토콜은 일반적인 실험실 도자기와 간단한 기술을 사용하여 섬 건강과 인간 섬내기능의 조절에서 표적 유전자의 낮은 을 평가할 수 있게 한다.인간 섬을 사용하면 현지 검토 위원회의 사전 승인이 필요할 수 있습니다. 연구가 시작되기 전에 현지 검토 위원회에 문의하십시오. 렌티바이러스는 생물안전 수준 2로 분류됩니다.렌즈 바이러스의 사용개시 전에 생물안전위원회에 문의하십시오.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

갓 고립 된 인간의 산모 Cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 및 EMSA 분석

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

연구

유전학

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

인간의 기본 세포 배양의 일주기 시계 유전자 발현 및 호르몬 분비의 병렬 측정

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

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양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

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낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

점 돌연변이 수리 CRISPR/Cas9 및 SsODN 인간 세포에 의해 촉매의 기능으로 현지 변이 검사 하는 표준 방법론

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

CRISPR/Cas9-중재 유전자 녹아웃 셀 분할에 대 한 Integrase 불충분 한 Lentiviral 벡터의 생산을 위한 프로토콜

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

유전자 변형 마우스 생산을 중재 하는 lentiviral: 창시자의 직접적인 연구를 위한 간단 하 고 매우 효율적인 방법

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...