Name: isolation, culture, characterization, and differentiation of human muscle progenitor cells from the skeletal muscle biopsy procedure
Uploaded: 2019-08-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure at JoVE.com

Gli autori ringraziano la Cornell University, Biotechnology Resource Center Imaging Facility per il loro aiuto con lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza. Ringraziamo anche Molly Gheller per il suo aiuto con il reclutamento dei partecipanti ed Erica Bender per aver condotto le biopsie muscolari scheletriche. Infine, ringraziamo i partecipanti per il loro tempo e la partecipazione allo studio. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute on Aging of the National Institutes of Health con il award number R01AG058630 (a B.D.C. e A.E.T.), da una Glenn Foundation for Medical Research e dalla American Federation for Aging Research Grant for Junior Faculty (a B . D.C.), e dal Consiglio del Presidente per cornell Women (a.E.T.).

Questo protocollo è stato approvato dall'Institutional Review Board della Cornell University. Tutti i partecipanti sono stati esaminati per le condizioni di salute sottostanti e hanno dato il consenso informato.
1. Ottenere tessuto muscolare umano tramite la biopsia muscolare scheletrica
<ol><li>Identificare il muscolo laterale vasto tramite palpazione, punti di riferimento anatomici e contrazione attiva del muscolo.</li>
	<li>Palpate il vasto lateralis facendo stringere al partecipante il ...

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>D'Souza, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+satellite+cell+number+and+function+in+humans+and+mice+with+type+1+diabetes+is+the+result+of+altered+notch+signaling.">Decreased satellite cell number and function in humans and mice with type 1 diabetes is the result of altered notch signaling.</a> Diabetes. 65 (10), 3053-3061 (2016).</li><li>Scheele, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+derived+from+Obese+humans+with+type+2+diabetes+and+differentiated+into+Myocytes+in+vitro+exhibit+abnormal+response+to+IL-6.">Satellite cells derived from Obese humans with type 2 diabetes and differentiated into Myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6.</a> PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).</li><li>Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+capacity+of+human+muscle+progenitor+cells+differs+by+age,+sex,+and+metabolic+fuel+preference.">Expansion capacity of human muscle progenitor cells differs by age, sex, and metabolic fuel preference.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 315 (5), C643-C652 (2018).</li><li>Charville, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+and+in+vivo+self-renewal+of+human+muscle+stem+cells.">Ex vivo expansion and in vivo self-renewal of human muscle stem cells.</a> Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).</li><li>Alexander, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD82+Is+a+Marker+for+Prospective+Isolation+of+Human+Muscle+Satellite+Cells+and+Is+Linked+to+Muscular+Dystrophies.">CD82 Is a Marker for Prospective Isolation of Human Muscle Satellite Cells and Is Linked to Muscular Dystrophies.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 800-807 (2016).</li><li>Thalacker-Mercer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cluster+analysis+reveals+differential+transcript+profiles+associated+with+resistance+training-induced+human+skeletal+muscle+hypertrophy.">Cluster analysis reveals differential transcript profiles associated with resistance training-induced human skeletal muscle hypertrophy.</a> Physiological Genomics. 45 (12), 499-507 (2013).</li><li>Garcia, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Yield+Purification,+Preservation,+and+Serial+Transplantation+of+Human+Satellite+Cells.">High-Yield Purification, Preservation, and Serial Transplantation of Human Satellite Cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 1160-1174 (2018).</li><li>Yokoyama, W. M., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+thawing+of+cells.">Cryopreservation and thawing of cells.</a> Current Protocols in Immunology. , (2012).</li><li>Bareja, A., Billin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+therapy+-+from+mice+to+men.">Satellite cell therapy - from mice to men.</a> Skeletal Muscle. 3 (1), 2 (2013).</li><li>Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+profile+distinguishes+variability+in+human+myogenic+progenitor+cell+expansion+capacity.">Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity.</a> Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Satellite+Cell+Transplantation+and+Regeneration+from+Diverse+Skeletal+Muscles.">Human Satellite Cell Transplantation and Regeneration from Diverse Skeletal Muscles.</a> Stem Cell Reports. 5 (3), 419-434 (2015).</li></ol>

Gli HMCC primari sono un importante modello di ricerca utilizzato per comprendere la biologia muscolare scheletrica e il processo rigenerativo. Inoltre, gli HMPC hanno il potenziale per essere utilizzati per la terapia. Tuttavia, ci sono sfide riconosciute nell'utilizzo di hMPC primari e terapeutici, compresa la comprensione limitata delle cellule derivate dagli esseri umani10. C'è anche un grande grado di variazione nella capacità di espansione tra le colture dei donatori, che limita il potenzi...

Il muscolo scheletrico è il più grande sistema di organi nel corpo umano, che rappresenta il 30-40% di tutta la massa corporea1. Oltre al suo ruolo ben riconosciuto nella locomozione, il muscolo scheletrico mantiene la temperatura corporea e la postura e svolge un ruolo centrale nell'omeostasi nutritiva di tutto il corpo. La ricerca che coinvolge partecipanti umani, animali e modelli di coltura cellulare sono tutti preziosi per affrontare le domande relative alla biologia muscolare scheletrica e alla rigenerazione. L'isolamento e la coltura delle cellule progenitrici muscolari primarie umane (hMCC) fornisce un modello robusto che consente di applicare tecniche e manipolazioni della coltura cellulare a campioni umani. Un vantaggio dell'uso di hMPC è che mantengono il fenotipo genetico e metabolico da ciascun donatore2,3. La manutenzione del fenotipo del donatore consente ai ricercatori di esaminare la variazione inter-individuale nel processo miogenico. Ad esempio, abbiamo impiegato il nostro metodo di caratterizzazione hMPC per identificare le differenze legate all'età e al sesso nella capacità di espansione della popolazione di hMPC4.
Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere in dettaglio le tecniche per isolare, cultura, caratterizzare e differenziare gli HMP Dal tessuto della biopsia muscolare scheletrica. Basandosi su un lavoro precedente che descriveva gli HMPC e identificava i potenziali produttori di superfici cellulari per l'isolamento hMPC5,6, questo protocollo colma una lacuna critica nella conoscenza collegando l'isolamento alla caratterizzazione degli hMPC. Inoltre, le istruzioni dettagliate fornite in questo protocollo rendono l'isolamento e la caratterizzazione hMPC accessibili a un vasto pubblico scientifico, comprese quelle con un'esperienza precedente limitata con gli HMPC. Il nostro protocollo è tra i primi a descrivere l'uso di un citometro di imaging per tracciare le popolazioni cellulari. I citometri di imaging di nuova progettazione sono all'avanguardia, ad alta produttività e a base di microlamiche, consentendo l'imaging delle cellule vive, il conteggio delle celle e l'analisi della fluorescenza multicanale di tutte le celle in ogni pozzo di un vaso di coltura in pochi minuti. Questo sistema consente una rapida quantificazione dei cambiamenti dinamici nella proliferazione e nella vitalità di un'intera popolazione cellulare con solo una minima interruzione della cultura. Ad esempio, siamo in grado di eseguire misure oggettive di confluenza nei giorni successivi in vitro per determinare la cinetica di crescita di ogni cultura derivata da diversi donatori. Molti protocolli in letteratura, in particolare quelli che comportano la differenziazione dei MPC, richiedono alle cellule di raggiungere un livello definito di confluenza prima di iniziare la differenziazione o il trattamento7. Il nostro metodo consente una determinazione oggettiva della confluenza di ogni pozzo in un vaso di coltura che consente ai ricercatori di iniziare il trattamento in modo imparziale e non soggettivo.
In passato, una delle principali limitazioni dell'uso di HMPC primarie era la bassa resa che limitava il numero di cellule disponibili per gli esperimenti. Noi e altri abbiamo mostrato che la resa di MPC dal tessuto della biopsia muscolare scheletrica è di 1/15 MPC per milligrammo di tessuto (Figura 1)8. Poiché il nostro protocollo consente quattro passaggi delle cellule prima della purificazione con la fluorescenza activated cell sorting (FACS), le nostre rese hMPC crioconservate, derivate da piccole quantità di tessuto biopsia (50-100 mg), sono sufficienti per affrontare gli obiettivi di ricerca dove sono necessari più esperimenti. Il nostro protocollo FACS produce una popolazione MPC pura (Pax7 positiva) di 80 dollari, quindi il nostro protocollo è ottimizzato sia per la resa che per la purezza.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-053-Cl</td>
			<td>Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>664160</td>
			<td>Plates used for culturing hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture plate</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>662 160</td>
			<td>Plates used for culturing hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD Viability Staining Solution</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-6993-50</td>
			<td>Viability stain for identifying living cells during FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303016</td>
			<td>Conjugated antibody for FACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well cell culture plate</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>655079</td>
			<td>96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo S</td>
			<td>Nexcelcom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Imaging cytometer used to track hMPC cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352350</td>
			<td>Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (Rat Tail)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Collagen for coating cell culture plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 088 882 001</td>
			<td>Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>WN182</td>
			<td>Used for cryopreservation of hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>D4693</td>
			<td>A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium Low Glucose powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600-034</td>
			<td>Low glucose DMEM for muscle biopsy processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td>PBS for muscle biopsy processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4040-01&#160;</td>
			<td>Required for FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-186&#160;</td>
			<td>Fetal bovine serum used for hMPC growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21700-026</td>
			<td>Base media for hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Equine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26-050-070</td>
			<td>Horse serum used to make hMPC differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>iNCyto</td>
			<td>DHC-N0105</td>
			<td>Used to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1247501</td>
			<td>Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H21492</td>
			<td>DNA stain for identifying all cells using the Celigo S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416P-4</td>
			<td>Used for controlled rate freezing of hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi buffer</td>
			<td>Orflo</td>
			<td>MXA006</td>
			<td>Buffer for automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Cassettes</td>
			<td>Orflo</td>
			<td>MXC002</td>
			<td>Cassesttes for automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi z Mini Automated Cell Counter</td>
			<td>Orflo</td>
			<td></td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Commerically available controlled rate cell freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50062Z</td>
			<td>Goat serum used in FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557747</td>
			<td>Conjugated antibody for FACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Antibiotics added to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td>DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human basic fibroblast growth factor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5071</td>
			<td>Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12648-010</td>
			<td>Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-3</td>
			<td>Added to Ham&#39;s F12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Round Bottom 5 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-565</td>
			<td>Tubes used for FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td>Compensation beads fort calibrating flow FACS settings</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, characterization, and differentiation of human muscle progenitor cells from the skeletal muscle biopsy procedure

L'uso di tessuti e cellule primarie è ideale per lo studio di processi biologici e fisiologici come il processo rigenerativo muscolare scheletrico. Ci sono sfide riconosciute nel lavorare con le cellule staminali adulte primarie umane, in particolare le cellule progenitrici del muscolo umano (hMC) derivate da biopsie muscolari scheletriche, tra cui un basso rendimento cellulare dal tessuto raccolto e un ampio grado di eterogeneità dei donatori parametri di crescita e di morte tra le culture. Pur incorporando l'eterogeneità nella progettazione sperimentale è necessaria una dimensione del campione più grande per rilevare effetti significativi, ci permette anche di identificare i meccanismi che sono alla base della variabilità nella capacità di espansione di hMPC, e quindi ci permette di comprendere meglio l'eterogeneità nella rigenerazione muscolare scheletrica. Nuovi meccanismi che distinguono la capacità di espansione delle colture hanno il potenziale per portare allo sviluppo di terapie per migliorare la rigenerazione muscolare scheletrica.

I risultati rappresentativi della citometria di flusso dell'isolamento da hMPC dal tessuto muscolare umano possono essere visualizzati nella Figura 1. Gli hMPC possono essere identificati mediante i primi eventi basati sulla dispersione laterale e sulla dispersione in avanti per eliminare le cellule morte o i detriti, seguiti dalla selezione solo delle cellule che sono negative per 7-AAD e quindi sono vitali. La selezione delle celle positive per entrambi i m...

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Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Presentiamo tecniche per isolare, coltivare, caratterizzare e differenziare le cellule progenitrici muscolari primarie umane (hMMP) ottenute dal tessuto della biopsia muscolare scheletrica. Gli hMPC ottenuti e caratterizzati attraverso questi metodi possono essere utilizzati per affrontare successivamente le domande di ricerca relative alla miogenesi umana e alla rigenerazione muscolare scheletrica.

Isolamento, cultura, caratterizzazione e differenziazione delle cellule del progenitore muscolare umano dalla procedura di biopsia muscolare scheletrica

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Isolare le cellule progenitrici muscolari umane che regolano la rigenerazione muscolare scheletrica ci consente di indagare processi che sono alla base del processo rigenerativo pur mantenendo la variabilità del donatore. Questa tecnica consente di ottenere grandi rese di cellule progenitrici muscolari umane da piccole quantità di tessuto e la loro analisi fenotipico utilizzando un piccolo numero di cellule. Questo metodo è specificamente progettato per isolare le cellule progenitrici muscolari umane per tracciare le loro capacità di proliferazione e differenziazione e per correlare questi dati al processo rigenerativo muscolare scheletrico.L'aspetto più difficile di questa tecnica abbastanza semplice è garantire che ogni passaggio sia eseguito in modo riproducibile per ottimizzare la resa e la purezza delle cellule. È necessario completare più passaggi per un corretta isolamento delle celle. Molti dei passaggi sono più facili da capire se vengono osservati visivamente.Per isolare le cellule progenitrici muscolari umane dal tessuto della biopsia, posizionare il tessuto muscolare in una piastra di Petri sterile in condizioni sterili e utilizzare un bisturi sterile per tritare il tessuto in pezzi a cubetti di un millimetro. Quando tutto il tessuto è stato tritato, trasferire i pezzi in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di PBS e lasciare che i tessuti si sistemino per gravità prima di aspirare attentamente il supernatante senza disturbare il tessuto. Dopo aver lavato i frammenti una seconda volta come appena dimostrato, sostituire il PBS con 10 millilitri di mezzo Eagle modificato di Dulbecco a basso glucosio.Rimuovere il supernatante dopo che i tessuti sono stati sistemati e rimescolare i pezzi in tre millilitri di mezzo di digestione. Posizionare i tessuti a 37 gradi Celsius per 30 minuti, con triturazione dei frammenti muscolari ogni 10 minuti con una pipetta sierologica da un millilitro. Al termine dell'incubazione, aggiungere 83 microlitri di mezzo di digestione aggiuntivo e 24 microlitri di soluzione di dispasi ai campioni e triturare i tessuti ogni cinque-10 minuti con una punta di pipetta a foro largo fino a ottenere un liquame uniforme.Un liquame uniforme è importante per il massimo recupero delle cellule progenitrici muscolari umane. Continuare la digestione se il liquame non passa attraverso una punta standard di pipetta da 1.000 microliter. Per isolare le cellule positive di Pax7, macchiare e gateare le cellule secondo il protocollo.Ordinare le cellule progenitrici muscolari umane doppie positive CD56, CD29 su un citometro a flusso con un ugello da 100 micrometri a una pressione di 20 libbre per pollice quadrato in tubi di raccolta contenenti un cuscino da 300 microliter di tampone di smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza. Quindi seminare le cellule progenitrici muscolari umane ordinate in piastre di 24 po 'rivestite di collagene contenenti mezzo di crescita pre-riscaldato a una concentrazione quadrata 3,5 per 10 alla quarta parte per centimetro. Per eseguire scansioni di confluenza, caricare la piastra su un citometro di imaging e selezionare Crea nuova scansione e categoria piastra, profilo piastra e ID piastra.In Applicazione selezionare Confluenza e Confluenza 1 e selezionare un pozzo da visualizzare.Individuare un piano di messa a fuoco in cui le celle appaiono bianche rispetto allo sfondo e selezionare Registra manuale. Utilizzare il mouse per evidenziare tutti i pozzali da analizzare e selezionare Avvia analisi. L'intera area del pozzo verrà scansionata automaticamente.Selezionate le impostazioni di analisi ottimali per il tipo di piastra e cella e selezionate Avvia analisi (Start Analysis). Utilizzare il citometro di imaging per misurare inizialmente la confluenza. Quindi, per contare le cellule sul citometro di imaging, sostituire il mezzo in ogni pozzo con 200 microlitri di soluzione di colorazione.Dopo 15 minuti a 37 gradi Celsius, sostituire la soluzione di colorazione con 100 microlitri di F12 di prosciutto fresco. Riportare la piastra al citometro di imaging e in Applicazione selezionare Vitalità cella e Totale morto vivo. Il canale Live sarà un'immagine a campo luminoso, il canale Dead mostrerà la colorazione del propidio ioduro e il canale Totale sarà la colorazione Hoechst 33342.In Configurazione messa a fuoco fare clic su Registra automaticamente. Sotto il canale Totale, impostare il canale su blu. Utilizzate Trova messa a fuoco (Find Focus) per mettere a fuoco i nuclei e fate clic su Imposta offset (Set Offset) per selezionare lo stato attivo.Sotto il canale Morto, imposta il canale su rosso e usa Trova messa a fuoco per mettere a fuoco le celle morte. Fate clic su Imposta offset (Set Offset) per selezionare lo stato attivo e selezionate Avvia analisi (Start Scan) per avviare l'analisi. Selezionare quindi i parametri di analisi appropriati per il tipo di piastra e cella e selezionare Avvia analisi per avviare l'analisi.Al termine dell'analisi, verificare visivamente che l'analisi conterà in modo appropriato le celle. Se la scansione e l'analisi sono soddisfacenti, restituire la piastra all'incubatore, altrimenti riscansare o modificare i parametri di analisi. Le cellule progenitrici muscolari umane possono essere identificate da primi eventi di gating basati sull'area di dispersione laterale e anteriore per eliminare cellule morte o detriti, seguiti selezionando solo le cellule che sono negative per 7-AAD e quindi sono vitali.Le cellule positive sia per i marcatori di superficie cellulare CD56 che CD29 rappresentano quindi la popolazione cellulare progenitrice muscolare umana. Le cellule progenitrici muscolari umane possono anche essere identificate dalla loro espressione Pax7. In effetti, Pax7 è arricchito nella popolazione totale dopo facs e viene mantenuto attraverso più passaggi.Qui viene mostrata una scansione di confluenza rappresentativa. I contorni verdi sono stati generati dal citometro di imaging e mostrano come il citometro di imaging ha determinato la confluenza in base alle impostazioni di analisi selezionate. Un'eterogeneità e un conteggio dei nuclei è comune tra i donatori.Scoprire e caratterizzare accuratamente questa eterogeneità è un'applicazione chiave del citometro di imaging. Le misurazioni della confluenza e il conteggio dei nuclei da donatori unici, tuttavia, sono altamente correlati. Le cellule progenitrici muscolari umane differenziate per formare miotubi possono essere distinte per la loro espressione della catena pesante della miosina embrionale.È importante essere coerenti quando si selezionano i parametri di gating sul citometro di flusso al fine di isolare la stessa popolazione di cellule da ogni donatore. Una volta isolate, le cellule progenitrici muscolari umane possono essere utilizzate per molteplici scopi, tra cui l'identificazione dei requisiti metabolici unici di proliferazione e differenziazione delle cellule progenitrici muscolari umane. L'isolamento delle cellule progenitrici muscolari umane ha permesso la discriminazione delle differenze nell'espressione del marcatore della superficie cellulare sulle cellule progenitrici muscolari umane e del topo.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolamento e quantitativa immunocitochimica caratterizzazione di cellule miogeniche primarie e fibroblasti da muscolo scheletrico umano

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Isolamento di Neural cellule staminali / progenitrici dalla Regione periventricolare del ratto adulto e midollo spinale umano

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

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