Name: lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates
Uploaded: 2019-05-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates at JoVE.com

Эта работа была финансово поддержана Национальными институтами здравоохранения в Y.I. (R01-DK090490) и Американской диабетической ассоциацией в Y.I. (1-17-IBS-132). J.A. и Y.I. поддерживаются Братским Орденом Орловского Научно-исследовательского центра диабета. A.B. поддерживается грантом на обучение национальных институтов здравоохранения (T32NS45549). Авторы использовали островки поджелудочной железы человека, предоставленные финансируемой NIDDK Комплексной программой распределения островок (IIDP) в городе Надежда (2UC4DK098085).

До начала исследований, человеческие предметы исследования определение было сделано ВУниверситете штата Айова Институциональный обзор совета, который определил, что исследование не соответствует критериям для исследования человеческих субъектов. Проконсультируйтесь с местным наб?...

<ol>
	<li>Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta+cell+mass+and+function+in+diabetes:+Recent+advances+in+knowledge+and+technologies+to+understand+disease+pathogenesis.">Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).</li><li>Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+flexible+system+for+glucose+homeostasis.">Stable and flexible system for glucose homeostasis.</a> Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).</li><li>Cryer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Glucagon+in+the+pathogenesis+of+hypoglycemia+and+hyperglycemia+in+diabetes.">Minireview: Glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes.</a> Endocrinology. 153 (3), 1039-1048 (2012).</li><li>Arrojo e Drigo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+architecture+of+the+islet+of+Langerhans:+a+focused+cross-species+assessment.">New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment.</a> Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).</li><li>Harata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+shRNA+via+lentivirus+in+human+pseudoislets+provides+a+model+to+test+dynamic+regulation+of+insulin+secretion+and+gene+function+in+human+islets.">Delivery of shRNA via lentivirus in human pseudoislets provides a model to test dynamic regulation of insulin secretion and gene function in human islets.</a> Physiological Reports. 6 (20), e13907 (2018).</li><li>Barbu, A. R., Akusjarvi, G., Welsh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+transduction+of+human+pancreatic+islets:+importance+of+adenoviral+genome+for+cell+viability+and+association+with+a+deficient+antiviral+response.">Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response.</a> Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).</li><li>Hughes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+to+improve+pancreatic+islet+transplantation+for+Type+1+diabetes+mellitus.">Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus.</a> Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).</li><li>Jimenez-Moreno, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+High+Efficiency+Intra-Islet+Transduction+Protocol+Using+Lentiviral+Vectors.">A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors.</a> Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).</li><li>Bonora, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+correlates+of+post-prandial+hyperglycaemia+in+a+large+sample+of+patients+with+type+2+diabetes+mellitus.">Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).</li><li>Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. L., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+reassociation+of+dispersed+adult+rat+pancreatic+islet+cells+into+aggregates+with+three-dimensional+architecture+typical+of+native+islets.">Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets.</a> Diabetes. 36 (7), 783-790 (1987).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+pseudoislets+form+efficiently+from+donated+tissue,+compare+favourably+with+native+islets+in+vitro+and+restore+normoglycaemia+in+mice.">Bioengineered human pseudoislets form efficiently from donated tissue, compare favourably with native islets in vitro and restore normoglycaemia in mice.</a> Diabetologia. 61 (9), 2016-2029 (2018).</li><li>Zuellig, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+physiological+properties+of+gravity-enforced+reassembled+rat+and+human+pancreatic+pseudo-islets.">Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).</li><li>Caton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+transduction+of+connexin+cDNAs+shows+level-+and+isoform-specific+alterations+in+insulin+secretion+of+primary+pancreatic+beta-cells.">Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells.</a> Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+beta+Cell+Function.">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li><li>Peiris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+human+diabetes-risk+gene+function+with+genetics+and+physiological+assays.">Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays.</a> Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).</li><li>Schlimgen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+Associated+With+Lentiviral+Vector+Exposures+and+Prevention+Strategies.">Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies.</a> Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+islet+for+improved+performance+by+optimized+reaggregation+in+alginate+gel+beads.">Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).</li><li>Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+re-aggregated+human+pancreatic+islets+for+secondary+drug+screening.">Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening.</a> British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).</li><li>Hilderink, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+aggregation+of+primary+human+pancreatic+islet+cells+leads+to+glucose-responsive+pseudoislets+comparable+to+native+islets.">Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).</li><li>Saunders, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectonucleoside+Triphosphate+Diphosphohydrolase-3+Antibody+Targets+Adult+Human+Pancreatic+beta+Cells+for+In+Vitro+and+In+Vivo+Analysis.">Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis.</a> Cell Metabolism. (18), (2018).</li><li>Reissaus, C. A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reestablishment+of+Glucose+Inhibition+of+Glucagon+Secretion+in+Small+Pseudoislets.">Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets.</a> Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).</li></ol>

Здесь представлен подробный протокол для генерации человеческих псевдоизлетов, которые трансцируются с помощью 96-хорошо ультра-низкой пластины крепления или микроколодца культуры пластины. Псевдоизоляторы, как сообщается, демонстрируют морфологию и секреторные функции, похожие<sup cl...

Потеря функциональной бета-клеточной массы является центральной патологией какдля диабета типа 1, так и для 2-го типа 1. В то время как бета-клетки являются производителями инсулина в островках поджелудочной железы, связь между бета-клетками и небета-клетками играет важную роль в регуляции секреции инсулина2. Кроме того, дисрегуляция секреции глюкагона способствует гипергликемии при диабете3. Таким образом, существует большой интерес к модулировать экспрессию генов клеток в островках поджелудочной железы для решения механизма развития дисфункции островка при диабете. Различные подходы, включая трансгенных мышей доступны для модулировать экспрессию генов островков мыши. Тем не менее, человек и мышь островки показывают различные иннервации, распределение клеток, соотношение бета-клеток к альфа-клетки, и ответ на secretagogues4. Поэтому прямая оценка функции генов в островках человека чрезвычайно важна для понимания патофизиологии островков поджелудочной железы человека.
Аденовирусный вектор является наиболее широко используемым вирусным вектором для претворения островков поджелудочной железы в пробирке из-за высокой эффективности трансдукции в неразделяющихся клетках. Однако аденовирус не проникает в ядро островков эффективно, особенно в островки человека5,и является цитотоксическим в высоких дозах6. Сравнительно, лентивирусный вектор менее цитотоксичен и поставляет экзогенные гены постоянно в хромосому пост-митотических клеток, что делает его широко проверенным средством для генной терапии7. Тем не менее, способность лентивирус проникнуть в ядро нетронутых островков человека также ограничена, тем самым требуя частичной дисперсии путем ферментативного пищеварения для повышения эффективности трансдукции8. Предостережение с дисперсией нетронутых островков человека прерывание клеток и клеточной матрицы связи, которая ставит под угрозу динамическую регуляцию секреции инсулина решающее значение для поддержания гомеостаза глюкозы у людей9. Таким образом, было сложно оценить влияние модуляции генов на динамическую регуляцию островковой функции в модели островков человека.
Известно, что рассеянные островков ы токсы с островков человека и грызунов автономно реагрегатируются на островоподобные структуры, называемые «псевдоизлетами». Псевдоислеты показывают бета-и небета-клеточная дистрибуция, аналогичная родному островкам10,11. Кроме того, после долговременной культуры, родные островкипостепенно теряют надежную первую фазу секреции инсулина 5,10,11,12. Тем не менее, псевдоизлеты продемонстрировали лучшее сохранение секреции инсулина первой фазы в ответ на глюкозу по сравнению с местными островками после того же периода культуры5. В дополнение к лучшей секреции инсулина, контролируемые размером реагрегации клеток человека в низких пластинах крепления11 предоставляет окно возможностей для введения лентивирусных векторов до их реагрегации в псевдовизлеты. Несколько исследований продемонстрировали полезность псевдоизлетов в сочетании с опосредования трансдукции лентивиральной. Caton et al.13 сообщили, что введение зеленого флуоресцентного белка (GFP), выражающего лентивирус, мало повлияло на секрецию инсулина при достижении однородного выражения ГФП в крысиных псевдоислетах по сравнению с неинфицированным контролем. Они также продемонстрировали специфическое влияние различных connexins на секрецию инсулина путем overexpressing connexins 32, 36, и 43 через lentivirus13. Человеческие псевдовизлеты, подготовленные с коммерчески доступной 96-хорошо ультра-низкой пластины крепления показали, что lentiviral-опосредованное переэкспрессия транскрипционного фактора SIX3 улучшает секрецию инсулина оценивается статической инкубации14. Недавно, человеческие псевдовизлеты, подготовленные с 96-хорошо ультра-низкой пластины крепления были использованы для downregulate глюкокиназы через lentiviral короткой шпильки РНК (SHRNA) в качестве доказательства принципа, чтобы показать, что глюкоза стимулировали секреции инсулина уменьшается, в то время как KCl-стимулировали секрецию инсулина была сохранена5. Исследование также показало, что человеческие псевдоизоляторы похожи на родние островки в экспрессии генов и секреторных профилях, что еще больше поддерживает полезность человеческих псевдоизлетов для вскрытия регуляции островной функции5. Хотя перифузия не была выполнена, биоинженерных микроколодцы культуры пластины, которые недавно стали коммерчески доступны, также сообщается, что совместимы для лентивирусной трансдукции и производства человеческих псевдоизоляторов, которые выставлены отличные инсулина секреция in vitro и in vivo после трансплантации11. В совокупности, формирование человеческого псевдоистлета в сочетании с лентивирусной трансдукцией является простым и эффективным подходом к исследованию патологиологии островков человека, обеспечивая ценный инструмент для проведения механистических исследований на человеческих островках.
В настоящем докладе представлен протокол для формирования человеческих псевдоизоляторов, трансцизированных с помощью лентивирусной платформы, 96-хорошо ультра-низкой пластины крепления и микроколодцы культуры пластины. Оба достигают эффективной модуляции экспрессии генов и создают человеческие псевдоизоляторы, совместимые для оценки вниз по течению, включая статическое инкубацию и перифузию.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series Type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer, 40 micrometer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11530037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Trizol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marien Feld</td>
			<td>Neubauer-Improved Bright line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>11-350-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube, 1.5 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microwell culture plate</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>34411</td>
			<td>Aggrewell 400, 24 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motor-driven pestle</td>
			<td>GAMUT</td>
			<td>#399X644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-tissue culture treated dish, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 mm</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 5 mL</td>
			<td>DOT Scientific,</td>
			<td>667205B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 8-channel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#613-5253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>667210B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P10</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P200</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P1000</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteolytic and collagenolytic enzyme mixture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6965</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagent reservoir, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversible strainer, 37 micrometer</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>27251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket plate centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-14R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SX4750A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin syringe, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra low attachment microplate, 96 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4515</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates

Различные генетические инструменты доступны для модулирования генов в островках поджелудочной железы грызунов для вскрытия функции островковых генов для исследования диабета. Однако данные, полученные с островков грызунов, часто не полностью воспроизводятся или применимы к островкам человека из-за хорошо известных различий в структуре и функции островка между видами. В настоящее время методы, доступные для манипулирования экспрессией генов человеческих островков, очень ограничены. Введение трансгена в нетронутые островки аденовирусом, плазмидом и олигонуклеотидами часто страдает от низкой эффективности и высокой токсичности. Низкая эффективность особенно проблематична в исследованиях по снижению генов в нетронутых островках, которые требуют высокой эффективности. Было известно, что ферментативно-рассеянные островковые клетки реагрегируются в культуре формирования сфероидов, называемых псевдоислетами. Контролируемые размером реагрегации клеток островка человека создают псевдоизоляторы, которые поддерживают динамическую секрецию инсулина первой фазы после длительной культуры и обеспечивают окно для эффективного введения лентивирусной короткой ШПильки РНК (SHRNA) с низкой токсичностью. Здесь описан подробный протокол для создания человеческих псевдоислетов после трансдукции ллентивиров с использованием двух коммерчески доступных мультивеллных пластин. Протокол может быть легко выполнен и позволяет эффективно едить внизрегулрецию генов и оценку динамизма секреции инсулина с использованием человеческих клеток-разлеток. Таким образом, человеческие псевдоизоляторы с опосредованной генной модуляцией обеспечивают мощную и универсальную модель для оценки функции генов в клетках островков человека.

Рисунок 1 иллюстрирует ключевые шаги в производстве псевдоизлетов с использованием 96-хорошо ультра-низкой пластины крепления и микроколодцы культуры пластины. На рисунке 2а показаны последовательные изменения в морфологии при формир?...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates at JoVE.com

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Представлен протокол для создания геномодифицированных человеческих псевдоизоляторов из рассеянных клеток островков человека, которые переводятся лецивирусом, несущим короткую ШПильку РНК (shRNA). Этот протокол использует легко доступные ферменты и культурные сосуды, может быть выполнена легко, и производит генетически модифицированные человеческие псевдоизоляторы, пригодные для функциональных и морфологических исследований.

Лентивирные посредничества Джин Silencing в человека Pseudoislet Подготовлено в низких пластин присоединения

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Трудно модулировать экспрессию генов в человеческих островках, также большее снижение функционирования человеческих островков создают серьезные проблемы после модуляции экспрессии генов. Комбинируя лентивирус опосредованную трансдукцию SHR8 и формирование подходящих для человека островков. Этот протокол позволяет эффективно downregulation целевого гена при сохранении функции островка во время длительной культуры.Для начала аккуратно закружить судоходную бутылку, чтобы держать островки в подвеске. Перенесите судоходную среду, содержащую островки, в 50-миллилитровую коническую центрифугу. Пусть трубка сидеть в шкафу биологической безопасности в течение 15 минут, так что островки оседают на дно трубки.Удалите судоходство среды осторожно с помощью капиллярной пипетки, не нарушая островок гранулы. Повторно приостановить островок гранулы в среде CMRL с 1%человеческой сыворотки альбумин в концентрации 400 островок эквивалент на миллилитр. Передача островков в не-ткани культуры лечение блюдо и культуры их при 37 градусов по Цельсию в 5%углекислого газа инкубатор на ночь.После ночной культуры, передача человеческих островков в 15 миллилитров конической центрифуги трубки, центрифуги на 250 раз г в течение пяти минут в размахивая ротором ведро. И аспирировать среды с капиллярной пипетки, не нарушая островок гранулы. Вымойте гранулы моего добавления 10 миллилитров PBS в трубку, аккуратно перемешать и центрифугу в 250 раз г в течение пяти минут.После центрифугации, аспират PBS, не нарушая островок гранулы. Повторно приостанавливайте гранулы в 0,5 миллилитров предварительно разогретой протеолитической и коллагенолитической ферментной смеси. Pipette пять раз с помощью P1000 пипетки смешивать островки.Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут. После инкубации, смешать пипетку ласки вверх и вниз мягко. Проверьте облачность одной ячейки и количество хлопьев или непереваренных островков.Поместите 40 микрон ситечко в 35-миллиметровую чашку Петри и промокнете ситечко, добавив один миллилитр среды CMRL с 10%тепловой инактивированной сывороткой крупного рогатого скота плода и угнетая одним миллилитровым шприцем. Перенесите всю подвесную клетку поверх ситечко. И соберите пропуск через в свежей 15 миллилитровой трубке.Вымойте трубку, используемую для пищеварения островка с 0,5 миллилитров свежей среды CMRL для сбора оставшихся клеток и пройти мыть через ситечко. Смешайте проход через в 15 миллилитров трубки. Повторите один раз.Чтобы отмежеваться от непереваренных островков, оставшихся на ситечко, нажмите на ситечко одним миллилитровым шприцем. Соберите пройти через снова и мыть ситечко со свежей простой CMRL 1066 среды, чтобы удалить все оставшиеся переваренные островки из ситечко и блюдо. Добавьте проход к 15 миллилитровой трубке.Замечите общий объем клеточной подвески и возьмите 10 микролитров алицита клеток, чтобы подсчитать номер клетки на гемоцитометре. После центрифугирования клеточной суспензии в течение пяти минут при 200 раз г, удалите среду, не нарушая гранулы. Для производства псевдо-островков с помощью 96 хорошо ультра низкой пластины крепления, сначала рассчитать общий объем необходимых один раз от 10 до пятых клеток на миллилитр одноклеточной подвески.Затем повторно приостанавливайте островок гранулы в среде CMRL с 10%-теплой инактивированной сывороткой крупного рогатого скота плода, так что 30 микролитров клеточной суспензии имеет 3000 клеток. Затем перенесите необходимый объем одноклеточной подвески на свежую 15-миллилитровую трубку. На 250 единиц трансдукции на клетку лентивируса, содержащего SH-РНК ориентации гена интереса или контроля.Чтобы смешать клеточной суспензии с вирусом, пипетка осторожно пять раз с P1000 пипетки. Затем перенесите смешанные клетки в 50-миллилитровый стерильный резервуар реагентов при использовании восьмиканальную пипетку. С восьмиканарной пипеткой или P200 пипеткой, обойтись 30 микролитров на колодец клеточной подвески смешивается с лентивирусом в каждой хорошо.Далее, центрифуга 96 хорошо пластины в размахивая ведро пластины центрифуги при 270 раз г при комнатной температуре в течение семи минут. Культура при 37 градусах по Цельсию в увлажненные 5%углекислого газа инкубатор ночь. После инкубации снимите пластину 96 хорошо из инкубатора и поместите ее в шкаф биологической безопасности.Pipette 100 микролитров на островок 10%-й FBSCMRL в колодец, чтобы предотвратить высыхание островков и продолжать культуру в течение одной недели. Pipette 100 микролитров на колодец среды CMRL с 10% тепла инактивированной сыворотки крупного рогатого скота плода из резервуара для псевдо-островков и пипетки вверх и вниз два-три раза мягко в колодец, чтобы поднять островки вверх. Затем аспирировать среду в колодец, содержащий псевдо-островок и извлечь в 10 сантиметров чашку Петри.Проверьте пластину под световым микроскопом, чтобы обеспечить полное удаление всех псевдо-островков и приступить к вниз по течению экспериментов. Для производства псевдо-островков с использованием 24 хорошо микро хорошо культуры пластины, сначала добавить 500 микролитров на колодец анти-присоединения полоскания решения. Центрифуга при 1300 раз г в течение пяти минут в размахивая ведро пластины центрифуги.Затем наблюдайте за пластиной под микроскопом, чтобы убедиться, что пузырьки воздуха удаляются из микро-колодцев. В кабинете биологической безопасности, аспирировать анти-присоединения полоскания раствор из скважин. Промыть каждый колодец с двумя миллилитров теплой равнине CMRL 1066 среды один раз.Затем, аспирировать простой CMRL 1066 среды и добавить 0,5 миллилитра на колодец теплого CMRL с 10% тепла инактивированной сыворотки крупного рогатого скота плода к каждому хорошо спланированы для использования. Определите общее количество ячеек, необходимых для каждой колодец. Повторно приостанавливать одиночные клетки в 0,8 миллилитров среды CMRL с 10% тепла инактивированной сыворотки крупного рогатого скота плода в стерильной 1,5 миллилитровой трубки.Чтобы создать один колодец псевдо-островка, вызванного лентивирусом, добавьте 125 единиц трансдукции на клетку к одноклеточной подвеске, сохраняя объем вируса ниже 0,2 миллилитров. Инкубировать клеточной и вирусной смеси при 37 градусах по Цельсию с редким нежным смешивания в течение одного часа, чтобы контакт клеток с вирусом до конденсации клеток. Через час отрегулируйте общий объем островковой клетки и вирусной смеси до одного миллилитра, добавив среду CMRL с 10%-теплой инактивированной сывороткой крупного рогатого скота плода.Если клетки образуют комки после одного часа инкубации разойтись в одну ячейку подвески нежным и быстро pipetting два-три раза. Перенесите подвеску клетки в один колодец из 24 хорошо микро-хорошо культуры пластины. Сразу же после пипетки, центрифуга при 100 раз г при комнатной температуре в течение трех минут, чтобы захватить клетки во все микро-колодцы.Наблюдайте под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки равномерно распределены во всех микро-колодцах. Очень важно центрифуза пластины микро-хорошо сразу после добавления хорошо смешивания островок одноклеточной подвески в скважины. Последовательные изменения в морфологии псевдо-островков из 3000 клеток островков человека, созданных в 96 хорошо ультра низкой пластины крепления показали монослой или свободные скопления клеток превратились в твердые агрегаты с гладкой круглой границей в течение одной недели.В отличие от этого, в микро-хорошо культуры пластины, формирование клеток и псевдо-островков только из 500 островков клеток, как правило, видны в течение четырех дней. Единый размер псевдо-островков уменьшает вариации в тестовой группе и позволяет статической инкубации, используя всего пять псевдо-островков на измерение. Перри Fusion Анализ инсулина ответ показал человека псевдо-островки поддерживается надежной первой фазы секреции инсулина в ответ на глюкозу после семи дней культуры.Введение лентивируса, направленного против жировой триглицеридов липазы человека или перилипина пяти генов в одноклеточную суспензию, обеспечивает эффективную и однородную трансдукцию островковых клеток и обеспечивает высокоэффективную даунрегуляцию генов. Важно помнить, что время, необходимое для разгона человеческого островка в одиночные клетки, зависит от многих факторов, таких как: размер, распределение и характеристика донора. Поэтому важно обратить пристальное внимание на исчезновение человеческих островков во время пищеварения.На протяжении всего протокола важно обращаться с одноклеточной подвеской мягко, чтобы избежать потери ячейки. Созданные псевдо островки человека могут быть использованы для многих приложений для определения эффекта модуляции генов, таких как: Западная пятно, гистологическое исследование и измерения показателей потребления кислорода. Этот протокол позволяет оценить низкий целевой ген в регуляции здоровья островков и функции в человеческих островках с помощью общей лабораторной посуды и простых методов.Использование человеческих островков может потребовать предварительного одобрения со стороны местного совета по обзору. Пожалуйста, проконсультируйтесь с местным советом по обзору до начала исследования. Лентивирус классифицируется как уровень биобезопасности два.Обратитесь в комитет по биобезопасности до начала использования лентивируса.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

миРНК Трансфекция и EMSA Анализы на свежеизолированных ворсинок Cytotrophoblasts человека

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Параллельное измерение циркадных часов экспрессии генов и гормональную секрецией человека первичных клеточных культур

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Разведению и двухцепочечную РНК-опосредованный нокдаун гена в Скрыть Beetle,<em&gt; Кожеед пятнистый</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Отборочное и независимое генерирование CRISPR / Cas9-опосредованных генов-нокаутов в клетках млекопитающих

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Протокол иммунопреципитации (чип) Chromatin для Low изобилие эмбриональных образцов

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Стандартная методология для изучения на месте мутагенность как функция Точечная мутация ремонта, катализируемые ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и SsODN в клетках человека

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной целенаправленной интеграции в естественных условиях с помощью стратегию на основе присоединения гомологии опосредованной конец

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Протокол для производства интеграза недостаточным лентивирусные векторы для ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной нокаут генов в делящихся клетках

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

ТРИФОСФАТЫ опосредованной реорганизация структуры хроматина цикла

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Лентивирусные опосредованной производства трансгенных мышей: простой и очень эффективный метод для непосредственного изучения учредителей

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...