Name: isolation, culture, characterization, and differentiation of human muscle progenitor cells from the skeletal muscle biopsy procedure
Uploaded: 2019-08-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure at JoVE.com

يشكر المؤلفون جامعة كورنيل، مرفق التصوير مركز موارد التكنولوجيا الحيوية لمساعدتهم في فرز الخلايا المنشطة الفلورية. كما نشكر مولي هيلر على مساعدتها في توظيف المشاركين وإريكا بندر لإجراء الخزعات العضلية الهيكلية. وأخيرا، نشكر المشاركين على وقتهم ومشاركتهم في الدراسة. وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للشيخوخة التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب رقم الجائزة R01AG058630 (إلى B.D.C. وA.E.T.)، من قبل مؤسسة غلين للبحوث الطبية ومنحة أبحاث الاتحاد الأمريكي للشيخوخة لأعضاء هيئة التدريس المبتدئين (إلى B) . العاصمة)، ومجلس الرئيس للمرأة كورنيل (إلى A.E.T.).

وقد وافق مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة كورنيل على هذا البروتوكول. وتم فحص جميع المشاركين للاطلاع على الظروف الصحية الأساسية وأعطوا الموافقة المستنيرة.
1. الحصول على أنسجة العضلات البشرية عن طريق خزعة العضلات الهيكلية
<ol><li>تحديد العضلات الجانبية الشاسعة عن طريق الجس، وا?...

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>D'Souza, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+satellite+cell+number+and+function+in+humans+and+mice+with+type+1+diabetes+is+the+result+of+altered+notch+signaling.">Decreased satellite cell number and function in humans and mice with type 1 diabetes is the result of altered notch signaling.</a> Diabetes. 65 (10), 3053-3061 (2016).</li><li>Scheele, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+derived+from+Obese+humans+with+type+2+diabetes+and+differentiated+into+Myocytes+in+vitro+exhibit+abnormal+response+to+IL-6.">Satellite cells derived from Obese humans with type 2 diabetes and differentiated into Myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6.</a> PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).</li><li>Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+capacity+of+human+muscle+progenitor+cells+differs+by+age,+sex,+and+metabolic+fuel+preference.">Expansion capacity of human muscle progenitor cells differs by age, sex, and metabolic fuel preference.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 315 (5), C643-C652 (2018).</li><li>Charville, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+and+in+vivo+self-renewal+of+human+muscle+stem+cells.">Ex vivo expansion and in vivo self-renewal of human muscle stem cells.</a> Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).</li><li>Alexander, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD82+Is+a+Marker+for+Prospective+Isolation+of+Human+Muscle+Satellite+Cells+and+Is+Linked+to+Muscular+Dystrophies.">CD82 Is a Marker for Prospective Isolation of Human Muscle Satellite Cells and Is Linked to Muscular Dystrophies.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 800-807 (2016).</li><li>Thalacker-Mercer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cluster+analysis+reveals+differential+transcript+profiles+associated+with+resistance+training-induced+human+skeletal+muscle+hypertrophy.">Cluster analysis reveals differential transcript profiles associated with resistance training-induced human skeletal muscle hypertrophy.</a> Physiological Genomics. 45 (12), 499-507 (2013).</li><li>Garcia, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Yield+Purification,+Preservation,+and+Serial+Transplantation+of+Human+Satellite+Cells.">High-Yield Purification, Preservation, and Serial Transplantation of Human Satellite Cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 1160-1174 (2018).</li><li>Yokoyama, W. M., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+thawing+of+cells.">Cryopreservation and thawing of cells.</a> Current Protocols in Immunology. , (2012).</li><li>Bareja, A., Billin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+therapy+-+from+mice+to+men.">Satellite cell therapy - from mice to men.</a> Skeletal Muscle. 3 (1), 2 (2013).</li><li>Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+profile+distinguishes+variability+in+human+myogenic+progenitor+cell+expansion+capacity.">Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity.</a> Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Satellite+Cell+Transplantation+and+Regeneration+from+Diverse+Skeletal+Muscles.">Human Satellite Cell Transplantation and Regeneration from Diverse Skeletal Muscles.</a> Stem Cell Reports. 5 (3), 419-434 (2015).</li></ol>

HMPCs الأولية هي نموذج بحثي مهم يستخدم لفهم بيولوجيا العضلات الهيكلية وعملية التجديد. بالإضافة إلى ذلك، hMPCs لديها القدرة على استخدامها للعلاج. ومع ذلك، هناك تحديات معترف بها في استخدام hMPCs الأولية لكل من البحث والعلاج، بما في ذلك الفهم المحدود للخلايا المشتقة من البشر10. وهناك أي...

العضلات الهيكلية هي أكبر جهاز في جسم الإنسان، تمثل 30-40٪ من كتلة الجسم كله1. بالإضافة إلى دورها المعترف بها جيدا في الحركة، العضلات الهيكلية تحافظ على درجة حرارة الجسم والموقف، ويلعب دورا مركزيا في التوازن المغذية لكامل الجسم كله. البحوث التي تشمل المشاركين من البشر، والحيوانات، ونماذج ثقافة الخلايا كلها قيمة لمعالجة المسائل المتعلقة بيولوجيا العضلات الهيكلية وتجديد. العزلة والثقافة من خلايا ذرية العضلات الأولية البشرية (hMPCs) يوفر نموذجا قويا يسمح لتقنيات زراعة الخلايا والتلاعب ليتم تطبيقها على العينات البشرية. ميزة استخدام hMPCs هو أنها تحتفظ النمط الظاهري الوراثي والأيضي من كل مانح2،3. صيانة النمط الظاهري المانح يسمح للباحثين لدراسة التباين بين الأفراد في عملية myogenic. على سبيل المثال، لقد استخدمنا طريقة توصيف HMPC لتحديد الاختلافات المتعلقةبالعمر والجنس في قدرة التوسع السكاني HMPC 4.
الغرض من هذا البروتوكول هو تفصيل تقنيات لعزل وثقافة وتوصيف وتمييز hMPCs من أنسجة خزعة العضلات والهيكل العظمي. واستناداً إلى الأعمال السابقة التي وصفت مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية وصانعات سطح الخلية المحتملة لعزل HMPC5و6، فإن هذا البروتوكول يسد فجوة حرجة في المعرفة من خلال ربط العزلة بتوصيف مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية. وعلاوة على ذلك، فإن التعليمات التفصيلية التدريجية الواردة في هذا البروتوكول تجعل عزل وتوصيف اللجنة في متناول جمهور علمي واسع، بما في ذلك أولئك الذين لديهم خبرة سابقة محدودة مع مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية. بروتوكولنا هو من بين أول من وصف استخدام مقياس الخلايا التصويرية لتعقب مجموعات الخلايا. أجهزة قياس الخلايا التصويرية المصممة حديثًا هي أحدث التقنيات، وعالية الإنتاجية، وقائمة على الصفائح الدقيقة، مما يتيح تصوير الخلايا الحية، وفرز الخلايا، وتحليل الفلورة متعدد القنوات لجميع الخلايا في كل بئر من الأوعية الثقافية في غضون دقائق. ويسمح هذا النظام بالتحديد الكمي السريع للتغيرات الدينامية في انتشار وبقاء مجموعة كاملة من الخلايا مع الحد الأدنى من التعطيل للثقافة. على سبيل المثال، نحن قادرون على تنفيذ مقاييس موضوعية للالتقاء في الأيام المتعاقبة في المختبر لتحديد حركية النمو لكل ثقافة مشتقة من مختلف المانحين. العديد من البروتوكولات في المؤلفات، ولا سيما تلك التي تنطوي على التمييز بين الـ MPCs، تتطلب الخلايا للوصول إلى مستوى محدد من التقاء قبل الشروع في التمايز أو العلاج7. تسمح طريقتنا بتحديد موضوعي للتقاء كل بئر في وعاء ثقافي يسمح للباحثين ببدء العلاج بطريقة غير متحيزة وغير ذاتية.
في الماضي، كان أحد القيود الرئيسية لاستخدام hMPCs الأولية انخفاض الغلة التي تحد من عدد الخلايا المتاحة للتجارب. لقد أظهرنا نحن وآخرون غلة الـ MPCs من أنسجة خزعة العضلات الهيكلية 1-15 MPCs لكل مليغرام من الأنسجة (الشكل 1)8. لأن بروتوكولنا يسمح لأربعة ممرات من الخلايا قبل تنقية مع فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS)، لدينا عوائد hMPC المحفوظة بالتبريد، المستمدة من كميات صغيرة من أنسجة خزعة (50-100 ملغ)، كافية لمعالجة أهداف البحوث حيث هناك حاجة إلى تجارب متعددة. لدينا بروتوكول FACS تنتج ~ 80٪ نقية (Pax7 إيجابية) MPC السكان، وبالتالي يتم تحسين بروتوكولنا لكل من العائد والنقاء.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-053-Cl</td>
			<td>Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>664160</td>
			<td>Plates used for culturing hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture plate</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>662 160</td>
			<td>Plates used for culturing hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD Viability Staining Solution</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-6993-50</td>
			<td>Viability stain for identifying living cells during FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303016</td>
			<td>Conjugated antibody for FACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well cell culture plate</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>655079</td>
			<td>96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo S</td>
			<td>Nexcelcom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Imaging cytometer used to track hMPC cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352350</td>
			<td>Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (Rat Tail)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Collagen for coating cell culture plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 088 882 001</td>
			<td>Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>WN182</td>
			<td>Used for cryopreservation of hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>D4693</td>
			<td>A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium Low Glucose powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600-034</td>
			<td>Low glucose DMEM for muscle biopsy processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td>PBS for muscle biopsy processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4040-01&#160;</td>
			<td>Required for FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-186&#160;</td>
			<td>Fetal bovine serum used for hMPC growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21700-026</td>
			<td>Base media for hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Equine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26-050-070</td>
			<td>Horse serum used to make hMPC differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>iNCyto</td>
			<td>DHC-N0105</td>
			<td>Used to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1247501</td>
			<td>Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H21492</td>
			<td>DNA stain for identifying all cells using the Celigo S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416P-4</td>
			<td>Used for controlled rate freezing of hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi buffer</td>
			<td>Orflo</td>
			<td>MXA006</td>
			<td>Buffer for automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Cassettes</td>
			<td>Orflo</td>
			<td>MXC002</td>
			<td>Cassesttes for automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi z Mini Automated Cell Counter</td>
			<td>Orflo</td>
			<td></td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Commerically available controlled rate cell freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50062Z</td>
			<td>Goat serum used in FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557747</td>
			<td>Conjugated antibody for FACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Antibiotics added to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td>DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human basic fibroblast growth factor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5071</td>
			<td>Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12648-010</td>
			<td>Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-3</td>
			<td>Added to Ham&#39;s F12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Round Bottom 5 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-565</td>
			<td>Tubes used for FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td>Compensation beads fort calibrating flow FACS settings</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, characterization, and differentiation of human muscle progenitor cells from the skeletal muscle biopsy procedure

استخدام الأنسجة البشرية الأولية والخلايا مثالية للتحقيق في العمليات البيولوجية والفسيولوجية مثل عملية تجديد العضلات الهيكلية. هناك تحديات معترف بها للعمل مع الخلايا الجذعية البشرية الأولية الكبار، وخاصة خلايا ذرية العضلات البشرية (hMPCs) المستمدة من الخزعات العضلات الهيكلية، بما في ذلك انخفاض غلة الخلايا من الأنسجة التي تم جمعها ودرجة كبيرة من عدم تجانس المانحين من النمو وبارامترات الموت بين الثقافات. في حين أن دمج التباين في التصميم التجريبي يتطلب حجم عينة أكبر للكشف عن آثار كبيرة، فإنه يسمح لنا أيضا لتحديد الآليات التي تكمن وراء التباين في قدرة التوسع hMPC، وبالتالي يسمح لنا لفهم أفضل عدم التجانس في تجديد العضلات الهيكلية. الآليات الجديدة التي تميز القدرة على التوسع من الثقافات لديها القدرة على أن تؤدي إلى تطوير العلاجات لتحسين تجديد العضلات الهيكلية.

يمكن الاطلاع على نتائج قياس التدفق التمثيلي لعزل hMPC عن أنسجة العضلات البشرية في الشكل 1. ويمكن تحديد hMPCs من خلال الأحداث التغرير الأولى على أساس التشتت الجانبي والتشتت إلى الأمام للقضاء على الخلايا الميتة أو الحطام، تليها اختيار الخلايا السلبية فقط ل7-AAD و...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure at JoVE.com

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

نقدم تقنيات لعزل خلايا ذرية العضلات الأولية البشرية (hMPCs) التي تم الحصول عليها من أنسجة خزعة العضلات الهيكلية، وزراعة وتميزها، وتميزها. ويمكن استخدام hMPCs التي تم الحصول عليها وتتميز من خلال هذه الأساليب لمعالجة الأسئلة البحثية المتعلقة بعضلة عضلية الإنسان وتجديد العضلات الهيكلية.

العزلة والثقافة والتوصيف والتمايز بين خلايا ذرية العضلات البشرية من إجراء خزعة العضلات الهيكلية

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

إن عزل خلايا سلف العضلات البشرية التي تنظم تجديد العضلات الهيكلية يسمح لنا بالتحقيق في العمليات التي تقوم عليها عملية التجديد مع الاحتفاظ بتقلبية المتبرع. هذه التقنية تسمح الغلة الكبيرة من الخلايا السلف العضلات البشرية التي يمكن الحصول عليها من كميات صغيرة من الأنسجة وتحليلها phenotypic باستخدام عدد قليل من الخلايا. تم تصميم هذه الطريقة خصيصا لعزل الخلايا السلف العضلات البشرية لتتبع قدراتها على الانتشار والتمايز وربط هذه البيانات لعملية تجديد العضلات الهيكل العظمى.الجانب الأكثر صعوبة من هذه التقنية مباشرة إلى حد ما هو ضمان تنفيذ كل خطوة بشكل مستنسخ لتحسين العائد والنقاء من الخلايا. هناك عدة خطوات تحتاج إلى إكمالها من أجل عزل الخلايا بنجاح. العديد من الخطوات أسهل في الفهم إذا تمت ملاحظتها بصريًا.لعزل الخلايا السلف العضلات البشرية من نسيج الخزعة، وضع الأنسجة العضلية في طبق بيتري معقمة في ظل ظروف معقمة، واستخدام مشرط معقمة لتلكم الأنسجة إلى قطع مكعبة ملليمتر واحد. عندما تم مفرم جميع الأنسجة، ونقل القطع إلى أنبوب 15 ملليلتر تحتوي على 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، والسماح للأنسجة لتسوية الجاذبية قبل التعرق بعناية دون إزعاج الأنسجة. بعد غسل الشظايا للمرة الثانية كما هو موضح للتو ، استبدل برنامج تلفزيوني بـ 10 ملليلتر من متوسطة النسر المعدلة منخفضة الجلوكوز في دولبيككو.إزالة ناظر بعد أن استقرت الأنسجة، وإعادة تعليق القطع في ثلاثة ملليلتر من وسط الهضم. ضع الأنسجة عند درجة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، مع تثغر أجزاء العضلات كل 10 دقائق مع ماصات مصلية من ملليلتر واحد. في نهاية الحضانة، إضافة 83 ميكرولترات من متوسط الهضم إضافية و 24 ميكرولترات من محلول ديسباس للعينات، triturate الأنسجة كل خمس إلى 10 دقائق مع طرف ماصة واسعة تتحمل حتى يتحقق الطين موحدة.الطين موحدة مهم لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش من خلايا سلف العضلات البشرية. مواصلة الهضم إذا لم يمر الطين من خلال معيار 1، 000 ميكرولتر ماص تلميح. لعزل الخلايا الإيجابية Pax7، وصمة عار وبوابة الخلايا وفقا للبروتوكول.فرز CD56, CD29 ضعف إيجابية خلايا سلف العضلات البشرية على مقياس تدفق الخلايا مع فوهة 100 ميكرومتر في ضغط 20 جنيه لكل بوصة مربعة في أنابيب جمع تحتوي على وسادة 300 ميكرولتر من الخلايا المفلورة تنشيط تخزين مؤقت الفرز. ثم بذور الخلايا السلف العضلات البشرية فرزها في الكولاجين المغلفة 24 جيدا لوحات تحتوي على متوسط النمو قبل الدافئة في 3.5 مرات 10 إلى الخلايا الرابعة في تركيز مربع سنتيمتر. لإجراء عمليات المسح، قم بتحميل اللوحة على مقياس ضوئي للتصوير، وحدد إنشاء مسح ضوئي جديد وفئة اللوحة، وملف لوحة التعريف، وتطبيق Plate ID.Under، حدد التقاء والتقاء 1، وحدد بئر للعرض.حدد موقع مستوى التركيز الذي تظهر فيه الخلايا باللون الأبيض مقارنة بالخلفية، وحدد دليل التسجيل. استخدم الماوس لتسليط الضوء على جميع الآبار التي تحتاج إلى مسح ضوئي، وحدد بدء المسح الضوئي. سيتم فحص منطقة البئر بالكامل تلقائيًا.حدد إعدادات التحليل الأمثل لنوع اللوحة والخلايا، وحدد بدء التحليل. استخدم مقياس الذوباني للتصوير لقياس الالتقاء في البداية. ثم لحساب الخلايا على جهاز قياس الخلايا التصوير، واستبدال المتوسطة في كل بئر مع 200 ميكرولترات من حل تلطيخ.بعد 15 دقيقة في 37 درجة مئوية، واستبدال حل تلطيخ مع 100 ميكرولترات من F12 لحم الخنزير الطازجة. العودة إلى لوحة التصوير cytometer، وتحت التطبيق، حدد الخلية حيوية ويعيش الميت المجموع. وسوف تكون القناة المباشرة صورة حقل مشرق، وسوف تظهر قناة الميت إيوديدوم إيوديدوم تلطيخ، والقناة المجموع سيكون هويشست 33342 تلطيخ.ضمن "إعداد التركيز"، انقر فوق تسجيل تلقائي. ضمن القناة الإجمالية، قم بتعيين القناة إلى اللون الأزرق. استخدم البحث عن التركيز البؤري لتركيز البؤرة النووية، ثم انقر على تعيين الإزاحة لتحديد التركيز.تحت قناة الميت، تعيين القناة إلى الأحمر، واستخدام البحث عن التركيز على جعل الخلايا الميتة في التركيز. انقر فوق تعيين إزاحة لتحديد التركيز، وحدد بدء المسح الضوئي لبدء الفحص. ثم حدد معلمات التحليل المناسبة لنوع اللوحة و الخلية، ثم حدد بدء التحليل لبدء التحليل.عند اكتمال التحليل، تحقق بصرياً من أن التحليل حسب الخلايا بشكل مناسب. إذا كان الفحص والتحليل مرضيين، قم بإرجاع اللوحة إلى الحاضنة، وإلا قم بإعادة مسح أو تعديل معلمات التحليل. يمكن تحديد خلايا السلف العضلات البشرية من قبل الأحداث الأولى الغاتينغ على أساس الجانب وإلى الأمام منطقة التشتت للقضاء على الخلايا الميتة أو الحطام، تليها اختيار الخلايا التي هي سلبية فقط ل7-AAD وبالتالي قابلة للحياة.الخلايا التي هي إيجابية لكل من علامات سطح الخلية CD56 وD29 ثم تمثل مجموعة الخلايا السلف العضلات البشرية. يمكن أيضا أن تكون خلايا السلف العضلات البشرية التي تم تحديدها من خلال التعبير Pax7 بهم. والواقع أن عملية "باكس 7" تُثري في مجموع السكان بعد نظام مراقبة الأصول الميدانية ويتم الحفاظ عليها من خلال عدة ممرات.هنا، يتم عرض مسح التقاء تمثيلي. تم إنشاء الخطوط العريضة الخضراء بواسطة مقياس الصور واظهار كيف حدد مقياس الصور الالتقاء بناءً على إعدادات التحليل المحددة. ومن الشائع أن يكون هناك تغايرية وعدد النوى بين المانحين.اكتشاف وتتميز بدقة هذا التغاير هو تطبيق رئيسي لمقياس الصور. غير أن قياسات الالتقاء وعدد النوى من المانحين الفريدين مترابطان إلى حد كبير. يمكن تمييز الخلايا السلف العضلات البشرية التي تختلف لتشكيل myotubes من خلال التعبير سلسلة الميوسين الجنينية الثقيلة.من المهم أن تكون متسقة عند اختيار المعلمات الغات على تدفق سايتوميمتر من أجل عزل نفس السكان من الخلايا من كل متبرع. مرة واحدة معزولة, يمكن استخدام خلايا السلف العضلات البشرية لأغراض متعددة, بما في ذلك تحديد متطلبات التمثيل الغذائي فريدة من الانتشار والتمايز من خلايا سلف العضلات البشرية. وقد سمحت عزلة الخلايا السلف العضلات البشرية التمييز من الاختلافات في التعبير علامة سطح الخلية على خلايا السلف العضلات الإنسان والفأر.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

العزلة والكمية Immunocytochemical توصيف الخلايا عضلي الابتدائية والخلايا الليفية من العضلات الهيكلية البشرية

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

عزل الخلايا الجذعية العصبية / السلف من المنطقة المحيطة بالبطين في الجرذان الكبار والحبل الشوكي البشري

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

عن طريق عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية لارتفاع صفيحة ميكروسكوبية الإنتاجية قياسات الجهاز التنفسي

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

إنتاج واسع النطاق العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام تكرار للغاية الصغيرة وبناء جزيء بروتوكول التمايز

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

إعداد والثقافة من الخلايا عضلي السلائف / Myoblasts الابتدائية من العضلات الهيكلية من الكبار والمسنين البشر

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

عزل خلايا غشائي السلف من دم الحبل السري البشري

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

تطبيق التحفيز المزمن لدراسة التعديلات المظهرية الهيكل العظمى والعضلات الهوس الفئران التي يسببها النشاط

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

تحديد خلايا الهيكل العظمى والعضلات الأقمار الصناعية قبل الفلورة مع Pax7 والأجسام المضادة لامينين

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

أداء العضلات الهيكلية البشرية Xenografts في الفئران نقص المناعة

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...