Name: lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates
Uploaded: 2019-05-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates at JoVE.com

Detta arbete stöddes ekonomiskt av National Institutes of Health till Y.I. (R01-DK090490) och American Diabetes Association till Y.I. (1-17-IBS-132). J.A. och Y.I. stöds av den broderliga Order of Eagles diabetes Research Center. A.B. stöds av ett nationellt institut för hälsoutbildning Grant (T32NS45549). Författarna utnyttjas mänskliga pankreasöar som tillhandahålls av NIDDK-finansierade integrerade Holmen distribution program (IIDP) vid City of Hope (2UC4DK098085).

Före påbörjande av studier, en försökspersoner forsknings beslut gjordes av University of Iowa institutionella Review Board, som fastställt att studien inte uppfyllde kriterierna för försökspersoner forskning. Konsultera den lokala Granskningsnämnden innan studien inleds för att avgöra om källan till kobbar och planerad studie kräver förhandsgodkännande.
Anmärkning: Typiskt är 1200 − 1400 ö-ekvivalent (IEQ) av humana öar krävs för bildandet av 192 pseud...

<ol>
	<li>Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta+cell+mass+and+function+in+diabetes:+Recent+advances+in+knowledge+and+technologies+to+understand+disease+pathogenesis.">Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).</li><li>Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+flexible+system+for+glucose+homeostasis.">Stable and flexible system for glucose homeostasis.</a> Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).</li><li>Cryer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Glucagon+in+the+pathogenesis+of+hypoglycemia+and+hyperglycemia+in+diabetes.">Minireview: Glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes.</a> Endocrinology. 153 (3), 1039-1048 (2012).</li><li>Arrojo e Drigo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+architecture+of+the+islet+of+Langerhans:+a+focused+cross-species+assessment.">New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment.</a> Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).</li><li>Harata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+shRNA+via+lentivirus+in+human+pseudoislets+provides+a+model+to+test+dynamic+regulation+of+insulin+secretion+and+gene+function+in+human+islets.">Delivery of shRNA via lentivirus in human pseudoislets provides a model to test dynamic regulation of insulin secretion and gene function in human islets.</a> Physiological Reports. 6 (20), e13907 (2018).</li><li>Barbu, A. R., Akusjarvi, G., Welsh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+transduction+of+human+pancreatic+islets:+importance+of+adenoviral+genome+for+cell+viability+and+association+with+a+deficient+antiviral+response.">Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response.</a> Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).</li><li>Hughes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+to+improve+pancreatic+islet+transplantation+for+Type+1+diabetes+mellitus.">Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus.</a> Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).</li><li>Jimenez-Moreno, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+High+Efficiency+Intra-Islet+Transduction+Protocol+Using+Lentiviral+Vectors.">A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors.</a> Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).</li><li>Bonora, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+correlates+of+post-prandial+hyperglycaemia+in+a+large+sample+of+patients+with+type+2+diabetes+mellitus.">Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).</li><li>Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. L., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+reassociation+of+dispersed+adult+rat+pancreatic+islet+cells+into+aggregates+with+three-dimensional+architecture+typical+of+native+islets.">Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets.</a> Diabetes. 36 (7), 783-790 (1987).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+pseudoislets+form+efficiently+from+donated+tissue,+compare+favourably+with+native+islets+in+vitro+and+restore+normoglycaemia+in+mice.">Bioengineered human pseudoislets form efficiently from donated tissue, compare favourably with native islets in vitro and restore normoglycaemia in mice.</a> Diabetologia. 61 (9), 2016-2029 (2018).</li><li>Zuellig, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+physiological+properties+of+gravity-enforced+reassembled+rat+and+human+pancreatic+pseudo-islets.">Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).</li><li>Caton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+transduction+of+connexin+cDNAs+shows+level-+and+isoform-specific+alterations+in+insulin+secretion+of+primary+pancreatic+beta-cells.">Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells.</a> Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+beta+Cell+Function.">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li><li>Peiris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+human+diabetes-risk+gene+function+with+genetics+and+physiological+assays.">Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays.</a> Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).</li><li>Schlimgen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+Associated+With+Lentiviral+Vector+Exposures+and+Prevention+Strategies.">Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies.</a> Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+islet+for+improved+performance+by+optimized+reaggregation+in+alginate+gel+beads.">Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).</li><li>Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+re-aggregated+human+pancreatic+islets+for+secondary+drug+screening.">Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening.</a> British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).</li><li>Hilderink, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+aggregation+of+primary+human+pancreatic+islet+cells+leads+to+glucose-responsive+pseudoislets+comparable+to+native+islets.">Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).</li><li>Saunders, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectonucleoside+Triphosphate+Diphosphohydrolase-3+Antibody+Targets+Adult+Human+Pancreatic+beta+Cells+for+In+Vitro+and+In+Vivo+Analysis.">Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis.</a> Cell Metabolism. (18), (2018).</li><li>Reissaus, C. A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reestablishment+of+Glucose+Inhibition+of+Glucagon+Secretion+in+Small+Pseudoislets.">Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets.</a> Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).</li></ol>

Här, ett detaljerat protokoll för att generera mänskliga pseudoöar som är sensorik av lentivirus med hjälp av en 96-väl ultra-låg fästplatta eller en mikrobrunn kultur tallrik presenteras. Pseudoöar har rapporterats Visa morfologi och sekretoriska funktioner som liknar infödda mänskliga öar och kan odlas för långvarig tid in vitro-5,11,18. Till skillnad från infödda mänskliga öar som uppvisar en stor variation...

Förlusten av funktionell beta cellmassa är den centrala patologi för både typ 1 och typ 2 diabetes1. Medan betaceller är producenter av insulin i bukspottskörteln öar, kommunikation mellan betaceller och icke-betaceller spelar en avgörande roll i regleringen av insulinsekretion2. Dessutom bidrar dysreglering av glukagon sekretion till hyperglykemi i diabetes3. Således, det finns ett starkt intresse att modulera genuttryck av celler i bukspottskörteln öar att ta itu med mekanismen bakom utvecklingen av Holmen dysfunktion i diabetes. En mängd olika metoder, inklusive transgena möss, finns tillgängliga för att modulera genuttryck av mus öar. Men, mänskliga och mus öar visar distinkt innervation, cell distribution, förhållandet mellan beta till alfaceller, och svar på sekretagogues4. Därför är direktbedömning av genfunktion i humana öar oerhört viktigt för att förstå patofysiologin hos mänskliga pankreasöar.
Adenoviral vektor är den mest använda viral vektor för att transduce pankreasöar in vitro på grund av den höga verkningsgraden av transduktion i icke-skiljande celler. Adenovirus tränger dock inte in i kärnan av kobbar effektivt, särskilt i humana öar5, och är cytotoxiskt vid höga doser6. Jämförelsevis, lentiviral vektor är mindre cytotoxiska och levererar exogena gener permanent in i kromosomen av post-mitotiska celler, vilket gör det ett allmänt testat fordon för genterapi7. Emellertid, förmågan hos lentivirus att tränga in i kärnan av intakt mänskliga öar är också begränsad, vilket kräver partiell dispersion av enzymatisk matsmältning för att öka transduktionseffektivitet8. Förbehållet med spridningen av intakt mänskliga öar är avbrottet i cell-cell och cell-matris kommunikation, som äventyrar den dynamiska regleringen av insulinsekretion kritisk för upprätthållandet av glukos homeostas i människor9. Det har således varit en utmaning att bedöma gen moduleringens inverkan på den dynamiska regleringen av Holmen-funktionen i en modell av mänskliga öar.
Det har varit känt att spridda ö-celler från mänskliga och gnagare öar självständigt reaggregera till Holmen-liknande strukturer som kallas "pseudoislets". Pseudoislets Visa beta och icke-beta cell distribution liknar inhemska öar10,11. Dessutom, efter långsiktig kultur, inhemska holmar förlorar successivt robust första fasen insulinsekretion5,10,11,12. Ändå visade pseudoöar bättre bevarande av första fasen insulinsekretion som svar på glukos jämfört med inhemska öar efter samma kultur period5. Förutom att ha bättre bevarande av insulinsekretion, storleks-kontrollerad reaggregation av mänskliga ö-celler i låga tillbehör tallrikar11 ger ett fönster av möjlighet att införa lentivirus vektorer innan deras reaggregation i pseudoislets. Flera studier har visat nyttan av pseudoislets kombinerat med lentiviral medierad transduktion. Caton et al.13 rapporterade att införandet av den gröna fluorescerande protein (GFP) uttrycker lentivirus hade liten effekt på insulinsekretion samtidigt uppnå homogena uttryck av GFP i råtta pseudoöar jämfört med icke-infekterad kontroll. De visade också den specifika effekten av olika connexins på insulinsekretion genom att överuttrycka connexins 32, 36, och 43 via lentivirus13. Mänskliga pseudoöar beredd med en kommersiellt tillgänglig 96-väl ultra-låg fästplatta visade att lentiviral-medierad överuttryck av transkriptionsfaktorn SIX3 förbättrar insulinsekretion bedömas genom statisk inkubation14. Nyligen, mänskliga pseudoislets utarbetats med en 96-väl ultra-låg fästplatta användes för att downreglera glukokinas via lentiviral kort hårnål RNA (shRNA) som ett bevis på princip för att visa att glukossänkande insulinsekretion reduceras, medan KCl-stimulerad insulinsekretion bevarades5. Studien visade också att mänskliga pseudoöar liknar inhemska öar i genuttryck och sekretoriska profiler, ytterligare stödja nyttan av mänskliga pseudoöar att dissekera regleringen av Islet funktion5. Även om perifusion inte utfördes, en bioengineered mikrobrunn kultur tallrik som nyligen blev kommersiellt tillgängliga, rapporterades också vara förenligt för lentiviral transduktion och producerade mänskliga pseudoöar som uppvisade utmärkt insulin sekretion in vitro och in vivo efter transplantation11. Kollektivt, mänskliga pseudoholmen formation kombinerat med lentiviral transduktion är en enkel och effektiv metod för att undersöka mänsklig holme patofysiologi, vilket ger ett värdefullt verktyg för att utföra mekanistiska studier i mänskliga öar.
I den aktuella rapporten, ett protokoll för att bilda mänskliga pseudoislets sensorik med lentivirus med två kommersiellt tillgängliga plattformar, en 96-väl ultra-låg fästplatta och en mikrobrunn kultur tallrik presenteras. Både uppnå effektiv modulering av genuttryck och skapa mänskliga pseudoöar som är kompatibla för nedströms bedömningar inklusive statisk inkubation och perifusion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series Type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer, 40 micrometer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11530037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Trizol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marien Feld</td>
			<td>Neubauer-Improved Bright line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>11-350-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube, 1.5 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microwell culture plate</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>34411</td>
			<td>Aggrewell 400, 24 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motor-driven pestle</td>
			<td>GAMUT</td>
			<td>#399X644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-tissue culture treated dish, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 mm</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 5 mL</td>
			<td>DOT Scientific,</td>
			<td>667205B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 8-channel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#613-5253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>667210B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P10</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P200</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P1000</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteolytic and collagenolytic enzyme mixture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6965</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagent reservoir, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversible strainer, 37 micrometer</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>27251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket plate centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-14R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SX4750A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin syringe, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra low attachment microplate, 96 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4515</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates

Olika genetiska verktyg finns tillgängliga för att modulera gener i bukspottskörteln öar av gnagare att dissekera funktion av Holmen gener för diabetesforskning. De uppgifter som erhållits från gnagare är dock ofta inte helt återgivna i eller tillämpliga på mänskliga öar på grund av välkända skillnader i holme struktur och funktion mellan arterna. För närvarande är tekniker som är tillgängliga för att manipulera genuttryck för mänskliga öar mycket begränsade. Införandet av transgenens i intakt öar av adenovirus, plasmid, och oligonukleotides lider ofta av låg verkningsgrad och hög toxicitet. Låg verkningsgrad är särskilt problematiskt i gen nedreglering studier i intakt öar, som kräver hög verkningsgrad. Det har varit känt att enzymatiskt spridda ö-celler reaggregera i kulturen bildar spheroids kallas pseudoislets. Storlekskontroll reaggregation av mänskliga ö-celler skapar pseudoöar som upprätthåller dynamiska första fasen insulinsekretion efter långvarig kultur och ge ett fönster för att effektivt införa lentiviral kort hårnål RNA (shRNA) med låg toxicitet. Här beskrivs ett detaljerat protokoll för skapandet av mänskliga pseudoöar efter lentiviral signaltransduktion med hjälp av två kommersiellt tillgängliga multispot-plattor. Protokollet kan enkelt utföras och möjliggör effektiv nedreglering av gener och bedömning av dynamiken i insulinsekretionen med hjälp av mänskliga ö-celler. Sålunda, mänskliga pseudoöar med lentiviral medierad gen modulering ger en kraftfull och mångsidig modell för att bedöma genfunktion inom mänskliga ö-celler.

Figur 1 illustrerar viktiga steg i tillverkningen av pseudoöar med hjälp av en 96-well ultra-låg fästplatta och en mikrobrunn kultur tallrik. Figur 2A visar sekventiella förändringar i morfologin under bildandet av pseudoöar från 3 x 103 mänskliga ö-celler i en 96-väl ultra-låg fästplatta. Monolayer eller lösa klumpar av celler observerade i dag 1 ändras till fasta aggregat med en slät, rund kant vid da...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates at JoVE.com

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Ett protokoll för att skapa genmodifierade mänskliga pseudoöar från spridda mänskliga öar celler som är sensorik av lentivirus redovisade kort hårnål RNA (shRNA) presenteras. Detta protokoll utnyttjar lättillgängliga enzym-och kultur fartyg, kan utföras enkelt och producerar genetiskt modifierade pseudoöar som lämpar sig för funktionella och morfologiska studier.

Lentiviral medierad gen ljuddämpning i humant Pseudoholmen beredd i låga fästplattor

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Det är svårt att modulera genuttrycket i mänskliga holmar, också större nedgång av de fungerande mänskliga holmar utgör stora utmaningar efter modulering av genuttryck. Genom att kombinera det lentivirus medlat SHR8 transduktion och bildandet av mänskliga lämpliga holmar. Detta protokoll tillåter effektiv nedreglering av en riktad gen samtidigt som holme funktion under långvarig kultur.Till att börja med snurra försiktigt fraktflaskan för att hålla holmar i suspension. Överför fraktmediet som innehåller holmar till ett koniskt centrifugrör på 50 milliliter. Låt röret sitta i ett biologiskt säkerhetsskåp i 15 minuter så att holmar lägger sig till botten av röret.Ta bort fraktmediet försiktigt med hjälp av en kapillärpipett utan att störa holmepelleten. Åter upphäva holme pelleten i CMRL medium med 1%human serum albumin till en koncentration av 400 holme motsvarande per milliliter. Överför holmar till en icke-vävnadskultur behandlad maträtt och odla dem vid 37 grader celsius i en 5%koldioxidinkubator över natten.Efter natten kultur, överföra mänskliga holmar i en 15 milliliter konisk centrifugrör, centrifug vid 250 gånger g i fem minuter i en svängig hink rotor. Och aspirera mediet med en kapillärpipett utan att störa holmepelleten. Tvätta pelleten min lägga 10 milliliter PBS till röret, blanda försiktigt och centrifug på 250 gånger g i fem minuter.Efter centrifugeringen aspirera du PBS utan att störa holmepelleten. Åter upphäva pelleten i 0,5 milliliter av en förvättnad proteolytisk och collagenolytisk enzymblandning. Pipett fem gånger med hjälp av en P1000-pipett för att blanda holmar.Inkubera vid 37 grader varmt i fem minuter. Efter inkubationen, blanda pipetten petting upp och ner försiktigt. Kontrollera om det finns encellig molnighet och antalet flingor eller osmälta holmar.Placera en 40 micron sil i en 35 millimeter petriskål och våt silen genom att lägga till en milliliter CMRL medium med 10%värme inaktiverad fetalt bovin serum och deprimerande med en milliliter spruta kolven. Överför all cellfjädring ovanpå silen. Och samla in passet genom i ett färskt 15 milliliter rör.Tvätta röret som används för holme matsmältningen med 0,5 milliliter färskt CMRL medium för att samla överblivna celler och passera tvätta genom silen. Kombinera passet i ett 15 milliliterrör. Upprepa en gång.För att dissa isär osmälta holmar som finns kvar på silen, tryck silen med en milliliter sprutkolv. Samla in passet genom igen och tvätta silen med färskt vanligt CMRL 1066 medium för att avlägsna alla återstående rötade holmar från silen och skålen. Tillsätt passet till 15 milliliterröret.Registrera cellens totala volym suspension och ta en 10 microliter alikvot av celler för att räkna cellen nummer på en hemocytometer. Efter centrifugering av cellupphängningen i fem minuter vid 200 gånger g, avlägsna mediet utan att pelleten störs. För att producera pseudo-holmar med hjälp av en 96 väl ultra låg fästplatta, först beräkna den totala volymen av de krävs en gånger 10 till den femte celler per milliliter av den enda cellen suspension.Sedan, åter upphäva holme pelleten i CMRL medium med 10%värme inaktiverade fetala nötkreatur serum så att 30 mikroliter av cellen suspension har 3000 celler. Därefter överför du den erforderliga volymen av encellsupphängningen till ett färskt 15 milliliterrör. Vid 250 transduktionsenheter per cell av ett lentivirus som innehåller SH-RNA som riktar sig mot en gen av intresse eller en kontroll.För att blanda cellen suspension med viruset, pipetteras försiktigt fem gånger med en P1000 pipetter. Överför sedan de blandade cellerna till en 50 milliliter steril reagensbehållare om du använder en åtta kanals pipett. Med en åtta kanalspipett eller en P200-pipett, dispensera 30 mikroliter per brunn av cellupphängningen blandat med lentivirus i varje brunn.Därefter centrifug 96 väl plattan i en svängig hink plattan centrifug vid 270 gånger g vid rumstemperatur i sju minuter. Kultur vid 37 grader celsius i en befuktad 5%koldioxidinkubator över natten. Efter inkubationen, avlägsna 96 brunnsplattan från inkubatorn och placera den i det biologiska säkerhetsskåpet.Pipett 100 mikroliter per holme på 10%hög FBSCMRL i en brunn för att förhindra torkning av holmar och fortsätta att odla i en vecka. Pipett 100 mikroliter per brunn av CMRL medium med 10%värme inaktiverade fetala nötkreatur serum från reservoaren till pseudo-holmar och pipett upp och ner två till tre gånger försiktigt i brunnen för att lyfta holmar upp. Sedan aspirera mediet i brunnen som innehåller en pseudo-holme och mata ut i en 10 centimeter petriskål.Kontrollera plattan under ett ljusmikroskop för att säkerställa ett fullständigt avlägsnande av alla pseudo-holmar och gå vidare till nedströms experiment. För att producera pseudo-holmar med hjälp av en 24 väl mikro väl kultur platta, först lägga till 500 mikroliter per brunn av en anti-adherence sköljning lösning. Centrifugera vid 1300 gånger g i fem minuter i en svängande hinkplatta centrifug.Observera sedan plattan under ett mikroskop för att säkerställa att luftbubblor tas bort från mikro-brunnar. I ett biologiskt säkerhetsskåp aspirerar du sköljningslösningen mot klendning från brunnarna. Skölj varje brunn med två milliliter varm vanlig CMRL 1066 medium en gång.Därefter aspirera vanligt CMRL 1066 medium och lägga till 0,5 milliliter per brunn av varm CMRL med 10%värme inaktiverade fetala nötkreatur serum till varje väl planerad för användning. Bestäm det totala antalet celler som behövs för varje brunn. Re-suspend de enstaka cellerna i 0,8 milliliter CMRL medium med 10%värme inaktiverade fetala nötkreatur serum i en steril 1,5 milliliter rör.För att skapa en brunn av pseudo-holme transduced av ett lentivirus, tillsätt 125 transduktion enheter per cell till encell suspension hålla volymen av virus under 0,2 milliliter. Inkubera cell- och virusblandningen vid 37 grader celsius med tillfällig skonsam blandning i en timme för att tillåta kontakt med celler med virus före kondensation av celler. Efter en timme, justera den totala volymen av holme cellen och virus blandningen till en milliliter genom att lägga CMRL medium med 10%värme inaktiverade fetala nötkreatur serum.Om celler bildar klumpar efter en timmes inkubation skingras i en enda cell suspension av mild och snabb pipettering två till tre gånger. Överför cellupphängningen till en brunn av den 24 brunnsmikro-brunnskulturplattan. Omedelbart efter pipettering, centrifug vid 100 gånger g vid rumstemperatur i tre minuter för att fånga celler i alla mikro-brunnar.Observera under mikroskop för att kontrollera att cellerna är jämnt fördelade i alla mikro-brunnar. Det är viktigt att centrifugera mikro-väl plattan omedelbart efter att ha lagt till väl blanda holme enda cell suspension i brunnarna. Sekventiella förändringar i morfologi av pseudo-holmar från 3000 mänskliga holme celler som skapats i en 96 väl ultra låg fästplatta visade monolayer eller lösa klumpar av celler förvandlas till fasta aggregat med en smidig runda gränsen i en vecka.I en mikro-brunnskulturspall är däremot bildandet av cell- och pseudo-holmar från endast 500 holmeceller vanligtvis synlig inom fyra dagar. Den enhetliga storleken på pseudo-holmar minskar variationen inom en testgrupp och tillåter statisk inkubation med så lite som fem pseudo-holmar per mätning. Perry Fusion Assay för insulin svar visade mänskliga pseudo-holmar upprätthålls robust första fasen insulin sekretion som svar på glukos efter sju dagar av kultur.Införandet av lentivirus som riktar sig mot humant fetthaltigt triglyceridlipas eller perilipin fem gener i en enda cell suspension säkerställer en effektiv och homogen transduktion av holme celler och uppnår mycket effektiv nedreglering av gener. Det är viktigt att komma ihåg att den tid som krävs för att sprida mänskliga holme i enstaka celler påverkas av många faktorer som:storlek, distribution, och givaren karakteristiska. Så, Det är viktigt att ägna stor uppmärksamhet åt försvinnandet av mänskliga holmar under matsmältningen.I hela protokollet är det viktigt att hantera encellsupphängning försiktigt för att undvika cellförlust. De mänskliga pseudo-holmar som skapas kan användas för många tillämpningar för att bestämma effekten av genmodulering som:Western Blot, histologiska studie och mätningarna av syreförbrukningshastigheter. Detta protokoll tillåter bedöma den låga av riktade genen i regleringen av holme hälsa och funktionen i mänskliga holmar genom att använda vanliga lab ware och enkla tekniker.Användningen av mänskliga holmar kan kräva ett förhandsgodkännande från en lokal granskningsnämnd. Konsultera lokal granskningsnämnd innan studien inleds. Lentivirus klassificeras som biosäkerhet nivå två.Kontakta biosäkerhetskommitté innan användningen av lentiviruset påbörjas.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA Transfektion och EMSA Analyser av nyligen isolerade mänskliga villös cytotrofoblaster

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallell Mätning av dygnsrytm klocka genuttryck och hormon i mänskliga primära cellkulturer

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Uppfödning och dubbelsträngade RNA-medierad Gene Knockdown i Hide Beetle,<em&gt; Rävänger</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Urval-beroende och oberoende generering av CRISPR / Cas9-medierade genknockouts i däggdjursceller

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokoll för låg-överflöd embryonala prover

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En standardmetod att undersöka Hotellets mutagenicitet som en funktion av punktmutation reparation katalyseras av CRISPR/Cas9 och SsODN i mänskliga celler

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-medierad riktade Integration In Vivo som använder en homologi-medierad slutet att gå-baserad strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Ett protokoll för produktionen av integras-brist Lentiviral vektorer för CRISPR/Cas9-medierad gen Knockout i delande celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-medierad omorganiseringen av kromatin Loop struktur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentiviral medieras produktion av transgena möss: en enkel och mycket effektiv metod för direkta studier av grundarna

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...