Name: lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates
Uploaded: 2019-05-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates at JoVE.com

Dette arbeidet ble økonomisk støttet av National Institutes of Health to Y.I. (R01-DK090490) og American Diabetes Association til Y.I. (1-17-IBS-132). J.A. og Y.I. støttes av broderlig Order of Eagles diabetes Research Center. A.B. er støttet av en National Institutes of Health Training Grant (T32NS45549). Forfattere benyttet menneskelige bukspyttkjertelen holmer levert av NIDDK-finansiert Integrated Islet Distribution program (IIDP) på City of Hope (2UC4DK098085).

Før oppstart av studier, en menneskelig forskning bestemmelse ble gjort av University of Iowa institusjonelle Review Board, som fastslått at studien ikke oppfyller kriteriene for menneskelige forskning. Rådfør deg med den lokale gjennomgangen før studien innledes for å finne ut om kilden til holmer og planlagt studie krever forhåndsgodkjenning.
Merk: Vanligvis kreves 1200 − 1400 Holme ekvivalent (IEQ) av menneskelige holmer for dannelsen av 192 pseudoislets på størr...

<ol>
	<li>Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta+cell+mass+and+function+in+diabetes:+Recent+advances+in+knowledge+and+technologies+to+understand+disease+pathogenesis.">Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).</li><li>Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+flexible+system+for+glucose+homeostasis.">Stable and flexible system for glucose homeostasis.</a> Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).</li><li>Cryer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Glucagon+in+the+pathogenesis+of+hypoglycemia+and+hyperglycemia+in+diabetes.">Minireview: Glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes.</a> Endocrinology. 153 (3), 1039-1048 (2012).</li><li>Arrojo e Drigo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+architecture+of+the+islet+of+Langerhans:+a+focused+cross-species+assessment.">New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment.</a> Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).</li><li>Harata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+shRNA+via+lentivirus+in+human+pseudoislets+provides+a+model+to+test+dynamic+regulation+of+insulin+secretion+and+gene+function+in+human+islets.">Delivery of shRNA via lentivirus in human pseudoislets provides a model to test dynamic regulation of insulin secretion and gene function in human islets.</a> Physiological Reports. 6 (20), e13907 (2018).</li><li>Barbu, A. R., Akusjarvi, G., Welsh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+transduction+of+human+pancreatic+islets:+importance+of+adenoviral+genome+for+cell+viability+and+association+with+a+deficient+antiviral+response.">Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response.</a> Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).</li><li>Hughes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+to+improve+pancreatic+islet+transplantation+for+Type+1+diabetes+mellitus.">Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus.</a> Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).</li><li>Jimenez-Moreno, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+High+Efficiency+Intra-Islet+Transduction+Protocol+Using+Lentiviral+Vectors.">A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors.</a> Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).</li><li>Bonora, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+correlates+of+post-prandial+hyperglycaemia+in+a+large+sample+of+patients+with+type+2+diabetes+mellitus.">Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).</li><li>Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. L., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+reassociation+of+dispersed+adult+rat+pancreatic+islet+cells+into+aggregates+with+three-dimensional+architecture+typical+of+native+islets.">Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets.</a> Diabetes. 36 (7), 783-790 (1987).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+pseudoislets+form+efficiently+from+donated+tissue,+compare+favourably+with+native+islets+in+vitro+and+restore+normoglycaemia+in+mice.">Bioengineered human pseudoislets form efficiently from donated tissue, compare favourably with native islets in vitro and restore normoglycaemia in mice.</a> Diabetologia. 61 (9), 2016-2029 (2018).</li><li>Zuellig, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+physiological+properties+of+gravity-enforced+reassembled+rat+and+human+pancreatic+pseudo-islets.">Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).</li><li>Caton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+transduction+of+connexin+cDNAs+shows+level-+and+isoform-specific+alterations+in+insulin+secretion+of+primary+pancreatic+beta-cells.">Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells.</a> Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+beta+Cell+Function.">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li><li>Peiris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+human+diabetes-risk+gene+function+with+genetics+and+physiological+assays.">Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays.</a> Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).</li><li>Schlimgen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+Associated+With+Lentiviral+Vector+Exposures+and+Prevention+Strategies.">Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies.</a> Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+islet+for+improved+performance+by+optimized+reaggregation+in+alginate+gel+beads.">Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).</li><li>Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+re-aggregated+human+pancreatic+islets+for+secondary+drug+screening.">Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening.</a> British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).</li><li>Hilderink, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+aggregation+of+primary+human+pancreatic+islet+cells+leads+to+glucose-responsive+pseudoislets+comparable+to+native+islets.">Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).</li><li>Saunders, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectonucleoside+Triphosphate+Diphosphohydrolase-3+Antibody+Targets+Adult+Human+Pancreatic+beta+Cells+for+In+Vitro+and+In+Vivo+Analysis.">Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis.</a> Cell Metabolism. (18), (2018).</li><li>Reissaus, C. A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reestablishment+of+Glucose+Inhibition+of+Glucagon+Secretion+in+Small+Pseudoislets.">Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets.</a> Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).</li></ol>

Her, en detaljert protokoll for å generere menneskelige pseudoislets som er transduced av lentivirus bruker en 96-brønn ultra-lav festeplate eller en mikrotiterplateleser kultur plate er presentert. Pseudoislets har blitt rapportert å demonstrere morfologi og sekretoriske funksjoner som ligner på innfødte menneskelige holmer og kan være kultivert for lengre tid in vitro5,11,18. I motsetning til innfødte menneskelige holme...

Tap av funksjonell beta celle massen er den sentrale patologi for både type 1 og type 2 diabetes1. Mens beta celler er produsentene av insulin i bukspyttkjertelen holmer, kommunikasjon mellom beta celler og ikke-beta-celler spiller en avgjørende rolle i regulering av insulin sekresjon2. I tillegg feilregulering av glukagon sekresjon bidrar til hyperglykemi i diabetes3. Dermed er det sterk interesse for modulere genuttrykk av celler innenfor bukspyttkjertelen holmer å ta opp mekanismen bak utviklingen av Holme dysfunksjon i diabetes. En rekke tilnærminger inkludert transgene mus er tilgjengelig for modulere genuttrykk av mus holmer. Men menneskelige og mus holmer viser distinkte innervasjon, celle distribusjon, ratio av beta til alfa celler, og respons på secretagogues4. Derfor er direkte vurdering av gen funksjon i menneskelige holmer svært viktig for å forstå patofysiologi av menneskelige bukspyttkjertel holmer.
Adenoviral vektor er den mest brukte viral vektor til overfører bukspyttkjertelen holmer in vitro på grunn av den høye effektiviteten av Transduction i ikke-deler celler. Men adenovirus ikke inn i kjernen av holmer effektivt, spesielt i menneskelige holmer5, og er cytotoksisk ved høye doser6. Relativt, er lentiviral vektor mindre cytotoksisk og leverer eksogene gener permanent inn i kromosom av post-mitotisk celler, noe som gjør det til et allment testet kjøretøy for genterapi7. Imidlertid er lentivirus evne til å trenge inn i kjernen av intakt menneskelige holmer også begrenset, og dermed krever delvis spredning av enzymatisk fordøyelsen å øke Transduction effektivitet8. Den påminnelse med spredning av intakt menneskelige holmer er avbrudd av celle-celle og celle-matrise kommunikasjon, som kompromisser den dynamiske reguleringen av insulin sekresjon kritisk for vedlikehold av glukose homeostase hos mennesker9. Dermed har det vært utfordrende å vurdere effekten av gen modulering på den dynamiske reguleringen av Holme funksjon i en modell av menneskelige holmer.
Det har vært kjent at spredte Holmen celler fra menneske og gnager holmer selvstendig reaggregate i Holme-lignende strukturer kalt "pseudoislets". Pseudoislets Vis beta og ikke-beta celle distribusjon lik native holmer10,11. I tillegg, etter lang tids kultur, innfødte holmer gradvis miste robust første fase insulin sekresjon5,10,11,12. Likevel viste pseudoislets bedre bevaring av første fase insulin sekresjon som respons på glukose sammenlignet med innfødte etter samme kultur periode5. I tillegg til å ha bedre bevaring av insulin sekresjon, størrelse-kontrollerte reaggregasjon av menneskelig Holme celler i lav festeplater11 gir et vindu av muligheter til å innføre lentivirus vektorer før deres reaggregasjon i pseudoislets. Flere studier har vist nytten av pseudoislets kombinert med lentiviral mediert Transduction. Caton et al.13 rapporterte at innføringen av den grønne fluorescerende PROTEIN (GFP) uttrykker lentivirus hadde liten effekt på insulin sekresjon mens oppnå homogen uttrykk for GFP i rotte pseudoislets sammenlignet med ikke-infiserte kontroll. De viste også den spesifikke effekten av ulike connexins på insulin sekresjon av overexpressing connexins 32, 36, og 43 via lentivirus13. Human pseudoislets fremstilt med en kommersielt anvendelig 96-frisk ultra-lav festeplate bevist det lentiviral-mediert overuttrykte av transkripsjon faktoren SIX3 gjøre bedre insulin sekresjon vurdert av statisk inkubasjons14. Nylig, Human pseudoislets fremstilt med en 96-brønn ultra-lav festeplate ble brukt til å downregulate glucokinase via lentiviral kort hår RNA (shRNA) som et bevis på prinsippet å vise at glukose-stimulert insulin sekresjon er redusert, mens KCl-stimulert insulin sekresjon ble bevart5. Studien viste også at menneskets pseudoislets er lik innfødte holmer i genuttrykk og sekretoriske profiler, ytterligere støtte nytten av menneskelig pseudoislets å analysere regulering av Holme funksjon5. Selv om perifusion ikke ble utført, en bioengineered mikrotiterplateleser kultur plate som nylig ble kommersielt tilgjengelig, ble også rapportert å være kompatibel for lentiviral Transduction og produsert menneskelig pseudoislets som utstilt utmerket insulin sekresjon in vitro og in vivo etter transplantasjon11. Kollektivt, menneskelig pseudoislet formasjon kombinert med lentiviral Transduction er en enkel og effektiv tilnærming til å etterforske menneskelig Holme patofysiologi, som gir et verdifullt verktøy for å utføre mekanistisk studier i menneskelige holmer.
I den gjeldende rapporten, en protokoll for å danne menneskelige pseudoislets transduced med lentivirus ved hjelp av to kommersielt tilgjengelige plattformer, en 96-brønn ultra-lav festeplate og en mikrotiterplateleser kultur plate presenteres. Både oppnå effektiv modulering av genuttrykk og skape menneskelige pseudoislets som er kompatible for nedstrøms vurderinger inkludert statiske inkubasjons og perifusion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series Type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer, 40 micrometer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11530037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Trizol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marien Feld</td>
			<td>Neubauer-Improved Bright line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>11-350-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube, 1.5 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microwell culture plate</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>34411</td>
			<td>Aggrewell 400, 24 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motor-driven pestle</td>
			<td>GAMUT</td>
			<td>#399X644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-tissue culture treated dish, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 mm</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 5 mL</td>
			<td>DOT Scientific,</td>
			<td>667205B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 8-channel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#613-5253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>667210B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P10</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P200</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P1000</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteolytic and collagenolytic enzyme mixture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6965</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagent reservoir, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversible strainer, 37 micrometer</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>27251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket plate centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-14R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SX4750A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin syringe, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra low attachment microplate, 96 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4515</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates

Ulike genetiske verktøy er tilgjengelige for å modulere gener i bukspyttkjertelen holmer gnagere å analysere funksjon av Holme gener for diabetes forskning. Data innhentet fra gnagere holmer er imidlertid ofte ikke fullt ut gjengitt i eller gjelder for menneskelige holmer på grunn av velkjente forskjeller i Holme struktur og funksjon mellom artene. Foreløpig teknikker som er tilgjengelige for å manipulere genuttrykk for menneskelige holmer er svært begrenset. Innføring av transgene i intakte holmer av adenovirus, plasmider, og oligonukleotider ofte lider av lav effektivitet og høy toksisitet. Lav effektivitet er spesielt problematisk i gen downregulation studier i intakte holmer, som krever høy effektivitet. Det har vært kjent at enzymatisk-spredte Holme celler reaggregate i kultur forming spheroids kalt pseudoislets. Størrelses kontrollert reaggregasjon av menneskelig Holme celler skaper pseudoislets som opprettholder dynamisk første fase insulin sekresjon etter langvarig kultur og gir et vindu for å effektivt innføre lentiviral korte hæler RNA (shRNA) med lav toksisitet. Her beskrives en detaljert protokoll for etablering av menneskelig pseudoislets etter lentiviral Transduction med to kommersielt tilgjengelige multiwell plater. Protokollen kan enkelt utføres og gir mulighet for effektiv downregulation av gener og vurdering av dynamikken i insulin sekresjon ved hjelp av menneskelig Holme celler. Således, menneskelig pseudoislets med lentiviral mediert gen moduleringshjul gir en kraftig og allsidig modell for å vurdere gen funksjon innenfor menneskelig Holme celler.

Figur 1 illustrerer viktige trinn i produksjonen av pseudoislets ved hjelp av en 96-brønn ultra-lav festeplate og en mikrotiterplateleser kultur plate. Figur 2a viser sekvensielle endringer i morfologi under dannelsen av pseudoislets fra 3 x 103 Human islet celler i en 96-brønn ultra-lav festeplate. Monolag eller løse klumper av celler observert i dag 1 endret til solide aggregater med en jevn, rund kantlinje etter ...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates at JoVE.com

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

En protokoll for å skape gen modifiserte menneskelige pseudoislets fra spredte transduced-celler som er blitt presentert av lentivirus som bærer korte hæler RNA (shRNA) presenteres. Denne protokollen utnytter lett tilgjengelig enzym-og kultur fartøy, kan utføres enkelt, og produserer genmodifiserte menneskelige pseudoislets egnet for funksjonelle og morfologiske studier.

Lentiviral mediert gen demping i Human Pseudoislet forberedt på lav Vedleggs plater

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Det er vanskelig å modulere genuttrykket på menneskelige holmer, også større nedgang i de fungerende menneskelige holmene utgjør store utfordringer etter modulering av genuttrykk. Ved å kombinere lentivirusmediert SHR8-transduksjon og dannelsen av menneskelige egnede holmer. Denne protokollen muliggjør effektiv nedregulering av et målrettet gen samtidig som holmefunksjonen bevares under langvarig kultur.Til å begynne med virvler du forsiktig fraktflasken for å holde holmene i suspensjon. Overfør fraktmediet som inneholder holmer til et konisk sentrifugrør på 50 milliliter. La røret sitte i et biologisk sikkerhetsskap i 15 minutter slik at holmene legger seg til bunnen av røret.Fjern forsendelsesmediet forsiktig ved hjelp av en kapillærpipette uten å forstyrre holmepellet. Re-suspender holmepellet i CMRL medium med 1% humant serumalbumin til en konsentrasjon på 400 holmeekvivalent per milliliter. Overfør holmer til en ikke-vevskultur behandlet tallerken og kultur dem på 37 grader celsius i en 5% karbondioksid inkubator over natten.Etter kultur over natten, overføre menneskelige holmer til en 15 milliliter konisk sentrifuge rør, sentrifuge på 250 ganger g i fem minutter i en svingende bøtte rotor. Og aspirer mediet med en kapillær pipette uten å forstyrre holmepellet. Vask pellet min legge 10 milliliter PBS til røret, bland forsiktig og sentrifuge på 250 ganger g i fem minutter.Etter sentrifugering, aspirere PBS uten å forstyrre holmen pellet. Re-suspendere pellet i 0,5 milliliter av en forvarmet proteolytisk og collagenolytisk enzym blanding. Pipette fem ganger ved hjelp av en P1000 pipette for å blande holmer.Inkuber ved 37 grader celsius i fem minutter. Etter inkubasjonen, bland pipette klappe opp og ned forsiktig. Se etter encellede uklarheter og antall flak eller ufordøyde holmer.Legg en 40 mikron sil i en 35 millimeter petriskål og våt silen ved å legge til en milliliter CMRL medium med 10% varme inaktivert fosterbovin serum og deprimerende med en ett milliliter sprøyte stempel. Overfør all cellefjæringen på toppen av silen. Og samle pass gjennom i en frisk 15 milliliter tube.Vask røret som brukes til fordøyelsen av holmen med 0,5 milliliter friskt CMRL-medium for å samle restceller og passere vasken gjennom silen. Kombiner gjennompassing i et 15 milliliter rør. Gjenta én gang.For å ta avstand fra ufordøyde holmer som er igjen på silen, trykk silen med et en milliliter sprøytestempel. Samle gjennom gjennom gjennom igjen og vask silen med frisk vanlig CMRL 1066 medium for å fjerne alle gjenværende fordøyde holmer fra silen og parabolen. Legg gjennom gjennom til 15 milliliter røret.Registrer det totale volumet av cellesuspensjonen og ta en 10 mikroliter aliquot av celler for å telle cellenummeret på et hemocytometer. Etter å ha sentrifugert cellesuspensjonen i fem minutter ved 200 ganger g, fjern mediet uten å forstyrre pelleten. For å produsere pseudo-holmer ved hjelp av en 96 godt ultra lav festeplate, må du først beregne det totale volumet av de nødvendige en gangene 10 til femte celler per milliliter av enkeltcellesuspensjonen.Deretter, re-suspendere holmen pellet i CMRL medium med 10% varme inaktivert fosterbovin serum slik at 30 mikroliter av celle suspensjon har 3000 celler. Deretter overfører du det nødvendige volumet av enkeltcellefjæringen til et friskt 15 milliliter rør. Ved 250 transduksjonsenheter per celle av et lentivirus som inneholder SH-RNA rettet mot et gen av interesse eller en kontroll.For å blande cellefjæringen med viruset, pipette forsiktig fem ganger med en P1000 pipette. Deretter overfører de blandede cellene til et 50 milliliter sterilt reagensreservoar hvis du bruker en åttekanals pipette. Med en åttekanals pipette eller en P200 pipette, dispenser 30 mikroliter per brønn av cellefjæringen blandet med lentivirus i hver brønn.Deretter sentrifugerer 96 brønnplaten i en svingende bøtteplate sentrifuge ved 270 ganger g ved romtemperatur i syv minutter. Kultur ved 37 grader celsius i en fuktet 5% karbondioksid inkubator over natten. Etter inkubasjon, fjern 96-brønnplaten fra inkubatoren og legg den i det biologiske sikkerhetsskapet.Pipette 100 mikroliter per holme på 10% høy FBSCMRL i en brønn for å hindre tørking av holmer og fortsette å kultur i en uke. Pipette 100 mikroliter per brønn av CMRL medium med 10% varme inaktivert fosterbovin serum fra reservoaret til pseudo-holmer og pipette opp og ned to til tre ganger forsiktig i brønnen for å løfte holmer opp. Deretter aspirerer mediet i brønnen som inneholder en pseudo-holme og kaster ut i en 10 centimeter petriskål.Kontroller platen under et lett mikroskop for å sikre fullstendig fjerning av alle pseudo-holmene og fortsett til nedstrøms eksperimenter. For å produsere pseudo-holmer ved hjelp av en 24-brønns mikrobrønnkulturplate, legg først til 500 mikroliter per brønn av en anti-tilslutning skylleløsning. Sentrifuge på 1300 ganger g i fem minutter i en svingende bøtte plate sentrifuge.Deretter må du observere platen under et mikroskop for å sikre at luftbobler fjernes fra mikrobrønner. I et biologisk sikkerhetsskap aspirerer du anti-overholdelsesavholdelsesløsningen fra brønnene. Skyll hver brønn med to milliliter varm vanlig CMRL 1066 medium én gang.Deretter aspirerer du det vanlige CMRL 1066-mediet og tilsett 0,5 milliliter per brønn varm CMRL med 10% varme inaktivert fosterbovinserum til hver godt planlagt for bruk. Bestem det totale antallet celler som trengs for hver brønn. Re-suspendere enkeltceller i 0,8 milliliter CMRL medium med 10% varme inaktivert fosterbovin serum i en steril 1,5 milliliter rør.For å lage en brønn av pseudo-holme transdusert av et lentivirus, legg til 125 transduksjonsenheter per celle til enkeltcellesuspensjonen som holder volumet av virus under 0,2 milliliter. Inkuber celle- og virusblandingen ved 37 grader celsius med sporadisk skånsom blanding i en time for å tillate kontakt med celler med virus før kondens av celler. Etter en time, juster det totale volumet av holmecellen og virusblandingen til en milliliter ved å legge CMRL medium med 10% varmeinaktivert fosterbovinserum.Hvis celler danner klumper etter en time inkubasjon spre seg til en enkelt celle suspensjon ved mild og rask pipettering to til tre ganger. Overfør cellefjæringen til en brønn av den 24 brønns mikrobrønnkulturplaten. Umiddelbart etter pipettering, sentrifuge ved 100 ganger g ved romtemperatur i tre minutter for å fange celler i alle mikrobrønner.Vær oppmerksom på et mikroskop for å verifisere at cellene er jevnt fordelt i alle mikrobrønner. Det er viktig å sentrifugere mikrobrønnplaten umiddelbart etter å ha lagt til brønnblandingen av holmens enkeltcellesuspensjon i brønnene. Sekvensielle endringer i morfologi av pseudo-holmer fra 3000 menneskelige holmeceller opprettet i en 96 godt ultra lav festeplate viste monolayer eller løse klumper av celler omgjort til solide aggregater med en jevn rund kant i en uke.I motsetning, i en mikro-brønn kultur plate, dannelsen av celle og pseudo-holmer fra bare 500 holmeceller er vanligvis synlig innen fire dager. Den ensartede størrelsen på pseudo-holmer reduserer variasjonen i en testgruppe og tillater statisk inkubasjon ved hjelp av så lite som fem pseudo-holmer per måling. Perry Fusion Assay for insulinrespons viste at humane pseudo-holmer opprettholdt robust første fase insulinsekresjon som svar på glukose etter syv dager med kultur.Innføringen av lentivirus rettet mot humant fettstoffer eller perilipin fem gener i en enkeltcellesuspensjon sikrer effektiv og homogen transduksjon av holmeceller og oppnår svært effektiv nedregulering av gener. Det er viktig å huske at tiden det tar for å spre menneskelig holme i enkeltceller påvirkes av mange faktorer som:størrelse, distribusjon og donorkarakteristikk. Så det er viktig å være oppmerksom på forsvinningen av menneskelige holmer under fordøyelsen.Gjennom hele protokollen er det viktig å håndtere enkeltcellefjæring forsiktig for å unngå celletap. De menneskelige pseudo-holmene som opprettes kan brukes til mange applikasjoner for å bestemme effekten av genmodulasjon som:Western Blot, histologisk studie og målinger av oksygenforbruksrater. Denne protokollen gjør det mulig å vurdere det lave av målrettet gen i reguleringen av holmehelse og funksjonen i menneskelige holmer ved hjelp av felles laboratoriesekk og enkle teknikker.Bruk av menneskelige holmer kan kreve forhåndsgodkjenning fra en lokal gjennomgangstavle. Ta kontakt med det lokale gjennomgangsstyret før studien startes. Lentivirus er klassifisert som biosikkerhet nivå to.Kontakt biosikkerhetsutvalget før oppstart av bruk av lentiviruset.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA Transfeksjon og EMSA Analyser på nylig isolerte humane villøse Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallell Måling av biologiske klokke genekspresjon og hormon i Human primære cellekulturer

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Oppdrett og Double-stranded RNA-mediert Gene knockdown i Hide Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Utvalgsavhengig og uavhengig generasjon av CRISPR / Cas9-medierte Gene Knockouts i mammale celler

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokollen for lav-overflod embryonale prøver

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En Standard metode for å undersøke stedet genetisk virkning som en funksjon av punkt mutasjon reparasjon katalysert av CRISPR/Cas9 og SsODN i menneskeceller

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediert målrettet integrering i Vivo med en homologi-mediert slutten begynte-basert strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

En protokoll for produksjon av Integrase dårlig Lentiviral vektorer for CRISPR/Cas9-mediert Gene Knockout i dele celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-mediert reorganisering av Chromatin Loop struktur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentiviral formidlet produksjon av transgene mus: en enkel og svært effektiv metode for direkte av grunnleggerne

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...