Name: lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates
Uploaded: 2019-05-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado financeiramente pelos institutos nacionais de saúde para Y.I. (R01-DK090490) e American Diabetes Association to Y.I. (1-17-IBS-132). J.A. e Y.I. são apoiados pela ordem fraterna do centro de pesquisa de diabetes Eagles. O A.B. é apoiado por um subsídio de formação nacional dos institutos de saúde (T32NS45549). Os autores utilizaram ilhotas pancreáticas humanas fornecidas pelo programa integrado de distribuição de ilhotas (IIDP), financiado pela NIDDK, na cidade da esperança (2UC4DK098085).

Antes do início dos estudos, a determinação da pesquisa de sujeitos humanos foi feita pelo Conselho de revisão institucional da Universidade de Iowa, que determinou que o estudo não atendera aos critérios para pesquisa de sujeitos humanos. Consulte o Comitê de revisão local antes do início do estudo para determinar se a fonte de ilhotas e o estudo planejado exigem aprovação prévia.
Nota: Tipicamente, o equivalente do Islet 1200 − 1400 (IEQ) das ilhotas humanas é...

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	<li>Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta+cell+mass+and+function+in+diabetes:+Recent+advances+in+knowledge+and+technologies+to+understand+disease+pathogenesis.">Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).</li><li>Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+flexible+system+for+glucose+homeostasis.">Stable and flexible system for glucose homeostasis.</a> Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).</li><li>Cryer, P. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+physiological+properties+of+gravity-enforced+reassembled+rat+and+human+pancreatic+pseudo-islets.">Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).</li><li>Caton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+transduction+of+connexin+cDNAs+shows+level-+and+isoform-specific+alterations+in+insulin+secretion+of+primary+pancreatic+beta-cells.">Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells.</a> Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).</li><li>Arda, H. 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J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+islet+for+improved+performance+by+optimized+reaggregation+in+alginate+gel+beads.">Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).</li><li>Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+re-aggregated+human+pancreatic+islets+for+secondary+drug+screening.">Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening.</a> British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).</li><li>Hilderink, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+aggregation+of+primary+human+pancreatic+islet+cells+leads+to+glucose-responsive+pseudoislets+comparable+to+native+islets.">Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).</li><li>Saunders, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectonucleoside+Triphosphate+Diphosphohydrolase-3+Antibody+Targets+Adult+Human+Pancreatic+beta+Cells+for+In+Vitro+and+In+Vivo+Analysis.">Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis.</a> Cell Metabolism. (18), (2018).</li><li>Reissaus, C. A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reestablishment+of+Glucose+Inhibition+of+Glucagon+Secretion+in+Small+Pseudoislets.">Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets.</a> Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).</li></ol>

Aqui, um protocolo detalhado para gerar pseudoislets humanos que são transviados pelo Lentivirus usando uma placa de acessório ultra-baixa 96-well ou uma placa da cultura do de micropoços é apresentado. Os pseudoislets foram relatados para demonstrar a morfologia e as funções secretora similares às ilhotas humanas nativas e podem ser cultivados por o tempo prolongado in vitro5,11,12. Ao contrário das ilhotas humanas nati...

A perda da massa beta funcional da pilha é a patologia central para o tipo-1 e o tipo-2 diabetes1. Enquanto as células beta são os produtores de insulina em ilhotas pancreáticas, a comunicação entre as células beta e as células não beta desempenha um papel crítico na regulação da secreção de insulina2. Além disso, a disregulação da secreção de glucagon contribui para a hiperglicemia no diabetes3. Assim, há um forte interesse em modular a expressão gênica de células dentro de ilhotas pancreáticas para abordar o mecanismo por trás do desenvolvimento da disfunção de ilhotas no diabetes. Uma variedade de aproximações que incluem ratos transgênicas está disponível para modular a expressão do gene de Islets do rato. Entretanto, as ilhotas humanas e do rato mostram a inervação distinta, a distribuição da pilha, a relação de beta às pilhas alfa, e a resposta aos secretagogos4. Portanto, a avaliação direta da função gênica em ilhotas humanas é extremamente importante para a compreensão da fisiopatologia das ilhotas pancreáticas humanas.
O vetor adenoviral é o vetor viral mais utilizado para transduce ilhotas pancreáticas in vitro devido à alta eficiência de transdução em células não-divisoras. No entanto, o adenovírus não penetra no núcleo das ilhotas de forma eficiente, especialmente nas ilhotas humanas5, e é citotóxica em altas doses6. Comparativamente, o vetor lentivirais é menos citotóxica e entrega genes exógenos permanentemente no cromossoma de pilhas borne-mitotic, fazendo lhe um veículo extensamente testado para a terapia do gene7. Entretanto, a capacidade do Lentivirus de penetrar o núcleo de ilhotas humanas intactas é limitada igualmente, assim exigindo a dispersão parcial pela digestão enzimática para aumentar a eficiência da transdução8. A ressalva com a dispersão de ilhotas humanas intactas é a interrupção da comunicação célula-célula e célula-matriz, que compromete a regulação dinâmica da secreção de insulina crítica para a manutenção da homeostase da glicose em seres humanos9. Assim, tem sido desafiador avaliar o impacto da modulação gênica na regulação dinâmica da função de ilhotas em um modelo de Ilhéus humanos.
Soube-se que as pilhas dispersadas do Islet das ilhotas humanas e do roedor reagregam autonomamente em Islet-como as estruturas chamadas "pseudoislets". Pseudoislets mostra a distribuição beta e non-beta da pilha similar às ilhotas nativas10,11. Adicionalmente, após a cultura a longo prazo, as ilhotas nativas perdem progressivamente a secreção robusta de insulina de primeira fase5,10,11,12. No entanto, as pseudoilhotas demonstraram melhor preservação da secreção de insulina de primeira fase em resposta à glicose em comparação com as ilhotas nativas após o mesmo período de cultura5. Além de ter melhor preservação da secreção de insulina, a reagregação controlada por tamanho de células de Illet humanas em placas de fixação baixas11 fornece uma janela de oportunidade para introduzir vetores de Lentivirus antes de sua reagregação em pseudoislets. Diversos estudos demonstraram a utilidade dos pseudoislets combinados com o transdução mediada lentivirais. Caton et al.13 relataram que a introdução da proteína verde fluorescente (GFP) expressando Lentivirus teve pouco efeito sobre a secreção de insulina, obtendo expressão homogênea de GFP em pseudoislets de ratos em comparação com o controle não infectado. Eles também demonstraram o efeito específico de diferentes connexinas na secreção de insulina por sobreexpressar as connexinas 32, 36 e 43 via Lentivirus13. Os pseudoislets humanos preparados com uma placa de acessório ultra-baixa disponível comercialmente de 96-well demonstraram que o superexpressão lentiviral-negociado do fator SIX3 da transcrição melhora o secretion da insulina avaliado pela incubação estática14. Recentemente, os pseudoislets humanos preparados com uma placa ultra-baixa do acessório 96-well foram usados para downregulam o glucokinase através do RNA curto lentivirais do hairpin (shRNA) como uma prova do princípio para mostrar que a secreção glucose-estimulada do insulin é reduzida, quando A secreção de insulina estimulada por KCl foi preservada5. O estudo igualmente demonstrou que os pseudoislets humanos são similares às ilhotas nativas na expressão de gene e nos perfis secretora, suportando mais a utilidade de pseudoislets humanos para dissecar a regulação da função de ilhotas5. Embora o perifusion não fosse executado, uma placa geneticamente modificados da cultura do de micropoços que se tornasse recentemente disponível comercialmente, foi relatada igualmente para ser compatível para o transdução lentivirais e produziu os pseudoislets humanos que exibiram a insulina excelente secreção in vitro e in vivo após o transplante11. Coletivamente, a formação de pseudoislet humana combinada com a transdução lentivirais é uma abordagem simples e eficiente para investigar a fisiopatologia da ilhotas humana, proporcionando uma valiosa ferramenta para realizar estudos mecanísticos em ilhotas humanas.
No relatório atual, um protocolo para dar forma a pseudoislets humanos transou com o Lentivirus usando duas plataformas comercialmente disponíveis, uma placa ultra-baixa do acessório 96-well e uma placa da cultura do de micropoços são apresentadas. Ambos conseguem a modulação eficiente da expressão gênica e criam pseudoislets humanos que são compatíveis para avaliações a jusante, incluindo incubação estática e perifusão.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series Type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer, 40 micrometer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11530037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Trizol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marien Feld</td>
			<td>Neubauer-Improved Bright line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>11-350-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube, 1.5 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microwell culture plate</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>34411</td>
			<td>Aggrewell 400, 24 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motor-driven pestle</td>
			<td>GAMUT</td>
			<td>#399X644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-tissue culture treated dish, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 mm</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 5 mL</td>
			<td>DOT Scientific,</td>
			<td>667205B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 8-channel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#613-5253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>667210B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P10</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P200</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P1000</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteolytic and collagenolytic enzyme mixture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6965</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagent reservoir, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversible strainer, 37 micrometer</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>27251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket plate centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-14R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SX4750A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin syringe, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra low attachment microplate, 96 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4515</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates

Várias ferramentas genéticas estão disponíveis para modular genes em Ilhéus pancreáticos de roedores para dissecar a função de genes de ilhotas para pesquisa de diabetes. No entanto, os dados obtidos a partir de ilhotas de roedores muitas vezes não são totalmente reproduzidos ou aplicáveis às ilhotas humanas devido a diferenças bem conhecidas na estrutura e função da ilhós entre as espécies. Atualmente, as técnicas que estão disponíveis para manipular a expressão gênica de ilhotas humanas são muito limitadas. A introdução de transgene em ilhotas intactas por adenovirus, plasmídeo, e oligonucleotídeos muitas vezes sofre de baixa eficiência e alta toxicidade. A baixa eficiência é especial problemática em estudos do downregulation do gene em ilhotas intactas, que exigem a eficiência elevada. Soube-se que as pilhas enzymaticamente-dispersadas do Islet reagregam na cultura que dá forma aos esferoides denominados pseudoislets. O Reaggregation tamanho-controlado de pilhas humanas da ilhotas cria os pseudoislets que mantêm a primeira secreção dinâmica da insulina da fase após a cultura prolongada e fornecem uma janela para introduzir eficientemente o RNA curto lentivirais do hairpin (shRNA) com baixa toxicidade. Aqui, um protocolo detalhado para a criação de pseudoislets humanos após o transdução lentivirais usando duas placas de comercialmente disponíveis é descrito. O protocolo pode ser facilmente realizado e permite a downregulation eficiente dos genes e a avaliação do dinamismo da secreção de insulina usando células de Illet humanas. Assim, os pseudoislets humanos com modulação mediada lentivirais do gene fornecem um modelo poderoso e versátil para avaliar a função do gene dentro das pilhas humanas da ilhotas.

A Figura 1 ilustra as etapas-chave na produção de pseudoislets usando uma placa de fixação ultra-baixa de 96 poços e uma placa de cultura de micropoços. A Figura 2a mostra alterações sequenciais na morfologia durante a formação de pseudoislets de 3 x 103 células de ilhotas humanas em uma placa de fixação ultra-baixa de 96 poços. Monocamada ou aglomerações soltas de células observadas no dia 1 mudaram p...

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Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Um protocolo para criar pseudoislets humanos modificados gene das pilhas de ilhotas humanas dispersas que são transados pelo Lentivirus que carreg o RNA curto do hairpin (shRNA) é apresentado. Este protocolo utiliza prontamente-as embarcações disponíveis da enzima e da cultura, podem ser executadas facilmente, e produzem os pseudoislets humanos genetically modificados apropriados para estudos funcionais e morfológicos.

Silenciamento gênico mediado por Lentivirus em Pseudoislet humano preparado em placas de baixo acessório

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

É difícil modular a expressão genética nas ilhotas humanas, também maior declínio das ilhotas humanas em funcionamento representam grandes desafios após a modulação da expressão genética. Combinando a transdução SHR8 mediada pelo lentivírus e a formação de ilhotas humanas adequadas. Este protocolo permite uma regulação eficiente de um gene direcionado, preservando a função de ilhota durante a cultura prolongada.Para começar, gire suavemente a garrafa de transporte para manter as ilhotas em suspensão. Transfira o meio de transporte contendo ilhotas para um tubo de centrífuga cônica de 50 mililitros. Deixe o tubo sentar em um armário de segurança biológica por 15 minutos para que as ilhotas se acomodem no fundo do tubo.Remova o meio de transporte suavemente usando uma pipeta capilar sem perturbar a pelota de ilhota. Suspenda a pelota de ilhota no meio CMRL com albumina de soro humano de 1%para uma concentração equivalente a 400 ilhotas por mililitro. Transfira ilhotas para um prato tratado sem cultura de tecido e cultue-as a 37 graus celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% durante a noite.Após a cultura da noite para o dia, transfira ilhotas humanas para um tubo de centrífuga cônica de 15 mililitros, centrífuga a 250 vezes g por cinco minutos em um rotor de balde balançando. E aspirar o meio com uma pipeta capilar sem perturbar a pelota de ilhota. Lave a pelota adicionando 10 mililitros de PBS ao tubo, misture suavemente e centrífuga a 250 vezes g por cinco minutos.Após centrifugação, aspirar PBS sem perturbar a pelota de ilhota. Suspenda a pelota em 0,5 mililitros de uma mistura de enzimas proteolíticas e colagens pré-aquecidas. Pipeta cinco vezes usando uma pipeta P1000 para misturar ilhotas.Incubar a 37 graus celsius por cinco minutos. Após a incubação, misture a pipeta acariciando para cima e para baixo suavemente. Verifique se há nebulosidade celular única e o número de flocos ou ilhotas não digeridas.Coloque um coador de 40 mícrons em uma placa de petri de 35 milímetros e molhe o coador adicionando um mililitro de meio CMRL com soro bovino fetal inativado de 10% de calor e deprimente com um êmbolo de seringa de um mililitro. Transfira toda a suspensão do celular em cima do filtro. E recolher a passagem em um tubo fresco de 15 mililitros.Lave o tubo usado para digestão de ilhotas com 0,5 mililitros de meio CMRL fresco para coletar as células restantes e passar a lavagem através do coador. Combine a passagem em um tubo de 15 mililitros. Repita uma vez.Para dissociar ilhotas não digeridas remanescentes no coador, pressione o coador com um êmbolo de seringa de um mililitro. Colete a passagem novamente e lave o coador com o meio CMRL 1066 fresco para remover todas as ilhotas digeridas restantes do coador e do prato. Adicione a passagem ao tubo de 15 mililitros.Regissuor o volume total da suspensão celular e tome uma alíquota de 10 microliter de células para contar o número do celular em um hemótmetro. Depois de centrifugar a suspensão da célula por cinco minutos a 200 vezes g, remova o meio sem perturbar a pelota. Para produzir pseudo-ilhotas usando uma placa de fixação ultra baixa de 96, calcule primeiro o volume total das 10 vezes necessárias para a quinta célula por mililitro da suspensão celular única.Em seguida, suspenda novamente a pelota de ilhota no meio CMRL com soro bovino fetal inativado de 10% de calor para que 30 microlitres da suspensão celular tenha 3000 células. Em seguida, transfira o volume necessário da suspensão celular única para um tubo fresco de 15 mililitros. Em 250 unidades de transdução por célula de um lentivírus contendo SH-RNA visando um gene de interesse ou um controle.Para misturar a suspensão celular com o vírus, pipeta suavemente cinco vezes com uma pipeta P1000. Em seguida, transfira as células mistas para um reservatório de reagente estéril de 50 mililitros se usar uma pipeta de oito canais. Com uma pipeta de oito canais ou uma pipeta P200, dispense 30 microliters por poço da suspensão celular misturada com lentivírus em cada poço.Em seguida, centrifufique a placa de 96 poços em uma centrífuga de placa de balde balançando a 270 vezes g em temperatura ambiente por sete minutos. Cultura a 37 graus celsius em uma incubadora umidificada de 5% de dióxido de carbono durante a noite. Após a incubação, retire a placa 96 da incubadora e coloque-a no armário de segurança biológica.Pipeta 100 microliters por ilhota de 10% de altura FBSCMRL em um poço para evitar a secagem de ilhotas e continuar a cultura por uma semana. Pipeta 100 microliters por poço de meio CMRL com soro bovino fetal inativado de 10% do reservatório para as pseudo-ilhotas e pipeta para cima e para baixo duas a três vezes suavemente no poço para levantar ilhotas para cima. Em seguida, aspire o meio no poço contendo uma pseudo-ilhota e ejete em uma placa de petri de 10 centímetros.Verifique a placa sob um microscópio leve para garantir a remoção completa de todas as pseudo-ilhotas e proceda a experimentos a jusante. Para produzir pseudo-ilhotas usando uma placa de cultura de 24 poços, adicione primeiro 500 microliters por poço de uma solução anti-adesão. Centrifugar a 1300 vezes g por cinco minutos em uma centrífuga de placa de balde balançando.Em seguida, observe a placa sob um microscópio para garantir que as bolhas de ar sejam removidas dos micro-poços. Em um gabinete de segurança biológica, aspire a solução anti-adesão dos poços. Enxágüe cada poço com dois mililitros de médio CMRL 1066 de planície quente uma vez.Em seguida, aspire o médio CMRL 1066 simples e adicione 0,5 mililitro por poço de CMRL quente com soro bovino fetal inativado de 10%a calor a cada bem planejado para uso. Determine o número total de células necessárias para cada poço. Suspenda as células únicas em 0,8 mililitros de meio CMRL com soro bovino fetal inativado de 10% de calor em um tubo estéril de 1,5 mililitro.Para criar um poço de pseudo-ilhota transduzida por um lentivírus, adicione 125 unidades de transdução por célula à suspensão de célula única mantendo o volume de vírus abaixo de 0,2 mililitros. Incubar a mistura de células e vírus a 37 graus celsius com mistura suave ocasional por uma hora para permitir o contato das células com o vírus antes da condensação das células. Após uma hora, ajuste o volume total da mistura de células ilhotas e vírus para um mililitro adicionando meio CMRL com soro bovino fetal inativado de 10% de calor.Se as células formarem aglomerados após uma hora de incubação dispersar-se em uma única suspensão celular por tubulação suave e rápida de duas a três vezes. Transfira a suspensão celular para um poço da placa de cultura de 24 poços. Imediatamente após a pipetação, centrífuga a 100 vezes g à temperatura ambiente por três minutos para capturar células em todos os micro-poços.Observe sob um microscópio para verificar se as células estão distribuídas uniformemente em todos os micro-poços. É fundamental centrifugar a placa do micro-poço imediatamente após adicionar o poço misturando a suspensão de célula única ilhota nos poços. Mudanças sequenciais na morfologia de pseudo-ilhotas de 3000 células ilhotas humanas criadas em uma placa de 96 bem ultra baixa de fixação mostraram monocamadas ou aglomerados soltos de células transformadas em agregados sólidos com uma borda redonda suave em uma semana.Em contraste, em uma placa de cultura de micro-poços, a formação de células e pseudo-ilhotas de apenas 500 células ilhotas é geralmente visível dentro de quatro dias. O tamanho uniforme das pseudo-ilhotas reduz a variação dentro de um grupo de teste e permite a incubação estática usando apenas cinco pseudo-ilhotas por medição. O Perry Fusion Assay para resposta à insulina mostrou que as pseudo-ilhotas humanas mantiveram uma secreção robusta de insulina em primeira fase em resposta à glicose após sete dias de cultura.A introdução do lentivírus direcionado à lipase de trigliceride de adiposa humana ou perilipin cinco genes em uma única suspensão celular garante a transdução eficiente e homogênea das células ilhotas e alcança uma baixa altamente eficiente da regulação dos genes. É importante lembrar que o tempo necessário para dispersar a ilhota humana em células únicas é afetado por muitos fatores como:tamanho, distribuição e a característica do doador. Por isso, é importante prestar muita atenção ao desaparecimento das ilhotas humanas durante a digestão.Durante todo o protocolo é importante lidar suavemente com a suspensão de células únicas para evitar a perda de células. As pseudo-ilhotas humanas que estão sendo criadas podem ser usadas para muitas aplicações para determinar o efeito da modulação genética, como:Western Blot, estudo histológico e as medições das taxas de consumo de oxigênio. Este protocolo permite avaliar o baixo gene direcionado na regulação da saúde das ilhotas e a função em ilhotas humanas usando material labiais comum e técnicas simples.O uso de ilhotas humanas pode exigir uma aprovação prévia de um conselho de revisão local. Consulte o cet previamente à contratação do financiamento. O lentivírus é classificado como biossegurança nível dois.Entre em contato com o comitê de biossegurança antes do início do uso do lentivírus.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

As análises siRNA transfecção e EMSA sobre recentemente isolados das vilosidades citotrofoblastos Humanos

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Genética

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Medição paralela da expressão do gene relógio circadiano e hormonal secreção em culturas de células primárias humanas

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Geração independente dependente da seleção e de genes independentes de CRISPR / Cas9 em células de mamíferos

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Cromatina (ChIP) imunoprecipitação para baixo-abundância embrionárias amostras

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Integração de alvo CRISPR/Cas9-mediada na Vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Um protocolo para a produção de Lentivirus vetores Integrase deficiente CRISPR/Cas9-mediada Gene nocaute em dividir células

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Mediada por CRISPR reorganização da estrutura de Loop de cromatina

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Particulas de Lentivirus mediada produção de camundongos transgênicos: um método simples e altamente eficiente para estudo direto dos fundadores

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...