Name: isolation, culture, characterization, and differentiation of human muscle progenitor cells from the skeletal muscle biopsy procedure
Uploaded: 2019-08-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure at JoVE.com

המחברים מודים לאוניברסיטת קורנל, ביוטכנולוגיה מרכז משאבים הדמיה עבור עזרתם עם מיון תא המופעל הקרינה. אנו מודים גם מולי Gheller על עזרתה עם גיוס משתתף ואריקה בנדר על ניהול ביופסיות שריר השלד. לבסוף, אנו מודים למשתתפים על זמנם והשתתפותו במחקר. עבודה זו היתה נתמכת על ידי המכון הלאומי על הזדקנות המוסדות הלאומיים לבריאות תחת הפרס מספר R01AG058630 (כדי B.D.C. ו A.E.T.), על ידי קרן גלן למחקר רפואי הפדרציה האמריקנית למענק מחקר הזדקנות עבור הפקולטה זוטר (ב . Dc), ועל ידי מועצת הנשיא לנשות קורנל (לA.E.T.).

פרוטוקול זה אושר על ידי מועצת הסקירה המוסדית באוניברסיטת קורנל. כל המשתתפים הוקרן לתנאי הבריאות הבסיסיים והעניקו הסכמה מושכלת.
1. קבלת רקמת שריר האדם דרך ביופסיה שריר השלד
<ol><li>לזהות את השריר הווסטוס באמצעות מישוש, ציוני דרך אנטומיים, וכיווץ פעיל של השריר.</li>
	<li>באמצעות המש?...

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>D'Souza, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+satellite+cell+number+and+function+in+humans+and+mice+with+type+1+diabetes+is+the+result+of+altered+notch+signaling.">Decreased satellite cell number and function in humans and mice with type 1 diabetes is the result of altered notch signaling.</a> Diabetes. 65 (10), 3053-3061 (2016).</li><li>Scheele, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+derived+from+Obese+humans+with+type+2+diabetes+and+differentiated+into+Myocytes+in+vitro+exhibit+abnormal+response+to+IL-6.">Satellite cells derived from Obese humans with type 2 diabetes and differentiated into Myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6.</a> PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).</li><li>Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+capacity+of+human+muscle+progenitor+cells+differs+by+age,+sex,+and+metabolic+fuel+preference.">Expansion capacity of human muscle progenitor cells differs by age, sex, and metabolic fuel preference.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 315 (5), C643-C652 (2018).</li><li>Charville, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+and+in+vivo+self-renewal+of+human+muscle+stem+cells.">Ex vivo expansion and in vivo self-renewal of human muscle stem cells.</a> Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).</li><li>Alexander, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD82+Is+a+Marker+for+Prospective+Isolation+of+Human+Muscle+Satellite+Cells+and+Is+Linked+to+Muscular+Dystrophies.">CD82 Is a Marker for Prospective Isolation of Human Muscle Satellite Cells and Is Linked to Muscular Dystrophies.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 800-807 (2016).</li><li>Thalacker-Mercer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cluster+analysis+reveals+differential+transcript+profiles+associated+with+resistance+training-induced+human+skeletal+muscle+hypertrophy.">Cluster analysis reveals differential transcript profiles associated with resistance training-induced human skeletal muscle hypertrophy.</a> Physiological Genomics. 45 (12), 499-507 (2013).</li><li>Garcia, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Yield+Purification,+Preservation,+and+Serial+Transplantation+of+Human+Satellite+Cells.">High-Yield Purification, Preservation, and Serial Transplantation of Human Satellite Cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 1160-1174 (2018).</li><li>Yokoyama, W. M., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+thawing+of+cells.">Cryopreservation and thawing of cells.</a> Current Protocols in Immunology. , (2012).</li><li>Bareja, A., Billin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+therapy+-+from+mice+to+men.">Satellite cell therapy - from mice to men.</a> Skeletal Muscle. 3 (1), 2 (2013).</li><li>Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+profile+distinguishes+variability+in+human+myogenic+progenitor+cell+expansion+capacity.">Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity.</a> Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Satellite+Cell+Transplantation+and+Regeneration+from+Diverse+Skeletal+Muscles.">Human Satellite Cell Transplantation and Regeneration from Diverse Skeletal Muscles.</a> Stem Cell Reports. 5 (3), 419-434 (2015).</li></ol>

הראשי hMPCs הם מודל מחקר חשוב המשמש להבנת ביולוגיה שריר השלד ואת תהליך ההתחדשות. בנוסף, hMPCs יש את הפוטנציאל לשמש טיפול. עם זאת, ישנם אתגרים מזוהים באמצעות hMPCs הראשי עבור מחקר וטיפול, כולל הבנה מוגבלת של תאים הנגזרים מבני אדם10. יש גם מידה גדולה של וריאציה בקיבולת הרחבה בין תרבויות ה?...

שריר השלד הוא מערכת האיברים הגדולה ביותר בגוף האדם, חשבונאות עבור 30-40% של מסת הגוף כולו1. בנוסף התפקיד שלה מזוהה היטב תנועה, שריר השלד שומרת על טמפרטורת הגוף ויציבה, וממלא תפקיד מרכזי הומאוסטזיס מזינים הגוף כולו. מחקרים הקשורים למשתתפים אנושיים, בעלי חיים ומודלים של תרבות התא הם כולם יקרי ערך לטפל בשאלות הנוגעות לביולוגיה שריר השלד והתחדשות. בידוד ותרבות של תאים אנושיים שרירים ראשוניים (hMPCs) מספק מודל חזק המאפשר לטכניקות תרבות התא ומניפולציות להיות מיושם על דגימות אנושיות. היתרון של שימוש hmpcs הוא שהם שומרים את מושגים גנטיים ומטבולית מכל תורם2,3. תחזוקת פנוטיפ התורם מאפשרת לחוקרים לבחון וריאציה בין-אישית בתהליך היוגניים. לדוגמה, העסקנו את שיטת האפיון hMPC שלנו כדי לזהות הבדלים בין הגילאים והמין בקיבולת הרחבת אוכלוסיית hMPC4.
מטרת פרוטוקול זה היא לפרט טכניקות כדי לבודד, תרבות, לאפיין, ולהבדיל hMPCs מרקמת ביופסיה שריר השלד. בניין על עבודה קודמת שתיאר hmpcs וזיהה מקבלי הפנים הפוטנציאליים תאים עבור בידוד hmpcs5,6, פרוטוקול זה ממלא פער קריטי בידע על ידי קישור בידוד לאפיון של hmpcs. עוד, הוראות צעד אחר צעד המפורטים בפרוטוקול זה להפוך את הבידוד hMPC ואפיון נגיש לקהל מדעי רחב, כולל אלה עם ניסיון קודם מוגבל עם Hmpc. הפרוטוקול שלנו הוא בין הראשונים לתאר שימוש בציטוטומטר הדמיה כדי לעקוב אחר אוכלוסיות תאים. ציטוטומטרים מעוצבים לאחרונה הם מדינה-של-האמנות, תפוקה גבוהה ומיקרופלייט, המאפשרת הדמיה של תא חי, ספירת תאים וניתוח של קרינה פלואורסצנטית רב-ערוצית של כל התאים בכל באר של כלי תרבות בתוך דקות. מערכת זו מאפשרת כימות מהירה של שינויים דינמיים בהתפשטות ובכדאיות של אוכלוסיית תאים שלמה עם הפרעה מינימלית בלבד לתרבות. לדוגמה, אנו מסוגלים לבצע פעולות אובייקטיביות של המפגש בימים רצופים בחוץ כדי לקבוע את קינטיקה הגדילה של כל תרבות הנגזרת מתורמים שונים. פרוטוקולים רבים בספרות, במיוחד אלה הקשורים הבידול של MPCs, דורשים תאים כדי להגיע לרמה מוגדרת של המפגש לפני התחלת בידול או טיפול7. השיטה שלנו מאפשרת קביעה אובייקטיבית של הזרימה של כל באר בכלי תרבות המאפשר לחוקרים ליזום טיפול באופן לא משוחד ולא סובייקטיבי.
בעבר, מגבלה עיקרית של שימוש hMPCs הראשי היה תשואה נמוכה המגבילות את מספר התאים הזמינים עבור ניסויים. אנחנו ואחרים הראו את התשואה של MPCs מן רקמת ביופסיה שריר השלד הוא 1-15 MPCs לכל מיליגרם של רקמה (איור 1)8. בגלל הפרוטוקול שלנו מאפשר ארבעה קטעים של התאים לפני טיהור עם מיון התא המופעל על ידי הזריחה (FACS), שלנו היבול hMPC שלנו, נגזר כמויות קטנות של רקמת ביופסיה (50-100 מ ג), הם מספיק כדי לטפל במטרות מחקר שבו יש צורך בניסויים מרובים. פרוטוקול ה-FACS שלנו מפיק אוכלוסיית MPC טהורה של ~ 80% (Pax7 חיוביים), ולכן הפרוטוקול שלנו ממוטב לתשואה ולטוהר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-053-Cl</td>
			<td>Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>664160</td>
			<td>Plates used for culturing hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture plate</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>662 160</td>
			<td>Plates used for culturing hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD Viability Staining Solution</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-6993-50</td>
			<td>Viability stain for identifying living cells during FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303016</td>
			<td>Conjugated antibody for FACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well cell culture plate</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>655079</td>
			<td>96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo S</td>
			<td>Nexcelcom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Imaging cytometer used to track hMPC cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352350</td>
			<td>Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (Rat Tail)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Collagen for coating cell culture plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 088 882 001</td>
			<td>Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>WN182</td>
			<td>Used for cryopreservation of hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>D4693</td>
			<td>A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium Low Glucose powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600-034</td>
			<td>Low glucose DMEM for muscle biopsy processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td>PBS for muscle biopsy processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4040-01&#160;</td>
			<td>Required for FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-186&#160;</td>
			<td>Fetal bovine serum used for hMPC growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21700-026</td>
			<td>Base media for hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Equine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26-050-070</td>
			<td>Horse serum used to make hMPC differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>iNCyto</td>
			<td>DHC-N0105</td>
			<td>Used to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1247501</td>
			<td>Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H21492</td>
			<td>DNA stain for identifying all cells using the Celigo S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416P-4</td>
			<td>Used for controlled rate freezing of hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi buffer</td>
			<td>Orflo</td>
			<td>MXA006</td>
			<td>Buffer for automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Cassettes</td>
			<td>Orflo</td>
			<td>MXC002</td>
			<td>Cassesttes for automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi z Mini Automated Cell Counter</td>
			<td>Orflo</td>
			<td></td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Commerically available controlled rate cell freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50062Z</td>
			<td>Goat serum used in FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557747</td>
			<td>Conjugated antibody for FACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Antibiotics added to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td>DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human basic fibroblast growth factor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5071</td>
			<td>Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12648-010</td>
			<td>Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-3</td>
			<td>Added to Ham&#39;s F12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Round Bottom 5 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-565</td>
			<td>Tubes used for FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td>Compensation beads fort calibrating flow FACS settings</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, characterization, and differentiation of human muscle progenitor cells from the skeletal muscle biopsy procedure

השימוש ברקמות ובתאים האנושיים העיקריים הוא אידיאלי לחקירת תהליכים ביולוגיים ופיזיולוגיים כגון תהליך ההתחדשות של שריר השלד. ישנם אתגרים מזוהים לעבוד עם בתאי גזע האדם העיקרי בוגרים, במיוחד בתאי שריר האדם בתאים (hMPCs) נגזר ביופסיות שריר השלד, כולל התשואה התא נמוך מרקמות שנאספו ומידה גדולה של התורם טרוגניות של מערכי צמיחה ומוות בקרב תרבויות. בעוד שילוב טרוגניות לתוך העיצוב הניסיוני דורש גודל מדגם גדול יותר כדי לזהות אפקטים משמעותיים, זה גם מאפשר לנו לזהות מנגנונים כי השונות ושתתות קיבולת הרחבת hmpc, ובכך מאפשר לנו להבין טוב יותר טרוגניות שרירים התחדשות השלד. מנגנונים חדשניים המבדילים את יכולת ההתרחבות של תרבויות יש את הפוטנציאל להוביל לפיתוח של טיפולים כדי לשפר את התחדשות שריר השלד.

זרימת הנציג cy, התוצאות של בידוד hMPC מרקמת השריר האנושי ניתן לראות באיור 1. hMPCs יכול להיות מזוהה על ידי הראשון האירועים מבוסס על פיזור בצד ופיזור קדימה כדי לחסל תאים מתים או פסולת, ואחריו בחירת רק תאים אשר שליליים עבור 7 עמ מ ולכן הם קיימא. בחירת תאים חיובית הן ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure at JoVE.com

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

אנו מציגים טכניקות עבור בידוד, culturing, אפיון, וההבחנה תאים האדם העיקרי שריר השריר (hMPCs) המתקבל רקמת שריר השלד ביופסיה. hmpcs התקבל ומאופיין באמצעות שיטות אלה ניתן להשתמש לאחר מכן לכתובת מחקר שאלות הקשורות מיוגנזה האדם התחדשות השלד שריר.

בידוד, תרבות, אפיון, והבידול של תאים האדם שריר ביופסיה של השלד שרירי השגרה נוהל

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

בידוד תאי השריר האנושי המווסתים את התחדשות שרירי השלד מאפשר לנו לחקור תהליכים המעמידים ביסוד תהליך ההתחדשות תוך שמירה על השונות התורם. טכניקה זו מאפשרת תשואות גדולות של תאי אביהם של השרירים האנושיים להתקבל כמויות קטנות של רקמות וניתוח פנוטיפי שלהם באמצעות מספר קטן של תאים. שיטה זו תוכננה במיוחד כדי לבודד תאים של שרירים אנושיים כדי לעקוב אחר יכולות ההתפשטות והבידול שלהם ולקשר נתונים אלה לתהליך התחדשות שרירי השלד.ההיבט הקשה ביותר של טכניקה פשוטה למדי זו היא להבטיח שכל צעד מבוצע באופן משוחזר כדי לייעל את התשואה והטוהר של התאים. ישנם שלבים מרובים שיש להשלים לבידוד מוצלח של התאים. כמה מהצעדים קלים יותר להבנה אם הם נצפו באופן חזותי.כדי לבודד תאים של שרירים אנושיים מרקמה ביופסית, מניחים את רקמת השריר בצלחת פטרי סטרילית בתנאים סטריליים, ולהשתמש באזמל סטרילי כדי לטחון את הרקמה לחתיכות קוביות של מילימטר אחד. כאשר כל הרקמה כבר טחון, להעביר את החלקים לתוך צינור 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של PBS, ולאפשר את הרקמות להתיישב על ידי כוח הכבידה לפני בזהירות שאף את העל טבעי מבלי להפריע לרקמה. לאחר שטיפת שברים בפעם השנייה כפי שהודגם רק, להחליף את PBS עם 10 מיליליטר של דל גלוקוז Dulbecco של דל גלוקוז שונה הנשר מדיום.הסר את העל-טבעי לאחר שהרקמות יושבו, ולחץ מחדש על החלקים בשלושה מיליליטר של מדיום עיכול. מניחים את הרקמות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, עם טריטורציה של שברי השריר כל 10 דקות עם פיפטה סרולוגית מיליליטר אחד. בסוף הדגירה, להוסיף 83 microliters של מדיום עיכול נוסף 24 microliters של פתרון Dispase לדגימות, ו triturate את הרקמות כל חמש עד 10 דקות עם קצה פיפטה רחב נשא עד תרחיף אחיד מושגת.תרחיף אחיד חשוב להתאוששות מקסימלית של תאי העורף של השריר האנושי. המשך לעיכול אם תרחיף לא עובר דרך קצה פיפס סטנדרטי 1, 000 מיקרוליטר. כדי לבודד את התאים החיוביים Pax7, כתם ושער התאים על פי הפרוטוקול.מיין את CD56, CD29 כפול חיובי תאי שריר אנושי על ציטומטר זרימה עם זרבובית 100 מיקרומטר בלחץ של 20 פאונד לאינץ 'מרובע לתוך צינורות איסוף המכיל כרית 300 מיקרוליטר של חיץ מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות. ואז לזרוע את תאי הצאצאים שריר אנושי ממוין לתוך צלחות מצופה קולגן 24 באר המכיל מדיום צמיחה מחומם מראש ב 3.5 פעמים 10 לתאים הרביעיים ריכוז בריבוע סנטימטר. לביצוע סריקות קונפלונס, העמיסו את הלוח על ציטומטר הדמיה ובחרו 'צור סריקה חדשה' ו'קטגוריית לוח', 'פרופיל לוח' ו-Plate ID.Under Application, בחרו 'קונפלונס' ו'קונפלונס 1' ובחרו באר להצגה.אתר מישור מיקוד שבו התאים נראים לבנים בהשוואה לרקע ובחר רשום ידנית. השתמש בעכבר כדי לסמן את כל בארות שיש לסרוק, ובחר התחל סריקה. כל אזור באר ייסרקו באופן אוטומטי.בחר את הגדרות הניתוח האופטימליות עבור סוג הלוח והתא ובחר התחל ניתוח. השתמש בציטומטר ההדמיה כדי למדוד קונפלונס בתחילה. לאחר מכן לספור את התאים על ציטומטר ההדמיה, להחליף את המדיום בכל באר עם 200 microliters של פתרון הכתמים.לאחר 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, להחליף את פתרון הכתמים עם 100 microliters של F12 של האם טרי. החזירו את הלוח לציטומטר ההדמיה, ותחת יישום, בחרו 'כדאיות תא' ו'סה"כ חי מת'. הערוץ החי יהיה תמונת שדה בהיר, הערוץ המת יראה את הכתמת הפרופידיום יודיד, וערוץ סה"כ יהיה הכתמת Hoechst 33342.תחת הגדרת מיקוד, לחץ על רשום אוטומטית. תחת הערוץ סכום כולל, הגדר את הערוץ לכחול. השתמשו ב'חפש מוקד' כדי להביא את הגרעינים לפוקוס ולחצו על 'הגדר היסט' לבחירת המוקד.תחת הערוץ Dead, הגדר את הערוץ לאדום ולהשתמש ב'חפש מוקד' כדי להתמקד בתאים המתים. לחצו על 'הגדר היסט' לבחירת המוקד ובחרו 'התחל סריקה' כדי להתחיל בסריקה. לאחר מכן בחרו בפרמטרי הניתוח המתאימים לסוג הלוח והתא ובחרו 'התחל ניתוח' כדי להתחיל בניתוח.לאחר השלמת הניתוח, ודא באופן חזותי שהניתוח ספר כראוי את התאים. אם הסריקה והניתוח משביעי רצון, החזירו את הלוחית לאנקובטור, סרקו או שנו מחדש את פרמטרי הניתוח. תאי גוף שריר אנושי יכול להיות מזוהה על ידי אירועי gating הראשון מבוסס על אזור פיזור בצד קדימה כדי לחסל תאים מתים או פסולת, ואחריו בחירת רק את התאים שליליים עבור 7-AAD ולכן הם קיימא.התאים החיוביים הן עבור סמני משטח תא CD56 והן עבור סמני משטח תא CD29 מייצגים את אוכלוסיית תאי הצאצא של השריר האנושי. תאי אביהם של השרירים האנושיים יכולים להיות מזוהים גם על ידי ביטוי Pax7 שלהם. ואכן, Pax7 מועשר באוכלוסייה הכוללת לאחר FACS ומתוחזק באמצעות מעברים מרובים.כאן, מוצגת סריקת קונפלונס מייצגת. קווי המתאר הירוקים נוצרו על ידי ציטומטר ההדמיה ומראים כיצד ציטומטר ההדמיה קבע את הקונפלונס בהתבסס על הגדרות הניתוח שנבחרו. ספירת הטרוגניות וגרעין נפוצה בין תורמים.גילוי ואפיון מדויק של הטרוגניות זו הוא יישום מפתח של ציטומטר ההדמיה. מדידות הקונפלונס וספירת הגרעינים מתורמים ייחודיים, לעומת זאת, מתואמים מאוד. תאי אבי שרירים אנושיים מובחנים כדי ליצור myotubes ניתן להבחין על ידי ביטוי שרשרת מיוסין העוברי שלהם כבד.חשוב להיות עקבי בעת בחירת הפרמטרים gating על ציטומטר זרימה על מנת לבודד את אותה אוכלוסייה של תאים מכל תורם. לאחר מבודד, תאי צאצא שריר אנושי יכול לשמש למטרות מרובות, כולל זיהוי הדרישות המטבוליות הייחודיות של התפשטות והתבוללות של תאים מולדים שריר אנושי. הבידוד של תאי הצאצא של השריר האנושי איפשר אפליה של ההבדלים בביטוי סמן פני השטח של התא על תאי הצאצא של שרירי האדם והעכבר.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

בידוד של תאי גזע / עצביים מהאזור סביב חדרי המוח של העכברוש למבוגרים וחוט השדרה אנושי

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

באמצעות מבודד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות נשימה microplate תפוקה הגבוה

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

הכנה והתרבות של תאים מבשר myogenic / ראשי myoblasts מן שרירי השלד של מבוגר ובני אדם בני

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

יישום של גירוי כרוני ללמוד עיבודים פנוטיפי של שרירי השלד כויץ הנוצרות על-ידי פעילות עכברוש

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

זיהוי של שרירי השלד תאים הלוויין על-ידי Immunofluorescence עם Pax7 ו- Laminin נוגדנים

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

ביצוע שריר השלד האנושי Xenografts בעכברים חיסוני

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...