Name: lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates
Uploaded: 2019-05-14T13:30:00
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Este trabajo fue apoyado financieramente por los Institutos Nacionales de Salud a Y.I. (R01-DK090490) y la Asociación Americana de la Diabetes a Y.I. (1-17-IBS-132). J.A. e Y.I. cuentan con el apoyo del Centro de Investigación de la Diabetes de la Orden Fraternal de águilas. A.B. cuenta con el apoyo de una beca de capacitación de los Institutos Nacionales de Salud (T32NS45549). Los autores utilizaron islotes pancreáticos humanos proporcionados por el Programa Integrado de Distribución de Islotes (IIDP) financiado por NIDDK en City of Hope (2UC4DK098085).

Antes del inicio de los estudios, la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Iowa hizo una determinación de investigación de sujetos humanos, que determinó que el estudio no cumplía con los criterios para la investigación de sujetos humanos. Consulte a la junta de revisión local antes del inicio del estudio para determinar si la fuente de los islotes y el estudio planificado requiere aprobación previa.
NOTA: Típicamente, 1,200-1,400 islotes equivalentes (...

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	<li>Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta+cell+mass+and+function+in+diabetes:+Recent+advances+in+knowledge+and+technologies+to+understand+disease+pathogenesis.">Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).</li><li>Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+flexible+system+for+glucose+homeostasis.">Stable and flexible system for glucose homeostasis.</a> Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).</li><li>Cryer, P. 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Aquí, se presenta un protocolo detallado para generar pseudoislotes humanos que son transducidos por lentivirus usando una placa de fijación ultrabaja de 96 pocillos o una placa de cultivo de micropocillos. Se ha informado que los pseudoislotes demuestran morfología y funciones secretoras similaresa los islotes humanos nativos y pueden ser cultivados durante un tiempo prolongado in vitro 5,11,18. A diferencia de los islotes h...

La pérdida de masa beta celular funcional es la patologíacentral de la diabetes tipo 1 y tipo 2 1. Si bien las células beta son los productores de insulina en los islotes pancreáticos, lacomunicación entre las células beta y las células no beta desempeña un papel crítico en la regulación de la secreción de insulina 2. Además, la desregulación de la secreción de glucagón contribuye a la hiperglucemia en la diabetes3. Por lo tanto, existe un gran interés en modular la expresión génica de las células dentro de los islotes pancreáticos para abordar el mecanismo detrás del desarrollo de la disfunción de los islotes en la diabetes. Una variedad de enfoques, incluyendo ratones transgénicos están disponibles para modular la expresión génica de islotes de ratón. Sin embargo, los islotes humanos y de ratón muestran una inervación distinta, distribución celular, relación de células beta a alfa y respuesta a secretagogos4. Por lo tanto, la evaluación directa de la función génica en los islotes humanos es extremadamente importante para entender la fisiopatología de los islotes pancreáticos humanos.
El vector adenoviral es el vector viral más utilizado para transducir islotes pancreáticos in vitro debido a la alta eficiencia de la transducción en células no divisorias. Sin embargo, el adenovirus no penetra en el núcleode los islotes de manera eficiente, especialmente en los islotes humanos 5, y es citotóxico a dosis altas6. Comparativamente, el vector lentiviral es menos citotóxico y suministra genes exógenos permanentemente en el cromosoma de lascélulas postmitoticas, lo que lo convierte en un vehículo ampliamente probado para la terapia génica 7. Sin embargo, la capacidad del lentivirus para penetrar en el núcleo de los islotes humanos intactos también es limitada, por lo que requiere la dispersión parcial por digestión enzimática para aumentar la eficiencia de transducción8. La salvedad con la dispersión de islotes humanos intactos es la interrupción de la comunicación célula-célula y célula-matriz, que compromete la regulación dinámica de la secreción de insulina crítica para el mantenimiento de la homeostasis de glucosa en humanos9. Por lo tanto, ha sido difícil evaluar el impacto de la modulación génica en la regulación dinámica de la función de los islotes en un modelo de islotes humanos.
Se ha sabido que las células de los islotes dispersos de los islotes humanos y roedores se reagregan de forma autónoma en estructuras similares a islotes llamadas "pseudoislotes". Los pseudoislotes muestran una distribución de células beta y no beta similar a los islotes nativos10,11. Además, después de un cultivo a largo plazo,los islotes nativos pierden progresivamente la secreción de insulina robusta de primera fase 5,10,11,12. Sin embargo, los pseudoislotes demostraron una mejor preservación de la secreción de insulina de primera fase en respuesta a la glucosa en comparación con los islotes nativos después del mismo período de cultivo5. Además de tener una mejor preservación de la secreción de insulina, la reagregación controlada por tamaño de las células de los islote humanos en placas de baja fijación11 proporciona una ventana de oportunidad para introducir vectores de lentivirus antes de su reagregación en pseudoislatas. Varios estudios han demostrado la utilidad de los pseudoislotes combinados con la transducción mediada lentiviral. 13 informaron que la introducción de la proteína fluorescente verde (GFP) que expresaba el lentivirus tenía poco efecto sobre la secreción de insulina mientras se logralaba la expresión homogénea de GFP en pseudoislotes de rata en comparación con el control no infectado. También demostraron el efecto específico de las diferentes conexiones en la secreción de insulina al sobreexpresar las connexinas 32, 36 y 43 a través de lentivirus13. Los pseudoislotes humanos preparados con una placa de fijación ultrabaja de 96 pocillos disponible comercialmente demostraron que la sobreexpresión mediada por lentiviral del factor de transcripción SIX3 mejora la secreción de insulina evaluada por incubación estática14. Recientemente, los pseudoislotes humanos preparados con una placa de unión ultrabaja de 96 pocillos se utilizaron para regular la glucoquinasa a través de ARN de horquilla corta lentiviral (shRNA) como prueba de principio para demostrar que la secreción de insulina estimulada por la glucosa se reduce, mientras que La secreción de insulina estimulada por KCl se conservó5. El estudio también demostró que los pseudoislotes humanos son similares a los islotes nativos en la expresión génica y los perfiles secretores, apoyando aún más la utilidad de los pseudoislotes humanos para diseccionar la regulación de la función de islotes5. Aunque no se realizó la perifusión, también se informó que una placa de cultivo de micropocillos bioingeniería que recientemente estuvo disponible comercialmente, también era compatible para la transducción lentiviral y producía pseudoislotes humanos que mostraban una excelente insulina secreción in vitro e in vivo después del trasplante11. Colectivamente, la formación de pseudoislotes humanos combinados con la transducción lentiviral es un enfoque simple y eficiente para investigar la fisiopatología de los islotes humanos, proporcionando una valiosa herramienta para realizar estudios mecánicos en islotes humanos.
En el informe actual, se presenta un protocolo para formar pseudoislotes humanos transducidos con lentivirus utilizando dos plataformas disponibles comercialmente, una placa de fijación ultrabaja de 96 pocillos y una placa de cultivo de micropocillos. Ambos logran una modulación eficiente de la expresión génica y crean pseudoislotes humanos que son compatibles con las evaluaciones posteriores, incluida la incubación estática y la perifusión.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series Type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer, 40 micrometer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11530037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Trizol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marien Feld</td>
			<td>Neubauer-Improved Bright line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>11-350-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube, 1.5 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microwell culture plate</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>34411</td>
			<td>Aggrewell 400, 24 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motor-driven pestle</td>
			<td>GAMUT</td>
			<td>#399X644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-tissue culture treated dish, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 mm</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 5 mL</td>
			<td>DOT Scientific,</td>
			<td>667205B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 8-channel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#613-5253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>667210B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P10</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P200</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P1000</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteolytic and collagenolytic enzyme mixture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6965</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagent reservoir, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversible strainer, 37 micrometer</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>27251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket plate centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-14R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SX4750A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin syringe, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra low attachment microplate, 96 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4515</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates

Hay varias herramientas genéticas disponibles para modular genes en islotes pancreáticos de roedores para diseccionar la función de los genes de los islotes para la investigación de la diabetes. Sin embargo, los datos obtenidos de los islotes de roedores a menudo no se reproducen completamente en o son aplicables a los islotes humanos debido a diferencias bien conocidas en la estructura y función de las islotes entre las especies. Actualmente, las técnicas que están disponibles para manipular la expresión génica de los islotes humanos son muy limitadas. Introducción de transgén en islotes intactos por adenovirus, plásmido, y oligonucleótidos a menudo sufre de baja eficiencia y alta toxicidad. La baja eficiencia es especialmente problemática en los estudios de regulación genética en islotes intactos, que requieren una alta eficiencia. Se ha sabido que las células de los islotes dispersos enzimáticamente se reagregan en cultivo formando esferoides llamados pseudoislotes. La reagregación controlada por tamaño de las células de los islotes humanos crea pseudoislotes que mantienen la secreción dinámica de insulina en primera fase después de un cultivo prolongado y proporcionan una ventana para introducir eficientemente ARN de horquilla corta lentiviral (ARN) con baja toxicidad. Aquí, se describe un protocolo detallado para la creación de pseudoislotes humanos después de la transducción lentiviral utilizando dos placas multipocillos disponibles comercialmente. El protocolo se puede realizar fácilmente y permite una regulación eficiente de los genes y la evaluación del dinamismo de la secreción de insulina utilizando células de isla humana. Por lo tanto, los pseudoislotes humanos con modulación génica mediada lentiviral proporcionan un modelo potente y versátil para evaluar la función génica dentro de las células de los islotes humanos.

La Figura 1 ilustra los pasos clave en la producción de pseudoislotes utilizando una placa de fijación ultrabaja de 96 pocillos y una placa de cultivo de micropocillos. La Figura 2a muestra cambios secuenciales en la morfología durante la formación de pseudoislotes de 3 x 103 células de islotes humanos en una placa de unión ultra baja de 96 pocillos. Los grupos monocapa o sueltos de células observadas en el día...

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Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Se presenta un protocolo para crear pseudoislotes humanos modificados genéticamente a partir de células de islotes humanos dispersas que son transducidas por lentivirus que transportan ARN de horquilla corta (ARN de shRNA). Este protocolo utiliza enzimas y vasos de cultivo fácilmente disponibles, se puede realizar fácilmente y produce pseudoislotes humanos modificados genéticamente adecuados para estudios funcionales y morfológicos.

Silenciamiento de genes mediado por Lentiviral en pseudoislet humano preparado en placas de baja fijación

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Es difícil modular la expresión génica en los islotes humanos, también un mayor declive de los islotes humanos en funcionamiento plantean grandes desafíos después de la modulación de la expresión génica. Mediante la combinación de la transducción SHR8 mediada por lentivirus y la formación de islotes adecuados para humanos. Este protocolo permite una regulación eficiente de un gen objetivo mientras se preserva la función del islote durante el cultivo prolongado.Para empezar, gire suavemente la botella de envío para mantener los islotes en suspensión. Transfiera el medio de envío que contiene islotes a un tubo de centrífuga cónica de 50 mililitros. Deje que el tubo se siente en un armario de seguridad biológica durante 15 minutos para que los islotes se asienten en la parte inferior del tubo.Retire suavemente el medio de envío con una pipeta capilar sin alterar el pellet del islote. Vuelva a suspender el pellet de islote en medio CMRL con albúmina sérica 1% humana a una concentración de 400 islotes equivalentes por mililitro. Transfiera los islotes a un plato tratado con cultivo no tisular y escútelos a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono del 5% durante la noche.Después del cultivo nocturno, transfiera los islotes humanos a un tubo de centrífuga cónica de 15 mililitros, centrífuga a 250 veces g durante cinco minutos en un rotor de cubo oscilante. Y aspirar el medio con una pipeta capilar sin alterar el pellet del islote. Lavar el pellet mi adición de 10 mililitros de PBS al tubo, mezclar suavemente y centrífuga a 250 veces g durante cinco minutos.Después de la centrifugación, aspirar PBS sin alterar el pellet de islote. Vuelva a suspender el pellet en 0,5 mililitros de una mezcla de enzima proteolítica y colágeno precaliente. Pipeta cinco veces con una pipeta P1000 para mezclar islotes.Incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Después de la incubación, mezcle la pipeta acariciando suavemente. Compruebe si hay nubosidad de una sola célula y el número de escamas o islotes no digeridos.Coloque un colador de 40 micras en una placa de petri de 35 milímetros y moje el colador añadiendo un mililitro de CMRL medio con 10% de suero bovino fetal inactivado con calor y presionando con un émbolo de jeringa de un mililitro. Transfiera toda la suspensión celular en la parte superior del colador. Y recoger el paso a través de un tubo fresco de 15 mililitros.Lavar el tubo utilizado para la digestión de los islotes con 0,5 mililitros de medio CMRL fresco para recoger las células sobrantes y pasar el lavado a través del colador. Combine el paso en un tubo de 15 mililitros. Repita una vez.Para disociar los islotes no digeridos que quedan en el colador, presione el colador con un émbolo de jeringa de un mililitro. Recoger el paso a través de nuevo y lavar el colador con CMRL 1066 medio fresco para eliminar todos los islotes digeridos restantes del colador y el plato. Agregue el paso a través del tubo de 15 mililitros.Registre el volumen total de la suspensión celular y tome una alícuota de 10 microlitrolidores de células para contar el número de célula en un hemocitoómetro. Después de centrifugar la suspensión celular durante cinco minutos a 200 veces g, retire el medio sin alterar el pellet. Para producir pseudo-islotes usando una placa de fijación ultrabajo de 96 pozos, primero calcule el volumen total de la requerida una vez 10 a las quintas células por mililitro de la suspensión de una sola célula.Luego, vuelva a suspender el pellet de islote en medio CMRL con 10% de suero bovino fetal inactivado con calor térmico para que 30 microlitros de la suspensión celular tenga 3000 células. A continuación, transfiera el volumen requerido de la suspensión de una sola célula a un tubo nuevo de 15 mililitros. A 250 unidades de transducción por célula de un lentivirus que contiene ARN-RNA dirigido a un gen de interés o un control.Para mezclar la suspensión celular con el virus, pipetee suavemente cinco veces con una pipeta P1000. A continuación, transfiera las células mixtas a un depósito de reactivos estériles de 50 mililitros si utiliza una pipeta de ocho canales. Con una pipeta de ocho canales o una pipeta P200, dispensar 30 microlitros por pozo de la suspensión celular mezclada con lentivirus en cada pozo.A continuación, centrifugar la placa de 96 pozos en una centrífuga de placa de cubo oscilante a 270 g a temperatura ambiente durante siete minutos. Cultivo a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5% durante la noche. Después de la incubación, retire la placa de 96 pozos de la incubadora y colóquela en el armario de seguridad biológica.Pipetear 100 microlitros por islote de FBSCMRL 10% alto en un pozo para evitar el secado de islotes y continuar el cultivo durante una semana. Pipetear 100 microlitros por pozo de CMRL medio con 10%calor inactivado suero bovino desde el depósito hasta los pseudo-islotes y pipeta arriba y abajo dos a tres veces suavemente en el pozo para levantar los islotes hacia arriba. A continuación, aspirar el medio en el pozo que contiene un pseudo-islote y expulsar en un plato de petri de 10 centímetros.Compruebe la placa bajo un microscopio de luz para asegurar la eliminación completa de todos los pseudo-islotes y proceder a experimentos aguas abajo. Para producir pseudo-islotes utilizando una placa de cultivo de micro pozo de 24 pozos, primero agregue 500 microlitros por pozo de una solución de enjuague antiadherente. Centrifugar a 1300 g durante cinco minutos en una centrífuga de placa de cubo oscilante.A continuación, observe la placa bajo un microscopio para asegurarse de que las burbujas de aire se eliminan de los micro-pozos. En un armario de seguridad biológica, aspirar la solución de enjuague antiadherencia de los pozos. Enjuague cada pozo con dos mililitros de medio CMRL 1066 liso y cálido una vez.A continuación, aspirar el medio CMRL 1066 liso y añadir 0,5 mililitros por pozo de CMRL caliente con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor a cada bien planeado para su uso. Determine el número total de celdas necesarias para cada pozo. Re-suspenda las células individuales en 0,8 mililitros de CMRL medio con 10%suero bovino fetal inactivado por calor en un tubo estéril de 1,5 mililitros.Para crear un pozo de pseudo-islote transducido por un lentivirus, agregue 125 unidades de transducción por célula a la suspensión de una sola célula manteniendo el volumen de virus por debajo de 0,2 mililitros. Incubar la mezcla celular y de virus a 37 grados centígrados con mezcla suave ocasional durante una hora para permitir el contacto de las células con el virus antes de la condensación de las células. Después de una hora, ajuste el volumen total de la célula de islote y la mezcla de virus a un mililitro añadiendo cm3 medio con 10%suero bovino activado por calor.Si las células forman grumos después de una incubación de una hora se dispersan en una suspensión de una sola célula por pipeteo suave y rápido de dos a tres veces. Transfiera la suspensión celular a un pozo de la placa de cultivo de micro-pozo de 24 pozos. Inmediatamente después del pipeteo, centrifugar a 100 veces g a temperatura ambiente durante tres minutos para capturar las células en todos los micro-pozos.Observe bajo un microscopio para verificar que las células se distribuyen uniformemente en todos los micro-pozos. Es fundamental centrifugar la placa de micro-pozo inmediatamente después de agregar el pozo mezclando la suspensión de una sola célula de islote en los pozos. Los cambios secuenciales en la morfología de pseudo-islotes a partir de 3000 células de islotes humanos creadas en una placa de unión ultra baja de 96 pozos mostraron grupos monocapa o sueltos de células convertidas en agregados sólidos con un borde redondo suave en una semana.Por el contrario, en una placa de cultivo de micro-pozo, la formación de células y pseudo-islotes de sólo 500 células de islotes es generalmente visible dentro de cuatro días. El tamaño uniforme de los pseudo-islotes reduce la variación dentro de un grupo de prueba y permite la incubación estática utilizando tan solo cinco pseudo-islotes por medición. El ensayo Perry Fusion para la respuesta a la insulina mostró que los pseudo-islotes humanos mantuvieron una sólida secreción de insulina en la primera fase en respuesta a la glucosa después de siete días de cultivo.La introducción de lentivirus dirigido a la lipasa de triglicéridos adiposo humano o a cinco genes en una sola suspensión celular garantiza la transducción eficiente y homogénea de las células de los islotes y logra una regulación descendente altamente eficiente de los genes. Es importante recordar que el tiempo necesario para dispersar el islote humano en células individuales se ve afectado por muchos factores como: tamaño, distribución y la característica del donante. Por lo tanto, es importante prestar mucha atención a la desaparición de los islotes humanos durante la digestión.A lo largo del protocolo es importante manejar la suspensión de una sola célula suavemente para evitar la pérdida de células. Los pseudo-islotes humanos que se crean se pueden utilizar para muchas aplicaciones para determinar el efecto de la modulación génica como: Western Blot, estudio histológico y las mediciones de las tasas de consumo de oxígeno. Este protocolo permite evaluar la baja del gen objetivo en la regulación de la salud de los islotes y la función en los islotes humanos mediante el uso de material de laboratorio común y técnicas simples.El uso de islotes humanos puede requerir una aprobación previa de una junta de revisión local. Por favor, consulte a la junta de revisión local antes de iniciar el estudio. Lentivirus se clasifica como nivel de bioseguridad dos.Póngase en contacto con el comité de bioseguridad antes de iniciar el uso del lentivirus.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Investigación

Genética

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