Name: isolation, culture, characterization, and differentiation of human muscle progenitor cells from the skeletal muscle biopsy procedure
Uploaded: 2019-08-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure at JoVE.com

Les auteurs remercient l'Université Cornell, Biotechnology Resource Center Imaging Facility pour leur aide au tri des cellules activées par la fluorescence. Nous remercions également Molly Gheller pour son aide dans le recrutement des participants et Erica Bender pour la conduite des biopsies musculaires squelettiques. Enfin, nous remercions les participants pour leur temps et leur participation à l'étude. Ce travail a été soutenu par le National Institute on Aging of the National Institutes of Health sous le numéro de prix R01AG058630 (à B.D.C. et A.E.T.), par une Glenn Foundation for Medical Research et l'American Federation for Aging Research Grant for Junior Faculty (à B . D.C.), et par le President's Council for Cornell Women (à A.E.T.).

Ce protocole a été approuvé par la Commission d'examen institutionnel de l'Université Cornell. Tous les participants ont subi un dépistage des problèmes de santé sous-jacents et ont donné leur consentement éclairé.
1. Obtenir le tissu de muscle humain par l'intermédiaire de la biopsie squelettique de muscle
<ol><li>Identifiez le muscle vastus lateralis par l'intermédiaire de la palpation, des repères anatomiques, et de la contraction active du muscle.</li>
	<li>Palpate le vastus...

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>D'Souza, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+satellite+cell+number+and+function+in+humans+and+mice+with+type+1+diabetes+is+the+result+of+altered+notch+signaling.">Decreased satellite cell number and function in humans and mice with type 1 diabetes is the result of altered notch signaling.</a> Diabetes. 65 (10), 3053-3061 (2016).</li><li>Scheele, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+derived+from+Obese+humans+with+type+2+diabetes+and+differentiated+into+Myocytes+in+vitro+exhibit+abnormal+response+to+IL-6.">Satellite cells derived from Obese humans with type 2 diabetes and differentiated into Myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6.</a> PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).</li><li>Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+capacity+of+human+muscle+progenitor+cells+differs+by+age,+sex,+and+metabolic+fuel+preference.">Expansion capacity of human muscle progenitor cells differs by age, sex, and metabolic fuel preference.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 315 (5), C643-C652 (2018).</li><li>Charville, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+and+in+vivo+self-renewal+of+human+muscle+stem+cells.">Ex vivo expansion and in vivo self-renewal of human muscle stem cells.</a> Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).</li><li>Alexander, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD82+Is+a+Marker+for+Prospective+Isolation+of+Human+Muscle+Satellite+Cells+and+Is+Linked+to+Muscular+Dystrophies.">CD82 Is a Marker for Prospective Isolation of Human Muscle Satellite Cells and Is Linked to Muscular Dystrophies.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 800-807 (2016).</li><li>Thalacker-Mercer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cluster+analysis+reveals+differential+transcript+profiles+associated+with+resistance+training-induced+human+skeletal+muscle+hypertrophy.">Cluster analysis reveals differential transcript profiles associated with resistance training-induced human skeletal muscle hypertrophy.</a> Physiological Genomics. 45 (12), 499-507 (2013).</li><li>Garcia, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Yield+Purification,+Preservation,+and+Serial+Transplantation+of+Human+Satellite+Cells.">High-Yield Purification, Preservation, and Serial Transplantation of Human Satellite Cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 1160-1174 (2018).</li><li>Yokoyama, W. M., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+thawing+of+cells.">Cryopreservation and thawing of cells.</a> Current Protocols in Immunology. , (2012).</li><li>Bareja, A., Billin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+therapy+-+from+mice+to+men.">Satellite cell therapy - from mice to men.</a> Skeletal Muscle. 3 (1), 2 (2013).</li><li>Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+profile+distinguishes+variability+in+human+myogenic+progenitor+cell+expansion+capacity.">Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity.</a> Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Satellite+Cell+Transplantation+and+Regeneration+from+Diverse+Skeletal+Muscles.">Human Satellite Cell Transplantation and Regeneration from Diverse Skeletal Muscles.</a> Stem Cell Reports. 5 (3), 419-434 (2015).</li></ol>

Les HMPC primaires sont un modèle de recherche important utilisé pour comprendre la biologie des muscles squelettiques et le processus régénérateur. En outre, les HMPC ont le potentiel d'être utilisés pour la thérapie. Cependant, il y a des défis reconnus en utilisant les HMPC primaires pour la recherche et la thérapie, y compris la compréhension limitée des cellules dérivées des humains10. Il existe également une grande variation de la capacité d'expansion entre les cultures de do...

Le muscle squelettique est le plus grand système d'organes dans le corps humain, représentant 30-40% de la masse corporelle entière1. En plus de son rôle bien reconnu dans la locomotion, le muscle squelettique maintient la température et la posture du corps, et joue un rôle central dans l'homéostasie nutritive du corps entier. La recherche impliquant des participants humains, des animaux et des modèles de culture cellulaire est précieuse pour répondre aux questions relatives à la biologie et à la régénération des muscles squelettiques. L'isolement et la culture des cellules progénitrices musculaires primaires humaines (HMPC) fournit un modèle robuste qui permet d'appliquer des techniques de culture cellulaire et des manipulations sur des échantillons humains. Un avantage de l'utilisation de HMPCest est qu'ils conservent le phénotype génétique et métabolique de chaque donneur2,3. Le maintien du phénotype du donneur permet aux chercheurs d'examiner la variation interindividuelle du processus myogénique. Par exemple, nous avons utilisé notre méthode de caractérisation du HMPC pour identifier les différences liées à l'âge et au sexe dans la capacité d'expansion de la population du CPMH4.
Le but de ce protocole est de détailler des techniques pour isoler, culture, caractériser, et différencier hMPCs du tissu de biopsie de muscle squelettique. S'appuyant sur des travaux antérieurs qui décrivicomment les HMPC et identifient les fabricants potentiels de surface cellulaire pour l'isolement du HMPC5,6, ce protocole comble une lacune critique dans la connaissance en liant l'isolement à la caractérisation des HMPC. De plus, les instructions détaillées étape par étape incluses dans ce protocole rendent l'isolement et la caractérisation du HMPC accessibles à un large public scientifique, y compris ceux qui ont une expérience antérieure limitée avec les HMPC. Notre protocole est parmi les premiers à décrire l'utilisation d'un cytomètre d'imagerie pour suivre les populations cellulaires. Les cytomètres d'imagerie nouvellement conçus sont à la fine pointe de la technologie, à haut débit et à base de microplaques, ce qui permet l'imagerie cellulaire vivante, le comptage cellulaire et l'analyse de la fluorescence multicanal de toutes les cellules dans chaque puits d'un vaisseau culturel en quelques minutes. Ce système permet une quantification rapide des changements dynamiques dans la prolifération et la viabilité de toute une population cellulaire avec seulement une perturbation minimale de la culture. Par exemple, nous sommes en mesure d'effectuer des mesures objectives de la confluence sur les jours successifs in vitro pour déterminer la cinétique de croissance de chaque culture dérivée de différents donneurs. De nombreux protocoles dans la littérature, en particulier ceux impliquant la différenciation des MPC, exigent que les cellules atteignent un niveau défini de confluence avant d'initier la différenciation ou le traitement7. Notre méthode permet une détermination objective de la confluence de chaque puits dans un récipient de culture permettant aux chercheurs d'initier le traitement d'une manière impartiale et non subjective.
Dans le passé, une limitation majeure de l'utilisation des HMPC primaires était de faibles rendements qui limitent le nombre de cellules disponibles pour les expériences. Nous et d'autres avons montré que le rendement des MPC à partir du tissu de biopsie des muscles squelettiques est de 1 à 15 MPC par milligramme de tissu (Figure 1)8. Parce que notre protocole permet quatre passages des cellules avant la purification avec fluorescence activée tri des cellules (FACS), nos rendements de hMPC cryoconservés, dérivés de petites quantités de tissu de biopsie (50-100 mg), sont suffisants pour répondre aux objectifs de recherche où plusieurs expériences sont nécessaires. Notre protocole FACS produit une population MPC pure (Pax7 positive) de 80 %, de cette façon, notre protocole est optimisé pour le rendement et la pureté.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-053-Cl</td>
			<td>Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>664160</td>
			<td>Plates used for culturing hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture plate</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>662 160</td>
			<td>Plates used for culturing hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD Viability Staining Solution</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-6993-50</td>
			<td>Viability stain for identifying living cells during FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303016</td>
			<td>Conjugated antibody for FACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well cell culture plate</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>655079</td>
			<td>96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo S</td>
			<td>Nexcelcom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Imaging cytometer used to track hMPC cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352350</td>
			<td>Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (Rat Tail)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Collagen for coating cell culture plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 088 882 001</td>
			<td>Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>WN182</td>
			<td>Used for cryopreservation of hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>D4693</td>
			<td>A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium Low Glucose powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600-034</td>
			<td>Low glucose DMEM for muscle biopsy processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td>PBS for muscle biopsy processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4040-01&#160;</td>
			<td>Required for FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-186&#160;</td>
			<td>Fetal bovine serum used for hMPC growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21700-026</td>
			<td>Base media for hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Equine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26-050-070</td>
			<td>Horse serum used to make hMPC differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>iNCyto</td>
			<td>DHC-N0105</td>
			<td>Used to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1247501</td>
			<td>Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H21492</td>
			<td>DNA stain for identifying all cells using the Celigo S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416P-4</td>
			<td>Used for controlled rate freezing of hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi buffer</td>
			<td>Orflo</td>
			<td>MXA006</td>
			<td>Buffer for automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Cassettes</td>
			<td>Orflo</td>
			<td>MXC002</td>
			<td>Cassesttes for automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi z Mini Automated Cell Counter</td>
			<td>Orflo</td>
			<td></td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Commerically available controlled rate cell freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50062Z</td>
			<td>Goat serum used in FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557747</td>
			<td>Conjugated antibody for FACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Antibiotics added to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td>DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human basic fibroblast growth factor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5071</td>
			<td>Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12648-010</td>
			<td>Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-3</td>
			<td>Added to Ham&#39;s F12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Round Bottom 5 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-565</td>
			<td>Tubes used for FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td>Compensation beads fort calibrating flow FACS settings</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, characterization, and differentiation of human muscle progenitor cells from the skeletal muscle biopsy procedure

L'utilisation des tissus et des cellules humaines primaires est idéale pour l'étude des processus biologiques et physiologiques tels que le processus de régénération de muscle squelettique. Il y a des défis reconnus à travailler avec les cellules souches adultes primaires humaines, en particulier les cellules progénitrices de muscle humain (HMPC) dérivées des biopsies squelettiques de muscle, y compris le faible rendement de cellules des tissus rassemblés et un grand degré d'hétérogénéité de distributeur de paramètres de croissance et de mort entre les cultures. Bien que l'intégration de l'hétérogénéité dans la conception expérimentale nécessite une plus grande taille d'échantillon pour détecter des effets significatifs, il nous permet également d'identifier les mécanismes qui sous-tendent la variabilité de la capacité d'expansion hMPC, et nous permet ainsi de mieux comprendre hétérogénéité dans la régénération des muscles squelettiques. De nouveaux mécanismes qui distinguent la capacité d'expansion des cultures ont le potentiel de conduire au développement de thérapies pour améliorer la régénération des muscles squelettiques.

Les résultats représentatifs de cytométrie de flux de l'isolement de hMPC du tissu de muscle humain peuvent être vus dans la figure 1. les hMPC peuvent être identifiés par les premiers événements de gating basés sur la diffusion latérale et la diffusion vers l'avant pour éliminer les cellules mortes ou les débris, suivis par la sélection des cellules qui sont négatives pour 7-AAD et sont donc viables. La sélection des cellules positives pour le...

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Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Nous présentons des techniques pour isoler, cultiver, caractériser, et différencier les cellules primaires humaines d'ancêtre de muscle (HMPCs) obtenues du tissu de biopsie de muscle squelettique. les HMPC obtenus et caractérisés par ces méthodes peuvent être utilisés pour aborder ultérieurement des questions de recherche liées à la myogenèse humaine et à la régénération des muscles squelettiques.

Isolement, culture, caractérisation et différenciation des cellules de l'ancêtre musculaire humain de la procédure de biopsie musculaire squelettique

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Isoler les cellules progénitrices musculaires humaines qui régulent la régénération musculaire squelettique nous permet d’étudier les processus qui sous-tendent le processus de régénération tout en conservant la variabilité du donneur. Cette technique permet d’obtenir de grands rendements de cellules progénitrices musculaires humaines à partir de petites quantités de tissus et de leur analyse phénotypique à l’aide d’un petit nombre de cellules. Cette méthode est spécifiquement conçue pour isoler les cellules progénitrices musculaires humaines afin de suivre leurs capacités de prolifération et de différenciation et de relier ces données au processus de régénération musculaire squelettique.L’aspect le plus difficile de cette technique assez simple est de s’assurer que chaque étape est effectuée reproductiblement pour optimiser le rendement et la pureté des cellules. Il y a plusieurs étapes qui doivent être accomplies pour l’isolement réussi des cellules. Plusieurs étapes sont plus faciles à comprendre si elles sont observées visuellement.Pour isoler les cellules progénitrices musculaires humaines des tissus de biopsie, placez le tissu musculaire dans une boîte de Pétri stérile dans des conditions stériles, et utilisez un scalpel stérile pour hacher le tissu en morceaux en cubes d’un millimètre. Lorsque tout le tissu a été haché, transférer les morceaux dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de PBS, et permettre aux tissus de se déposer par gravité avant d’aspirer soigneusement le supernatant sans déranger le tissu. Après avoir lavé les fragments une deuxième fois comme nous venons de le démontrer, remplacez le PBS par 10 millilitres de milieu Eagle modifié de Dulbecco à faible teneur en glucose.Enlever le supernatant après que les tissus ont été réglés, et resuspendre les morceaux en trois millilitres de milieu de digestion. Placez les tissus à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, avec trituration des fragments musculaires toutes les 10 minutes avec une pipette sérologique d’un millilitre. À la fin de l’incubation, ajouter 83 microlitres de milieu de digestion supplémentaire et 24 microlitres de solution Dispase aux échantillons, et triturer les tissus toutes les cinq à 10 minutes avec une pointe de pipette à alésage large jusqu’à ce qu’une boue uniforme soit atteinte.Une boue uniforme est importante pour la récupération maximale des cellules progénitrices musculaires humaines. Continuez la digestion si le lisier ne passe pas par une pointe standard de pipette de 1000 microlitres. Isoler les cellules pax7-positives, tacher et la porte des cellules selon le protocole.Trier le CD56, CD29 double positif cellules progénitrices musculaires humaines sur un cytomètre d’écoulement avec une buse de 100 micromètres à une pression de 20 livres par pouce carré dans des tubes de collecte contenant un coussin de 300 microlitres de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence. Puis ensemencer les cellules progénitrices du muscle humain triées en plaques de 24 puits recouvertes de collagène contenant un milieu de croissance préchauffé à une concentration de 3,5 fois 10 à la quatrième cellule par centimètre de concentration carrée. Pour effectuer des analyses de confluence, chargez la plaque sur un cytomètre d’imagerie et sélectionnez Créer un nouveau scan et la catégorie plaque, profil de plaque et application ID.Under de la plaque, sélectionnez Confluence et Confluence 1, et sélectionnez un puits à afficher.Localisez un plan de mise au point dans lequel les cellules apparaissent blanches par rapport à l’arrière-plan, et sélectionnez Registre Manuel. Utilisez la souris pour mettre en évidence tous les puits qui doivent être scannés et sélectionnez Démarrer l’analyse. Toute la zone du puits sera automatiquement scannée.Sélectionnez les paramètres d’analyse qui sont optimaux pour le type de plaque et de cellule, et sélectionnez Analyse de démarrage. Utilisez le cytomètre d’imagerie pour mesurer la confluence au départ. Ensuite, pour compter les cellules sur le cytomètre d’imagerie, remplacer le milieu dans chaque puits par 200 microlitres de solution de coloration.Après 15 minutes à 37 degrés Celsius, remplacer la solution de coloration par 100 microlitres de F12 de jambon frais. Retournez la plaque au cytomètre d’imagerie, et sous application, sélectionnez Viabilité cellulaire et Live Dead Total. La chaîne Live sera une image à champ lumineux, la chaîne Dead montrera la coloration propidium iodée, et le canal Total sera la coloration Hoechst 33342.Sous configuration focus, cliquez sur Enregistrer auto. Sous le canal Total, réglez le canal en bleu. Utilisez Find Focus pour mettre les noyaux au point, et cliquez sur Set Offset pour sélectionner la mise au point.Sous le canal Dead, réglez le canal en rouge et utilisez Find Focus pour mettre les cellules mortes au point. Cliquez sur Définir Offset pour sélectionner la mise au point et sélectionnez Démarrer l’analyse pour démarrer l’analyse. Sélectionnez ensuite les paramètres d’analyse qui conviennent au type de plaque et de cellule, et sélectionnez Démarrer l’analyse pour commencer l’analyse.Lorsque l’analyse est terminée, vérifiez visuellement que l’analyse a correctement compté les cellules. Si l’analyse et l’analyse sont satisfaisantes, retournez la plaque à l’incubateur, rescan ou modifiez les paramètres d’analyse. Les cellules progénitrices musculaires humaines peuvent être identifiées par les premiers événements de gating basés sur la zone de dispersion latérale et avant pour éliminer les cellules mortes ou les débris, suivies en sélectionnant seulement les cellules qui sont négatives pour 7-AAD et sont donc viables.Les cellules qui sont positives pour les marqueurs de surface des cellules CD56 et CD29 représentent alors la population de cellules progénitrices musculaires humaines. Les cellules progénitrices musculaires humaines peuvent également être identifiées par leur expression Pax7. En effet, Pax7 est enrichi dans la population totale après FACS et est maintenu par de multiples passages.Ici, un balayage représentatif de confluence est montré. Les contours verts ont été générés par le cytomètre d’imagerie et montrent comment le cytomètre d’imagerie a déterminé la confluence en fonction des paramètres d’analyse sélectionnés. L’hétérogénéité et le dénombrement des noyaux sont fréquents entre les donneurs.La découverte et la caractérisation précise de cette hétérogénéité est une application clé du cytomètre d’imagerie. Les mesures de confluence et le dénombrement des noyaux des donneurs uniques, cependant, sont fortement corrélés. Les cellules progénitrices musculaires humaines différenciées pour former des myotubes peuvent être distinguées par leur expression embryonnaire de chaîne lourde de myosine.Il est important d’être cohérent lors de la sélection des paramètres de gating sur le cytomètre d’écoulement afin d’isoler la même population de cellules de chaque donneur. Une fois isolées, les cellules progénitrices musculaires humaines peuvent être utilisées à des fins multiples, y compris l’identification des exigences métaboliques uniques de prolifération et de différenciation des cellules progénitrices musculaires humaines. L’isolement des cellules progénitrices musculaires humaines a permis de discrimination des différences dans l’expression des marqueurs de surface cellulaire sur les cellules progénitrices musculaires humaines et souris.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolement et quantitative immunocytochimique caractérisation des cellules myogéniques primaires et fibroblastes de muscle squelettique humain

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Recherche

Biologie du développement

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Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

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