Name: lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates
Uploaded: 2019-05-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates at JoVE.com

Bu çalışma mali sağlık Ulusal Enstitüleri tarafından Y.I. (R01-DK090490) ve Amerikan Diyabet Derneği Y.I. (1-17-ıBS-132) için desteklenmektedir. Ş ve Y.I. Eagles diyabet araştırma merkezi 'nin kardeşçe düzeni tarafından desteklenmektedir. A.B., Ulusal Sağlık Enstitüleri eğitim hibe (T32NS45549) tarafından desteklenmektedir. Yazarlar umut şehri (2uc4dk098085) niddk destekli entegre Islet dağıtım programı (IIDP) tarafından sağlanan insan pankreatik adacıklar kullanılmıştır.

Çalışmalar başlamadan önce, bir insan konuları araştırma belirlenmesi, çalışma insan konuları araştırma kriterleri karşılamadı tespit Iowa kurumsal Inceleme kurulu, Üniversitesi tarafından yapılmıştır. İslet ve planlanmış çalışmanın kaynağının önceden onay gerektirip belirlenmesini belirlemek için çalışmanın başlangıcından önce yerel İnceleme tahtasına danışın.
Not: Genellikle, 3.000 hücre/pseudoislets bir 96-iyi Ultra-düşük ...

<ol>
	<li>Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta+cell+mass+and+function+in+diabetes:+Recent+advances+in+knowledge+and+technologies+to+understand+disease+pathogenesis.">Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).</li><li>Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+and+flexible+system+for+glucose+homeostasis.">Stable and flexible system for glucose homeostasis.</a> Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).</li><li>Cryer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Glucagon+in+the+pathogenesis+of+hypoglycemia+and+hyperglycemia+in+diabetes.">Minireview: Glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes.</a> Endocrinology. 153 (3), 1039-1048 (2012).</li><li>Arrojo e Drigo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+architecture+of+the+islet+of+Langerhans:+a+focused+cross-species+assessment.">New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment.</a> Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).</li><li>Harata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+shRNA+via+lentivirus+in+human+pseudoislets+provides+a+model+to+test+dynamic+regulation+of+insulin+secretion+and+gene+function+in+human+islets.">Delivery of shRNA via lentivirus in human pseudoislets provides a model to test dynamic regulation of insulin secretion and gene function in human islets.</a> Physiological Reports. 6 (20), e13907 (2018).</li><li>Barbu, A. R., Akusjarvi, G., Welsh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+transduction+of+human+pancreatic+islets:+importance+of+adenoviral+genome+for+cell+viability+and+association+with+a+deficient+antiviral+response.">Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response.</a> Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).</li><li>Hughes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+to+improve+pancreatic+islet+transplantation+for+Type+1+diabetes+mellitus.">Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus.</a> Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).</li><li>Jimenez-Moreno, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+High+Efficiency+Intra-Islet+Transduction+Protocol+Using+Lentiviral+Vectors.">A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors.</a> Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).</li><li>Bonora, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+correlates+of+post-prandial+hyperglycaemia+in+a+large+sample+of+patients+with+type+2+diabetes+mellitus.">Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).</li><li>Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. L., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+reassociation+of+dispersed+adult+rat+pancreatic+islet+cells+into+aggregates+with+three-dimensional+architecture+typical+of+native+islets.">Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets.</a> Diabetes. 36 (7), 783-790 (1987).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+pseudoislets+form+efficiently+from+donated+tissue,+compare+favourably+with+native+islets+in+vitro+and+restore+normoglycaemia+in+mice.">Bioengineered human pseudoislets form efficiently from donated tissue, compare favourably with native islets in vitro and restore normoglycaemia in mice.</a> Diabetologia. 61 (9), 2016-2029 (2018).</li><li>Zuellig, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+physiological+properties+of+gravity-enforced+reassembled+rat+and+human+pancreatic+pseudo-islets.">Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).</li><li>Caton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+transduction+of+connexin+cDNAs+shows+level-+and+isoform-specific+alterations+in+insulin+secretion+of+primary+pancreatic+beta-cells.">Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells.</a> Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+Pancreatic+Gene+Regulation+Reveals+Mechanisms+Governing+Human+beta+Cell+Function.">Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).</li><li>Peiris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+human+diabetes-risk+gene+function+with+genetics+and+physiological+assays.">Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays.</a> Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).</li><li>Schlimgen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+Associated+With+Lentiviral+Vector+Exposures+and+Prevention+Strategies.">Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies.</a> Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+islet+for+improved+performance+by+optimized+reaggregation+in+alginate+gel+beads.">Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).</li><li>Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+re-aggregated+human+pancreatic+islets+for+secondary+drug+screening.">Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening.</a> British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).</li><li>Hilderink, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+aggregation+of+primary+human+pancreatic+islet+cells+leads+to+glucose-responsive+pseudoislets+comparable+to+native+islets.">Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).</li><li>Saunders, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectonucleoside+Triphosphate+Diphosphohydrolase-3+Antibody+Targets+Adult+Human+Pancreatic+beta+Cells+for+In+Vitro+and+In+Vivo+Analysis.">Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis.</a> Cell Metabolism. (18), (2018).</li><li>Reissaus, C. A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reestablishment+of+Glucose+Inhibition+of+Glucagon+Secretion+in+Small+Pseudoislets.">Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets.</a> Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).</li></ol>

Burada, Lentivirus tarafından bir 96-Well Ultra-düşük ataşman plakası veya bir mikrokuyu kültür plakası kullanılarak dönüştürücü olan insan pseudoislets oluşturmak için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Pseudoislets Morfoloji ve salgı fonksiyonları yerli insan izletlerine benzer göstermek için bildirilmiştir ve uzun süre içinde vitro5,11,18kültürsüz olabilir. Boyutu geniş bir varyasyon göstere...

Fonksiyonel beta hücre kütlesi kaybı her iki tip 1 ve tip 2 diyabet1için merkezi patolojidir. Beta hücreleri pankreas izletinde insülin üreticileri olmakla beraber, Beta hücreleri ve beta olmayan hücreler arasındaki iletişim, insülin salgılanmasını2' nin düzenlenmesi açısından kritik bir rol oynamaktadır. Buna ek olarak, glukagon salgılanması disregülasyon diyabette hiperglisemi katkıda3. Böylece, diyabette Islet disfonksiyon gelişiminin arkasındaki mekanizması ele pankreas izletler içinde hücrelerin gen ifadesi modüle güçlü bir ilgi vardır. Transgenik fareler de dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar fare izletlerinin Gen ifadesinin modülasyonu için kullanılabilir. Ancak, insan ve fare izletleri farklı innervasyon göstermek, hücre dağılımı, Alfa hücreleri Beta oranı, ve secretagogues yanıt4. Bu nedenle, insan izletlerinde gen fonksiyonunun doğrudan değerlendirilmesi, insan pankreatik izletinin patofizyolojisini anlamak için son derece önemlidir.
Adenoviral vektör en yaygın olarak kullanılan viral vektördir pankreas izletler in vitro transduce için yüksek verimlilik nedeniyle olmayan bölünmüş hücrelerde. Ancak, adenovirüs adacıklar çekirdeğine etkili bir şekilde nüfuz etmez, özellikle insan izletinde5, ve yüksek dozlarda sitotoksisdir6. Göreceli olarak, lentiviral vektör daha az sitotoksisdir ve post-mitotik hücrelerin kromozom içine kalıcı olarak eksojen genler sunar, gen terapisi için yaygın olarak test edilmiş bir araç haline7. Ancak, Lentivirus yeteneği bozulmamış insan izletlerin çekirdeğine nüfuz de sınırlıdır, böylece transksiyon verimliliği artırmak için enzimatik sindirim tarafından kısmi dağılım gerektiren8. Bozulmamış insan izletleri dağılımı ile uyarı insan9glikoz homeostazı bakımı için kritik insülin salgılanması dinamik düzenlenmesi ödün hücre hücresi ve hücre matris iletişim, kesintiye. Bu nedenle, gen modülasyonunun bir insan izletinin modelindeki Islet işlevinin dinamik olarak düzenlenmesi üzerine etkisini değerlendirmek zor olmuştur.
Bu, insan ve kemirgen izletler, "pseudoislets" adı verilen Islet benzeri yapıları içine otonoid reaggregate dağınık Islet hücreleri bilinmektedir. Pseudoislets Beta ve non-beta hücre dağıtımı yerel adacıklar10,11benzer gösterir. Ayrıca, uzun dönem kültürden sonra, yerli adacıklar aşamalı olarak güçlü ilk faz insülin salgılanmasını kaybedersiniz5,10,11,12. Ancak, pseudoislets ilk faz insülin salgılanmasını glikoz yanıt olarak aynı kültür dönemi sonra yerli adaylar ile karşılaştırıldığında daha iyi korunması göstermiştir5. İnsülin salgılanmasını daha iyi korumasına ek olarak, düşük ataşman plakaları11 insan Islet hücrelerinin boyutu kontrollü reaggregation içine kendi reaggregation önce Lentivirus vektörler tanıtmak için fırsat bir pencere sağlar pseudoislets. Çeşitli çalışmalar lentiviral aracılı dönüştürücü ile birlikte pseudoislets yardımcı göstermiştir. Caton ve al.13 bu yeşil floresan protein (Gfp) Lentivirus ifade giriş insülin salgılanması üzerinde az etkisi olduğunu bildirdi, non-enfekte kontrol ile karşılaştırıldığında sıçan pseudoislets Gfp homojen ifade elde ederken. Onlar da connexins 32, 36 ve 43 Lentivirus13üzerinden Over, tarafından insülin salgılanması üzerinde farklı connexins spesifik etkisi göstermiştir. Ticari olarak kullanılabilen 96-Well Ultra düşük ataşman plakası ile hazırlanan insan pseudoislets, transkripsiyon faktörünün lentiviral aracılı ekspresyonu SIX3 statik inkübasyon ile değerlendirilen insülin salgılanmasını geliştirir14. Son zamanlarda, bir 96 ile hazırlanan insan pseudoislets-iyi Ultra-düşük ataşman plaka glukokinaz lentiviral kısa saç iğnesi RNA (shRNA) ile glikoz uyarılmış insülin salgılanması azaltılır göstermek için bir prensip kanıtı olarak, aşağı düzenlemek için kullanıldı KCl-stimüle edilmiş insülin salgılanması5. Çalışma aynı zamanda insan pseudoislets gen ifade ve salgılayan profillerde yerli izletlere benzer olduğunu göstermiştir, daha fazla Islet fonksiyon5düzenlenmesi incelemek için insan pseudoislets yardımcı destek. Perifüzyon yapılmadı olmasına rağmen, son zamanlarda ticari olarak mevcut hale gelen bir Biyomühendislik mikrowell kültür plakası, aynı zamanda lentiviral dönüştürücü için uyumlu olduğu bildirildi ve mükemmel insülin sergilenen insan pseudoislets üretilen transplantasyon sonrasında in vitro ve in vivo salgılanması11. Lentiviral dönüştürücü ile birlikte insan pseudoislet oluşumu, insan Islet patofizyolojisini araştırmak için basit ve verimli bir yaklaşımdır ve insanlar arasında mekanik çalışmalar yapmak için değerli bir araç sağlar.
Mevcut raporda, ticari olarak kullanılabilen iki platform kullanarak Lentivirus ile transdüden insan pseudoislets oluşturmak için bir protokol, bir 96-Well Ultra-düşük ataşman plakası ve bir mikrowell kültür plakası sunulmaktadır. Her ikisi de Gen ifadesinin verimli modülasyonu elde etmek ve statik inkübasyon ve perifüzyon dahil olmak üzere aşağı değerlendirme için uyumlu insan pseudoislets oluşturmak.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series Type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer, 40 micrometer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11530037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Trizol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marien Feld</td>
			<td>Neubauer-Improved Bright line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>11-350-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube, 1.5 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microwell culture plate</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>34411</td>
			<td>Aggrewell 400, 24 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motor-driven pestle</td>
			<td>GAMUT</td>
			<td>#399X644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-tissue culture treated dish, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 mm</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 5 mL</td>
			<td>DOT Scientific,</td>
			<td>667205B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 8-channel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#613-5253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>667210B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P10</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P200</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette, P1000</td>
			<td>Denville</td>
			<td>UEZ-P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteolytic and collagenolytic enzyme mixture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6965</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagent reservoir, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversible strainer, 37 micrometer</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>27251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket plate centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-14R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SX4750A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin syringe, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra low attachment microplate, 96 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4515</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated gene silencing in human pseudoislet prepared in low attachment plates

Çeşitli genetik araçlar diyabetik araştırma için Islet genler fonksiyonunu incelemek için kemirgenler pankreatik adacıklar genleri modüle kullanılabilir. Ancak, kemirgen izletlerden elde edilen veriler genellikle Islet yapısında ve türler arasındaki işlevlerde bilinen farklılıklar nedeniyle insan izletine tam olarak çoğaltılamaz veya uygulanabilir değildir. Şu anda, insan izletlerinin gen ifadesini manipüle etmek için kullanılabilen teknikler çok sınırlıdır. Adenovirüs, plazmid ve oligonükleotidler tarafından bozulmamış adacıklar içine transgeni giriş genellikle düşük verimlilik ve yüksek toksisite muzdarip. Düşük verimlilik, yüksek verimlilik gerektiren bozulmamış izletlerinde gen downdüzenleme çalışmalarında özellikle problemlidir. Enzitatik olarak dağınık Islet hücrelerinin kültür oluşturan kürlerin pseudoislets olarak adlandırdığı bilinmektedir. İnsan Islet hücrelerinin boyutu kontrollü reaggregation uzun süreli kültürden sonra dinamik ilk faz insülin salgılanmasını korumak ve düşük toksisite ile lentiviral kısa saç iğnesi RNA (shrna) verimli bir şekilde tanıtmak için bir pencere sağlamak pseudoislets oluşturur. Burada, ticari olarak mevcut iki multiwell plakayı kullanarak lentiviral dönüştürücüden sonra insan pseudoislets oluşturulması için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. Protokol kolayca gerçekleştirilebilir ve genlerin etkin şekilde düşürülmesine ve insan Islet hücrelerini kullanarak insülin salgılanması dinamizmi değerlendirmesine olanak tanır. Böylece, lentiviral aracılı gen modülasyonu ile insan pseudoislets insan Islet hücreleri içinde gen fonksiyonunu değerlendirmek için güçlü ve çok yönlü bir model sağlar.

Şekil 1 , 96-iyi Ultra düşük ataşman plakası ve mikrokuyu kültür plakası kullanılarak pseudoislets üretiminde önemli adımları göstermektedir. Şekil 2a , 96-iyi Ultra düşük ataşman plakasında 3 x 103 insan Islet hücrelerinden pseudoislets oluşumu sırasında morfolojide sıralı değişiklikler gösterir. 1. gün içinde gözlenen hücrelerin monolayer veya gevşek kümeleri, 5 ile 7 arasında pü...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates at JoVE.com

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Kısa saç iğnesi RNA (shrna) taşıyan Lentivirus tarafından dönüştürücü olan dağınık insan Islet hücrelerinden gen modifiye insan pseudoislets oluşturmak için bir protokol sunulmuştur. Bu protokol kolay kullanılabilir enzim ve kültür gemileri kullanır, kolayca yapılabilir ve fonksiyonel ve morfolojik çalışmalar için uygun genetiği değiştirilmiş insan pseudoislets üretir.

Düşük ataşman plakalarına hazırlanmış ınsan Pseudoislet 'te lentiviral aracılı gen susturulması

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

İnsan adacıklarında gen ekspresyonunu modüle etmek zordur, ayrıca işleyen insan adacıklarının daha fazla azalması gen ekspresyonunun modülasyonundan sonra büyük zorluklar alacaktır. Lentivirus aracılı SHR8 transdüksiyon ve insan uygun adacıkların oluşumu birleştirerek. Bu protokol, uzun süreli kültür sırasında adacık fonksiyonunu korurken hedeflenen genin etkin bir şekilde küçültünmesine olanak sağlar.Başlamak için, yavaşça süspansiyon adacıkları tutmak için nakliye şişesi girdap. Adacıkiçeren nakliye aracını 50 mililitrelik konik santrifüj tüpe aktarın. Adacıklar tüpün dibine yerleşmek için tüp 15 dakika boyunca biyolojik bir güvenlik kabininde oturalım.Adacık peletini rahatsız etmeden kılcal pipet kullanarak nakliye ortamını hafifçe çıkarın. CMRL ortadaki adacık peletini %1 insan serum albumini ile mililitre başına 400 adacık eşdeğeri konsantrasyonuna yeniden askıya alın. Adacıkları bir gecede %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede tedavi edilen bir doku dışı kültüre aktarın ve onları 37 derecede kültüre aktarın.Bir gecede kültür sonra, bir 15 mililitrekonik santrifüj tüp içine insan adacıkları transfer, santrifüj 250 kez g beş dakika sallanan kova rotor. Ve adacık pelet rahatsız etmeden bir kılcal pipet ile orta aspire. Tüpe 10 mililitre PBS ekleyerek peleti yıkayın, yavaşça karıştırın ve 250 kez g beş dakika santrifüj.Santrifüjden sonra, adacık peletini rahatsız etmeden PBS'yi aspire edin. Önceden ısıtılmış proteolitik ve kolajnolitik enzim karışımının 0,5 mililitrelik kısmını yeniden askıya alın. Pipet adacıkları karıştırmak için bir P1000 pipet kullanarak beş kez.37 derecede 5 dakika kuluçkaya yat. Kuluçkadan sonra pipetleri yavaşça yukarı ve aşağı karıştırın. Tek hücrebulanıklığı ve pul veya sindirilmemiş adacıkların sayısını kontrol edin.35 milimetrelik petri kabına 40 mikronluk bir süzgeç yerleştirin ve %10 ısı inaktive fetal sığır serumu ile bir mililitre CMRL orta ekleyerek süzgeçi ıslayın ve bir mililitreşöyiş şırınga pistonlu depresif. Tüm hücre süspansiyonuna süzgeç üstüne aktarın. Ve taze bir 15 mililitretüp içinde geçiş toplamak.Adacık sindirimi için kullanılan tüpü, kalan hücreleri toplamak ve yıkamayı süzgeçten geçirmek için 0,5 mililitre taze CMRL ortasıyla yıkayın. 15 mililitrelik bir tüp içinde geçiş birleştirin. Bir kez tekrarlayın.Süzgeçte kalan sindirilmemiş adacıkları ayrıştırmak için süzgeçe bir mililitrelik şırınga pistonu ile basın. Geçişi tekrar toplayın ve süzgeçten ve çanaktan kalan tüm sindirilmiş adacıkları çıkarmak için süzgecin taze düz CMRL 1066 ortamıyla yıkayın. 15 mililitrelik tüp için geçiş ekleyin.Hücre süspansiyonunun toplam hacmini kaydedin ve hemositometredeki hücre sayısını saymak için 10 mikrolitrelik bir hücre aliquot'u alın. Hücre süspansiyonuna 200 g'de beş dakika santrifüj ettikten sonra, peleti bozmadan ortamı çıkarın. 96 iyi ultra düşük ek plaka kullanarak sözde adacıklar üretmek için, ilk tek hücre süspansiyon mililitre başına beşinci hücrelere gerekli bir kez 10 toplam hacmini hesaplar.Daha sonra CMRL ortamındaki adacık peletini %10 ısı inaktive fetal sığır serumu ile yeniden askıya alın, böylece hücre süspansiyonunun 30 mikrolitresi 3000 hücreye sahiptir. Daha sonra, tek hücreli süspansiyonun gerekli hacmini 15 mililitrelik taze bir tüpe aktarın. Sh-RNA içeren bir lentivirüsün hücre başına 250 transdüksiyon ünitesinde ilgi çeken bir geni veya kontrolü hedef alıyor.Hücre süspansiyonu ile virüs karıştırılması için, pipet hafifçe bir P1000 pipet ile beş kez. Daha sonra karışık hücreleri 8 kanallı pipet kullanıyorsanız 50 mililitrelik steril reaktif haznesine aktarın. Sekiz kanallı pipet veya P200 pipet ile, her kuyuya lentivirus ile karıştırılmış hücre süspansiyonunun kuyubaşına 30 mikrolitre dağıtın.Sonra, 7 dakika boyunca oda sıcaklığında 270 kez g bir sallanan kova plaka santrifüj 96 iyi plaka santrifüj. Bir gecede nemlendirilmiş %5 karbondioksit inkübatöründe 37 derecede kültür. Kuluçkadan sonra, 96 kuyu plakasını kuvözden çıkarın ve biyolojik güvenlik kabinine yerleştirin.Pipet 100 mikrolitre adacık başına 100 mikrolitre% 10 yüksek FBSCMRL bir kuyuiçine adacıkların kurumasını önlemek ve bir hafta boyunca kültür devam. Pipet 100 mikrolitre CMRL orta kuyubaşına% 10 ısı rezervuar gelen fetal sığır serumu ile sözde adacıklar ve pipet yukarı ve aşağı iki veya üç kat yavaşça kuyuda adacıkları kaldırmak için. Daha sonra, bir sözde adacık içeren kuyuda orta aspire ve 10 santimetre petri kabına fırlatmak.Tüm sözde adacıkların tamamen kaldırılmasını sağlamak için plakayı ışık mikroskobu altında kontrol edin ve alt akış deneylerine devam edin. 24 kuyu mikro kuyu kültür plakası kullanarak sözde adacıklar üretmek için, öncelikle bir anti-yapışma durulama çözeltisi kuyu başına 500 mikrolitre ekleyin. Santrifüj 1300 kez g beş dakika bir sallanan kova plaka santrifüj.Daha sonra, hava kabarcıklarının mikro-kuyulardan çıkarıldığından emin olmak için plakayı mikroskop altında gözlemleyin. Biyolojik bir güvenlik kabininde, kuyulardan yapışma önleyici durulama çözeltisini aspire edin. Her birini iki mililitre ılık düz CMRL 1066 orta ile bir kez iyice durula.Daha sonra, düz CMRL 1066 orta aspire ve her iyi kullanım için planlanan her% 10 ısı inaktive fetal sığır serumu ile sıcak CMRL kuyu başına 0,5 mililitre ekleyin. Her kuyu için gereken toplam hücre sayısını belirleyin. 0.8 mililitre CMRL ortadaki tek hücreleri steril 1,5 mililitrelik bir tüpte %10 ısı inaktive fetal sığır serumu ile yeniden askıya alın.Bir lentivirüs tarafından transe kantinde sahte adacık bir kuyu oluşturmak için, 0.2 mililitre altında virüs hacmini tutarak tek hücre süspansiyon hücre başına 125 transdüksiyon birimleri ekleyin. Hücrelerin yoğuşma önce virüs ile hücrelerin temas sağlamak için bir saat boyunca ara sıra nazik karıştırma ile 37 santigrat derece hücre ve virüs karışımı kuluçka. Bir saat sonra, %10 ısı inaktive fetal sığır serumu ile CMRL orta ekleyerek adacık hücresi ve virüs karışımının toplam hacmini bir mililitreye ayarlayın.Eğer hücreler bir saatlik kuluçkadan sonra kümeler oluşursa, nazik ve hızlı bir şekilde 2-3 kez borulama ile tek bir hücre süspansiyonuna dağılırlar. Hücre süspansiyonuna 24 kuyudaki mikro-kuyu kültür plakasının bir kuyusu aktarın. Pipetlemenin hemen ardından, hücreleri tüm mikro kuyulara yakalamak için oda sıcaklığında 100 kez g.'de üç dakika santrifüj yapın.Hücrelerin tüm mikro kuyularda eşit olarak dağıtıldığını doğrulamak için mikroskop altında gözlemleyin. Kuyuyu kuyuya tek hücreli süspansiyonu kuyuya ekledikten hemen sonra mikro kuyu plakasını santrifüj etmek çok önemlidir. 96 iyi ultra düşük eki plaka oluşturulan 3000 insan adacık hücrelerinden pseudo-adacıkların morfolojisi sıralı değişiklikler tek katmanlı veya hücrelerin gevşek kümeleri bir hafta içinde pürüzsüz bir yuvarlak sınır ile katı agregalar dönüştü gösterdi.Buna karşılık, bir mikro-iyi kültür plaka, hücre ve pseudo-adacıklar sadece 500 adacık hücrelerinden oluşumu genellikle dört gün içinde görülebilir. Sözde adacıkların tek düze boyutu, bir test grubu içindeki değişimi azaltır ve ölçüm başına beş adet sahte adacık kullanarak statik kuluçkaya izin verir. Perry Fusion Assay insülin yanıtı için insan sözde adacıklar kültür yedi gün sonra glikoz yanıt olarak sağlam ilk faz insülin salgısını muhafaza gösterdi.İnsan yağtrigliserid lipaz veya perilipin beş geni tek hücreli süspansiyona hedefleyen lentivirüsün tek hücreli süspansiyona girmesi, adacık hücrelerinin verimli ve homojen transdüksiyonuna izin verir ve genlerin yüksek verimli bir şekilde aşağılanmasına neden olur. İnsan adacıklarını tek hücrelere dağıtmak için gereken sürenin boyut, dağılım ve donör karakteristiği gibi birçok faktörden etkilendiğini unutmamak gerekir. Bu nedenle, sindirim sırasında insan adacıklarının kaybolmasına çok dikkat etmek önemlidir.Protokol boyunca hücre kaybını önlemek için tek hücreli süspansiyonu nazikçe işlemek önemlidir. Oluşturulan insan sözde adacıkları gibi gen modülasyonu etkisini belirlemek için birçok uygulama için kullanılabilir: Batı Leke, histolojik çalışma ve oksijen tüketim oranlarının ölçümleri. Bu protokol, ortak laboratuvar gereçleri ve basit teknikler kullanarak adacık sağlığının düzenlenmesinde hedeflenen genin düşükünün ve insan adacıklarının işlevinin değerlendirilmesini sağlar.İnsan adacıklarının kullanımı için yerel bir inceleme kurulunun onayı gerekebilir. Lütfen çalışmanın başlamasından önce yerel inceleme kuruluna danışın. Lentivirus biyogüvenlik seviyesi 2 olarak sınıflandırılır.Lentivirüsün kullanımına başlamadan önce biyogüvenlik komitesine başvurun.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Taze izole edilmiş insan Villöz sitotrofoblastlar ilgili siRNA transfeksiyonu ve EMSA analizi

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

İnsan Primer Hücre Kültürleri içinde Sirkadyen Saat Gen İfade ve Hormon salgısını Paralel Ölçümü

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen Integration CRISPR/Cas9-aracılı Vivo içinde

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Integrase-eksik Lentiviral vektörler üretimi için CRISPR/Cas9-aracılı Gene hücre bölünmesi içinde nakavt için bir iletişim kuralı

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Kromatin döngü yapısı yeniden yapılanma CRISPR-aracılı

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentiviral aracılı transgenik fareler üretimi: doğrudan eğitim kurucuları basit ve son derece etkili bir yöntem

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...