Name: isolation, culture, characterization, and differentiation of human muscle progenitor cells from the skeletal muscle biopsy procedure
Uploaded: 2019-08-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure at JoVE.com

Авторы благодарят Корнельский университет, биотехнологический ресурсный центр Imaging Facility за помощь в флуоресценции активированной сортировки клеток. Мы также благодарим Молли Геллер за помощь в наборе участников и Эрику Бендер за проведение биопсии скелетных мышц. Наконец, мы благодарим участников за их время и участие в исследовании. Эта работа была поддержана Национальным институтом по проблемам старения Национальных институтов здравоохранения под премией Номер R01AG058630 (до B.D.C. и A.E.T.), Фондом Гленн для медицинских исследований и Американской федерацией старения научно-исследовательского гранта для младших факультетов (до B . округ Колумбия), а также Президентским советом по корнелльским женщинам (в А.Э.Т.).

Этот протокол был одобрен Институциональным наблюдательным советом Корнельского университета. Все участники были проверены на основные состояния здоровья и дали информированное согласие.
1. Получение мышечной ткани человека через биопсию скелетных мышц
<ol><li>Определи...

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>D'Souza, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+satellite+cell+number+and+function+in+humans+and+mice+with+type+1+diabetes+is+the+result+of+altered+notch+signaling.">Decreased satellite cell number and function in humans and mice with type 1 diabetes is the result of altered notch signaling.</a> Diabetes. 65 (10), 3053-3061 (2016).</li><li>Scheele, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+derived+from+Obese+humans+with+type+2+diabetes+and+differentiated+into+Myocytes+in+vitro+exhibit+abnormal+response+to+IL-6.">Satellite cells derived from Obese humans with type 2 diabetes and differentiated into Myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6.</a> PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).</li><li>Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+capacity+of+human+muscle+progenitor+cells+differs+by+age,+sex,+and+metabolic+fuel+preference.">Expansion capacity of human muscle progenitor cells differs by age, sex, and metabolic fuel preference.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 315 (5), C643-C652 (2018).</li><li>Charville, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+and+in+vivo+self-renewal+of+human+muscle+stem+cells.">Ex vivo expansion and in vivo self-renewal of human muscle stem cells.</a> Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).</li><li>Alexander, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD82+Is+a+Marker+for+Prospective+Isolation+of+Human+Muscle+Satellite+Cells+and+Is+Linked+to+Muscular+Dystrophies.">CD82 Is a Marker for Prospective Isolation of Human Muscle Satellite Cells and Is Linked to Muscular Dystrophies.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 800-807 (2016).</li><li>Thalacker-Mercer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cluster+analysis+reveals+differential+transcript+profiles+associated+with+resistance+training-induced+human+skeletal+muscle+hypertrophy.">Cluster analysis reveals differential transcript profiles associated with resistance training-induced human skeletal muscle hypertrophy.</a> Physiological Genomics. 45 (12), 499-507 (2013).</li><li>Garcia, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Yield+Purification,+Preservation,+and+Serial+Transplantation+of+Human+Satellite+Cells.">High-Yield Purification, Preservation, and Serial Transplantation of Human Satellite Cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 1160-1174 (2018).</li><li>Yokoyama, W. M., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+thawing+of+cells.">Cryopreservation and thawing of cells.</a> Current Protocols in Immunology. , (2012).</li><li>Bareja, A., Billin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+therapy+-+from+mice+to+men.">Satellite cell therapy - from mice to men.</a> Skeletal Muscle. 3 (1), 2 (2013).</li><li>Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+profile+distinguishes+variability+in+human+myogenic+progenitor+cell+expansion+capacity.">Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity.</a> Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Satellite+Cell+Transplantation+and+Regeneration+from+Diverse+Skeletal+Muscles.">Human Satellite Cell Transplantation and Regeneration from Diverse Skeletal Muscles.</a> Stem Cell Reports. 5 (3), 419-434 (2015).</li></ol>

Первичные HMPCs являются важной исследовательской моделью, используемой для понимания биологии скелетных мышц и регенеративного процесса. Кроме того, HMPCs имеют потенциал для использования для терапии. Тем не менее, Есть признанные проблемы в использовании первичных HMPCs для исследований ...

Скелетная мышца является крупнейшей органной системой в организме человека, накоторую приходится 30–40% массы всего тела 1. В дополнение к своей хорошо признанной роли в передвижении, скелетные мышцы поддерживает температуру тела и осанку, и играет центральную роль во всем теле питательных гомеостаза. Исследования с участием человеческих участников, животных и моделей клеточной культуры являются ценными для решения вопросов, касающихся биологии скелетных мышц и регенерации. Изоляция и культура клеток-прародителей мышц человека (HMPCs) обеспечивает надежную модель, которая позволяет использовать методы клеточной культуры и манипуляции в образцах человека. Преимущество использования HMPCs является то, что они сохраняют генетический и метаболический фенотип от каждого донора2,3. Поддержание донорского фенотипа позволяет исследователям исследовать межиндивидуальные различия в миогенном процессе. Например, мы использовали наш метод характеристикhMPC для выявления возрастных и половыхразличий в емкости расширения популяции hMPC 4.
Цель юма этого протокола состоит в том, чтобы подробно методы изолировать, культуры, охарактеризовать и дифференцировать HMPCs от скелетной мышечной биопсии ткани. Опираясь на предыдущую работу, которая описала HMPCs и определилпотенциальных создателей поверхности клеток для изоляции hMPC5,6, этот протокол заполняет критический пробел в знаниях, связывая изоляцию с характеристикой HMPCs. Кроме того, подробные пошаговые инструкции, включенные в этот протокол, делают изоляцию и характеристики hMPC доступными для широкой научной аудитории, в том числе с ограниченным опытом работы с ГМпС. Наш протокол является одним из первых, чтобы описать использование цитометра изображений для отслеживания популяций клеток. Недавно разработанные цитометры визуализации являются самыми современными, высокопроизводительными и микроплитными, что позволяет в течение нескольких минут анализировать живые клетки, подсчет клеток и многоканальный анализ флуоресценции всех клеток в каждой скважине сосуда культуры. Эта система позволяет быстро количественно измерять динамические изменения в пролинизации и жизнеспособности всей популяции клеток с минимальным нарушением культуры. Например, мы можем выполнять объективные показатели слияния в последующие дни в пробирке, чтобы определить кинетику роста каждой культуры, полученной от различных доноров. Многие протоколы в литературе, особенно те, с участием дифференциации ПДК, требуют клетки для достижения определенного уровня слияния до начала дифференциации или лечения7. Наш метод позволяет объективно определить слияние каждой скважины в сосуде культуры, что позволяет исследователям инициировать лечение беспристрастным, несубъективным образом.
В прошлом основным ограничением использования первичных ГМпС были низкие урожаи, ограничивающие количество клеток, доступных для экспериментов. Мы и другие показали, что выход ПДК из ткани биопсии скелетных мышц составляет 1–15 ПДК на миллиграмм ткани(рисунок 1)8. Поскольку наш протокол позволяет четыре прохода клеток до очистки с флуоресценцией активированной сортировки клеток (FACS), наши криоконсервированные урожаи hMPC, полученные из небольших количеств биопсии ткани (50-100 мг), достаточно для решения исследовательских целей, где требуется несколько экспериментов. Наш протокол FACS производит 80% чистой (Pax7 положительный) MPC населения, таким образом, наш протокол оптимизирован как для урожайности и чистоты.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-053-Cl</td>
			<td>Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>664160</td>
			<td>Plates used for culturing hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture plate</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>662 160</td>
			<td>Plates used for culturing hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD Viability Staining Solution</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-6993-50</td>
			<td>Viability stain for identifying living cells during FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303016</td>
			<td>Conjugated antibody for FACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well cell culture plate</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>655079</td>
			<td>96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo S</td>
			<td>Nexcelcom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Imaging cytometer used to track hMPC cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352350</td>
			<td>Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (Rat Tail)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Collagen for coating cell culture plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 088 882 001</td>
			<td>Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>WN182</td>
			<td>Used for cryopreservation of hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>D4693</td>
			<td>A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium Low Glucose powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600-034</td>
			<td>Low glucose DMEM for muscle biopsy processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td>PBS for muscle biopsy processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4040-01&#160;</td>
			<td>Required for FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-186&#160;</td>
			<td>Fetal bovine serum used for hMPC growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21700-026</td>
			<td>Base media for hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Equine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26-050-070</td>
			<td>Horse serum used to make hMPC differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>iNCyto</td>
			<td>DHC-N0105</td>
			<td>Used to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1247501</td>
			<td>Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H21492</td>
			<td>DNA stain for identifying all cells using the Celigo S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416P-4</td>
			<td>Used for controlled rate freezing of hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi buffer</td>
			<td>Orflo</td>
			<td>MXA006</td>
			<td>Buffer for automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Cassettes</td>
			<td>Orflo</td>
			<td>MXC002</td>
			<td>Cassesttes for automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi z Mini Automated Cell Counter</td>
			<td>Orflo</td>
			<td></td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Commerically available controlled rate cell freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50062Z</td>
			<td>Goat serum used in FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557747</td>
			<td>Conjugated antibody for FACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Antibiotics added to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td>DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human basic fibroblast growth factor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5071</td>
			<td>Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12648-010</td>
			<td>Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-3</td>
			<td>Added to Ham&#39;s F12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Round Bottom 5 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-565</td>
			<td>Tubes used for FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td>Compensation beads fort calibrating flow FACS settings</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, characterization, and differentiation of human muscle progenitor cells from the skeletal muscle biopsy procedure

Использование первичных тканей и клеток человека идеально подходит для исследования биологических и физиологических процессов, таких как регенеративный процесс скелетных мышц. Существуют признанные проблемы для работы с человеческими первичными взрослыми стволовыми клетками, особенно клетками-потомками человеческих мышц (HMPCs), полученными в результате биопсии скелетных мышц, включая низкую урожайность клеток из собранной ткани и большую степень неоднородности донора параметров роста и смертности между культурами. Хотя включение неоднородности в экспериментальную конструкцию требует большего размера выборки для обнаружения значительных эффектов, это также позволяет нам определить механизмы, которые лежат в основе изменчивости потенциала расширения HMPC, и, таким образом, позволяет нам лучше понять неоднородность в регенерации скелетных мышц. Новые механизмы, которые отличают расширение способности культур имеют потенциал, чтобы привести к развитию терапии для улучшения регенерации скелетных мышц.

Представитель потока цитометрии результаты hMPC изоляции от мышечной ткани человека можно рассматривать на рисунке 1. hMPCs могут быть определены путем первого gating событий, основанных на боковой рассеяния и вперед рассеяния для устранения мертвых клеток ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure at JoVE.com

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Мы представляем методы изоляции, культивирования, характеристики и дифференциации клеток-прародителей мышц человека (HMPCs), полученных из скелетной мышечной биопсии ткани. hMPCs, полученные и характеризуемые с помощью этих методов, могут быть использованы для последующего решения вопросов, связанных с исследованиями, связанными с миогенезом человека и регенерацией скелетных мышц.

Изоляция, Культура, Характеристика и Дифференциация клеток-прародителей мышц человека от процедуры биопсии скелетных мышц

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Изоляция клеток-предшественников мышц человека, которые регулируют регенерацию скелетных мышц, позволяет исследовать процессы, которые лежат в основе регенеративного процесса при сохранении изменчивости донора. Этот метод позволяет получить большие урожаи клеток-предшественников мышц человека из небольшого количества тканей и их фенотипического анализа с использованием небольшого количества клеток. Этот метод специально разработан, чтобы изолировать клетки-предшественники мышц человека, чтобы отслеживать их пролиферацию и дифференциацию возможностей и соотнести эти данные с регенеративным процессом скелетных мышц.Самым сложным аспектом этого довольно простого метода является обеспечение того, чтобы каждый шаг выполнялся воспроизводимо для оптимизации урожайности и чистоты клеток. Есть несколько шагов, которые должны быть завершены для успешной изоляции клеток. Некоторые из шагов легче понять, если они наблюдаются визуально.Чтобы изолировать клетки-предшественники мышц человека от биопсии ткани, поместите мышечную ткань в стерильную чашку Петри в стерильных условиях, и использовать стерильный скальпель, чтобы фарш ткани на один миллиметр кубированных частей. Когда все ткани были измельчены, передать куски в 15-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров PBS, и позволить тканям осесть под действием силы тяжести, прежде чем тщательно аспирировать супернатант, не нарушая ткани. После мытья фрагментов во второй раз, как только что продемонстрировано, заменить PBS с 10 миллилитров низко глюкозы Dulbecco модифицированных Eagle среды.Удалите супернатант после того, как ткани были урегулированы, и повторно поместить куски в три миллилитров пищеварения среды. Поместите ткани при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут, с тритурацией фрагментов мышц каждые 10 минут с одноми миллилитровой серологической пипеткой. В конце инкубации добавьте 83 микролитров дополнительной среды пищеварения и 24 микролитров раствора dispase в образцы и тритурировать ткани каждые пять-десять минут с широкой наконечником пипетки до тех пор, пока не будет достигнута однородная суспензия.Однородная суспензия важна для максимального восстановления клеток-предшественников мышц человека. Продолжить пищеварение, если суспензия не проходит через стандартный 1000-микролитровый наконечник пипетки. Изолировать Pax7-положительные клетки, пятно и ворота клеток в соответствии с протоколом.Сортировать CD56, CD29 двойной положительный человеческий мышцы прародителя клеток на поток цитометра с 100-микрометровой сопла под давлением 20 фунтов на квадратный дюйм в сбор труб, содержащих 300-микролитровую подушку флуоресценции активированных клеток сортировки буфера. Затем семя отсортированы человеческие клетки-предшественник мышцы в коллагена покрытием 24-хорошо пластин, содержащих предварительно разогретой среды роста в 3,5 раза от 10 до четвертой клетки на сантиметр квадратной концентрации. Для выполнения сканирования слияния загрузите пластину на цитометр изображения и выберите «Создайте новое сканирование и категорию плит, профиль плиты» и приложение Плиты ID.Under Application, выберите Confluence и Confluence 1 и выберите колодец для просмотра.Найдите плоскость фокусировки, в которой ячейки выглядят белыми по сравнению с фоном, и выберите Руководство по регистру. Используйте мышь, чтобы выделить все скважины, которые должны быть отсканированы, и выберите Start Scan. Вся зона хорошо будет автоматически отсканирована.Выберите параметры анализа, оптимальные для типа пластины и ячейки, и выберите стартовый анализ. Используйте цитометр изображения для измерения слияния на начальном этапе. Затем, чтобы подсчитать клетки на цитометре изображения, замените среду в каждой колодец 200 микролитров окрашивания раствора.Через 15 минут при 37 градусах по Цельсию замените окрашивающий раствор 100 микролитров свежего ветчины F12. Верните пластину в цитометр изображения, и в соответствии с приложением, выберите жизнеспособность клеток и Live Dead Total. Канал Live будет ярким полем изображения, мертвый канал покажет окрашивание йодида пропидия, а канал Total будет окрашивать Hoechst 33342.В рамках настройки фокусировки щелкните Register Auto. Под каналом Total установите канал на синий. Используйте Find Focus, чтобы привлечь ядра в фокус, и нажмите Set Offset, чтобы выбрать фокус.Под мертвым каналом установите канал на красный цвет и используйте Find Focus, чтобы привлечь внимание мертвых клеток. Нажмите Set Offset, чтобы выбрать фокус, и выберите Start Scan, чтобы начать сканирование. Затем выберите параметры анализа, подходящие для типа пластины и ячейки, и выберите стартовый анализ для начала анализа.Когда анализ завершен, визуально убедитесь, что анализ надлежащим образом подсчитал клетки. Если сканирование и анализ являются удовлетворительными, верните пластину в инкубатор, в противном случае пересканировать или изменить параметры анализа. Клетки-предшественники мышц человека могут быть идентифицированы с помощью первых событий, основанных на боковой и форвардной области рассеяния для устранения мертвых клеток или мусора, а затем выбрать только клетки, которые являются отрицательными для 7-AAD и, следовательно, являются жизнеспособными.Клетки, которые являются положительными для CD56 и CD29 маркеров поверхности клеток, то представляют человека мышечной популяции клеток-предшественников. Клетки-предшественники мышц человека также могут быть идентифицированы по выражению Pax7. Действительно, Pax7 обогащается в общей численности населения после FACS и поддерживается через несколько проходов.Здесь отображается репрезентативное сканирование слияния. Зеленые очертания были сгенерированы цитометром изображения и показывают, как цитометр изображения определял слияние на основе выбранных параметров анализа. Неоднородность и количество ядер является общим между донорами.Обнаружение и точное характеристика этой неоднородности является ключевым применением цитометра изображений. Однако измерения слияния и количество ядер от уникальных доноров в значительной степени коррелируют друг с тем. Клетки-предшественники мышц человека, дифференцированные по форме миотрубов, можно отличить по их эмбриональному выражению тяжелой цепи миозин.Важно быть последовательным при выборе параметров gating на цитометре потока, чтобы изолировать ту же популяцию клеток от каждого донора. После изоляции клетки-предшественники мышц человека могут быть использованы для различных целей, включая выявление уникальных метаболических требований к пролиферации и дифференциации клеток-предшественников мышц человека. Изоляция клеток-предшественников мышц человека позволила различий в выражении маркера поверхности клетки на клетках-предшественниках мышц человека и мыши.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Выделение и количественный Иммуноцитохимическая Характеристика первичных Миогенные клеток и фибробластов из человеческих скелетных мышц

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Выделение стволовых нервных / клеток-предшественников из Перивентрикулярные региона взрослых крыс и человека спинного мозга

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Использование изолированными митохондриями из минимальных количествах мыши скелетных мышц для Высокая пропускная MICROPLATE респираторных измерений

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Крупномасштабное производство кардиомиоцитов из человеческих плюрипотентных стволовых клеток с использованием высокой воспроизводимостью Малый протокол Дифференциация Molecule на основе

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Подготовка и культура Миогенный прогениторных клеток / Первичные миобластов из скелетной мышце взрослых и выдержана Людей

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Изоляции клеток эндотелия прародителем от человеческой пуповинной крови

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Применение хронической стимуляции для изучения сократительной активности индуцированной крыса скелетных мышц Фенотипическая адаптация

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Идентификации Спутниковое клеток скелетных мышц, иммунофлюоресценции с Pax7 и Ламинин антител

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Выполнение человеческих скелетных мышц ксенотрансплантатов в иммунодефицитных мышей

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...