Name: isolation, culture, characterization, and differentiation of human muscle progenitor cells from the skeletal muscle biopsy procedure
Uploaded: 2019-08-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure at JoVE.com

Författarna tackar Cornell University, bioteknik Resource Center Imaging anläggning för deras hjälp med fluorescens aktiverad cell sortering. Vi tackar även Molly Gheller för hennes hjälp med deltagar rekrytering och Erica Bender för att utföra skelettmuskulaturen biopsier. Slutligen tackar vi deltagarna för deras tid och deltagande i studien. Detta arbete stöddes av det nationella institutet för åldrande av National Institutes of Health under tilldelning nummer R01AG058630 (till B.D.C. och A.E.T.), av en Glenn stiftelse för medicinsk forskning och American Federation for aging forskningsbidrag för Junior fakultet (till B . D.C.), och av presidentens råd för Cornell Women (till A.E.T.).

Detta protokoll godkändes av den institutionella Granskningsnämnden vid Cornell University. Alla deltagare screenades för underliggande hälsotillstånd och gav informerat samtycke.
1. få mänsklig muskelvävnad via skelettmuskulaturen biopsi
<ol><li>Identifiera vastus lateralis muskeln via palpation, anatomiska landmärken och aktiv sammandragning av muskeln.</li>
	<li>Palpate den vastus lateralis genom att ha deltagaren skärpa sina quadriceps muskler och hitta magen av muskeln, om 1/3...

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>D'Souza, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+satellite+cell+number+and+function+in+humans+and+mice+with+type+1+diabetes+is+the+result+of+altered+notch+signaling.">Decreased satellite cell number and function in humans and mice with type 1 diabetes is the result of altered notch signaling.</a> Diabetes. 65 (10), 3053-3061 (2016).</li><li>Scheele, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+derived+from+Obese+humans+with+type+2+diabetes+and+differentiated+into+Myocytes+in+vitro+exhibit+abnormal+response+to+IL-6.">Satellite cells derived from Obese humans with type 2 diabetes and differentiated into Myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6.</a> PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).</li><li>Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+capacity+of+human+muscle+progenitor+cells+differs+by+age,+sex,+and+metabolic+fuel+preference.">Expansion capacity of human muscle progenitor cells differs by age, sex, and metabolic fuel preference.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 315 (5), C643-C652 (2018).</li><li>Charville, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+and+in+vivo+self-renewal+of+human+muscle+stem+cells.">Ex vivo expansion and in vivo self-renewal of human muscle stem cells.</a> Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).</li><li>Alexander, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD82+Is+a+Marker+for+Prospective+Isolation+of+Human+Muscle+Satellite+Cells+and+Is+Linked+to+Muscular+Dystrophies.">CD82 Is a Marker for Prospective Isolation of Human Muscle Satellite Cells and Is Linked to Muscular Dystrophies.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 800-807 (2016).</li><li>Thalacker-Mercer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cluster+analysis+reveals+differential+transcript+profiles+associated+with+resistance+training-induced+human+skeletal+muscle+hypertrophy.">Cluster analysis reveals differential transcript profiles associated with resistance training-induced human skeletal muscle hypertrophy.</a> Physiological Genomics. 45 (12), 499-507 (2013).</li><li>Garcia, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Yield+Purification,+Preservation,+and+Serial+Transplantation+of+Human+Satellite+Cells.">High-Yield Purification, Preservation, and Serial Transplantation of Human Satellite Cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 1160-1174 (2018).</li><li>Yokoyama, W. M., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+thawing+of+cells.">Cryopreservation and thawing of cells.</a> Current Protocols in Immunology. , (2012).</li><li>Bareja, A., Billin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+therapy+-+from+mice+to+men.">Satellite cell therapy - from mice to men.</a> Skeletal Muscle. 3 (1), 2 (2013).</li><li>Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+profile+distinguishes+variability+in+human+myogenic+progenitor+cell+expansion+capacity.">Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity.</a> Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Satellite+Cell+Transplantation+and+Regeneration+from+Diverse+Skeletal+Muscles.">Human Satellite Cell Transplantation and Regeneration from Diverse Skeletal Muscles.</a> Stem Cell Reports. 5 (3), 419-434 (2015).</li></ol>

Primära hMPCs är en viktig forskningsmodell som används för att förstå skelettmuskulaturen biologi och regenerativ process. Dessutom, hMPCs har potential att användas för behandling. Emellertid, det finns erkända utmaningar i att använda primära hMPCs för både forskning och terapi, inklusive begränsad förståelse av celler som härrör från människor10. Det finns också en stor grad av variation i expansions kapaciteten bland givar kulturer, vilket begränsar potentialen för anv?...

Skelettmuskulaturen är det största organsystemet i människokroppen, står för 30 − 40% av hela kroppen massa1. Förutom sin väl erkända roll i Locomotion, skelettmuskulaturen upprätthåller kroppstemperatur och hållning, och spelar en central roll i hela kroppen näringsämnen homeostas. Forskning som involverar mänskliga deltagare, djur och modeller cellkulturer är alla värdefulla för att ta itu med frågor som rör skelettmuskulaturen biologi och förnyelse. Isolering och kultur av mänskliga primära muskelstamceller (hMPCs) ger en robust modell som gör det möjligt för cellkulturer tekniker och manipulationer som skall tillämpas på mänskliga prover. Fördelen med att använda hmpcs är att de behåller den genetiska och metaboliska fenotypen från varje donator2,3. Underhåll av donatorns fenotyp gör det möjligt för forskarna att undersöka inter-individuell variation i den myogena processen. Till exempel har vi använt vår hMPC karakterisering metod för att identifiera ålder och kön-relaterade skillnader i hMPC populations expansion kapacitet4.
Syftet med detta protokoll är att detalj tekniker för att isolera, kultur, karakterisera, och differentiera hMPCs från skelettmuskel biopsi vävnad. Bygger på tidigare arbete som beskrivs hmpcs och identifierade potentiella cell ytan beslutsfattare för HMPC isolering5,6, detta protokoll fyller ett kritiskt gap i kunskap genom att koppla isoleringen till karakterisering av hmpcs. Vidare, detaljerade steg-för-steg-instruktioner som ingår i detta protokoll gör hMPC isolering och karakterisering tillgänglig för en bred vetenskaplig publik, inklusive de med begränsad tidigare erfarenhet av hMPCs. Vårt protokoll är bland de första som beskriver användningen av en avbildning flödescytometerns för att spåra cellpopulationer. Nydesignade Imaging flödescytometrar är State-of-the-art, hög genomströmning, och Microplate-baserade, möjliggör levande cell avbildning, cellräkning, och flerkanals fluorescens analys av alla celler i varje brunn av ett kultur fartyg inom några minuter. Detta system möjliggör en snabb kvantifiering av dynamiska förändringar i spridningen och livskraften hos en hel cellpopulation med endast minimala störningar i kulturen. Till exempel kan vi utföra objektiva mått av sammanflödet på på varandra följande dagar in vitro för att bestämma tillväxtkinetik av varje kultur som härrör från olika givare. Många protokoll i litteraturen, särskilt de som inbegriper differentiering av MPCs, kräver celler för att nå en definierad nivå av sammanflödet innan du påbörjar differentiering eller behandling7. Vår metod möjliggör objektiv bestämning av sammanflödet av varje brunn i ett kultur fartyg som gör det möjligt för forskare att initiera behandling på ett opartisk, icke-subjektivt sätt.
Tidigare var en stor begränsning av att använda primära hMPCs låg avkastning som begränsar antalet celler som är tillgängliga för experiment. Vi och andra har visat avkastningen av MPCs från skelettmuskel biopsi vävnad är 1 − 15 MPCs per milligram vävnad (figur 1)8. Eftersom vårt protokoll tillåter fyra passager av cellerna före rening med fluorescens aktiverad cell sortering (FACS), våra nedfrysta HMPC avkastning, som härrör från små mängder av biopsi vävnad (50 − 100 mg), är tillräckliga för att ta itu med forskningsmål där Det krävs flera experiment. Vår FACS-protokollet ger en ~ 80% ren (Pax7 positiv) MPC population, vilket vårt protokoll är optimerad för både avkastning och renhet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-053-Cl</td>
			<td>Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>664160</td>
			<td>Plates used for culturing hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture plate</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>662 160</td>
			<td>Plates used for culturing hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD Viability Staining Solution</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-6993-50</td>
			<td>Viability stain for identifying living cells during FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303016</td>
			<td>Conjugated antibody for FACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well cell culture plate</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>655079</td>
			<td>96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo S</td>
			<td>Nexcelcom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Imaging cytometer used to track hMPC cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352350</td>
			<td>Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (Rat Tail)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Collagen for coating cell culture plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 088 882 001</td>
			<td>Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>WN182</td>
			<td>Used for cryopreservation of hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>D4693</td>
			<td>A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium Low Glucose powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31600-034</td>
			<td>Low glucose DMEM for muscle biopsy processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td>PBS for muscle biopsy processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4040-01&#160;</td>
			<td>Required for FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-186&#160;</td>
			<td>Fetal bovine serum used for hMPC growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21700-026</td>
			<td>Base media for hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Equine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26-050-070</td>
			<td>Horse serum used to make hMPC differentiation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>iNCyto</td>
			<td>DHC-N0105</td>
			<td>Used to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1247501</td>
			<td>Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H21492</td>
			<td>DNA stain for identifying all cells using the Celigo S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416P-4</td>
			<td>Used for controlled rate freezing of hMPCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi buffer</td>
			<td>Orflo</td>
			<td>MXA006</td>
			<td>Buffer for automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi Cassettes</td>
			<td>Orflo</td>
			<td>MXC002</td>
			<td>Cassesttes for automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxi z Mini Automated Cell Counter</td>
			<td>Orflo</td>
			<td></td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Commerically available controlled rate cell freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50062Z</td>
			<td>Goat serum used in FACS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557747</td>
			<td>Conjugated antibody for FACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Antibiotics added to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td>DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human basic fibroblast growth factor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G5071</td>
			<td>Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12648-010</td>
			<td>Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-3</td>
			<td>Added to Ham&#39;s F12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Round Bottom 5 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-565</td>
			<td>Tubes used for FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraComp eBeads</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-2222-42</td>
			<td>Compensation beads fort calibrating flow FACS settings</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, characterization, and differentiation of human muscle progenitor cells from the skeletal muscle biopsy procedure

Användningen av primär mänsklig vävnad och celler är idealisk för utredning av biologiska och fysiologiska processer såsom skelettmuskulaturen regenerativ process. Det finns erkända utmaningar att arbeta med mänskliga primära vuxna stamceller, särskilt humana muskelstamceller (hMPCs) härrör från skelettmuskel biopsier, inklusive låg cell avkastning från insamlade vävnad och en stor grad av givarens heterogenitet av tillväxt och död parametrar bland kulturer. Samtidigt införliva heterogenitet i experimentell design kräver en större urvalsstorlek för att upptäcka betydande effekter, det gör det också möjligt för oss att identifiera mekanismer som ligger bakom variationer i hMPC expansions kapacitet, och därmed ger oss möjlighet att bättre förstå heterogenitet i skelettmuskulaturen förnyelse. Nya mekanismer som skiljer kulturernas expansions förmåga har potential att leda till utveckling av terapier för att förbättra skelettmuskel förnyelse.

Representativa flödescytometri resultat av hMPC-isolering från mänsklig muskelvävnad kan ses i figur 1. hMPCs kan identifieras genom första gating händelser baserat på sidan scatter och framåt scatter för att eliminera döda celler eller skräp, följt av att välja endast celler som är negativa för 7-AAD och därför är livskraftiga. Val av celler positiva för både cell ytan markörer CD56 och CD29 representerar hMPC populationen. En biopsi av ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure at JoVE.com

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Vi presenterar tekniker för att isolera, odla, karakterisera och differentiera mänskliga primära muskelstamceller (hMPCs) som erhållits från skelettmuskel biopsi vävnad. hmpcs erhålls och kännetecknas genom dessa metoder kan användas för att därefter behandla forskningsfrågor relaterade till mänsklig myogenes och skelettmuskulaturen förnyelse.

Isolering, kultur, karakterisering, och differentiering av humana muskelstamceller från skelettmuskulaturen biopsi förfarande

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Isolera de mänskliga muskel stamceller som reglerar skelettmuskelregenerering tillåter oss att undersöka processer som ligger till grund för regenerativ process samtidigt behålla givarens variabilitet. Denna teknik gör att stora utbyten av mänskliga muskel stamceller som skall erhållas från små mängder vävnad och deras fenotypiska analys med hjälp av ett litet antal celler. Denna metod är särskilt utformad för att isolera mänskliga muskel stamceller för att spåra deras spridning och differentiering kapacitet och att relatera dessa uppgifter till skelettmuskeln regenerativ process.Den svåraste aspekten av denna ganska enkla teknik är att se till att varje steg utförs reproducerbara för att optimera utbyte och renhet av cellerna. Det finns flera steg som måste slutföras för framgångsrik isolering av cellerna. Flera av stegen är lättare att förstå om de observeras visuellt.För att isolera mänskliga muskel progenitor celler från biopsi vävnad, placera muskelvävnaden i en steril Petriskål under sterila förhållanden, och använda en steril skalpell att finhacka vävnaden i en millimeter kubik bitar. När all vävnad har finhackats, överför bitarna till ett 15-milliliter rör som innehåller 10 milliliter PBS, och låt vävnaderna att bosätta sig genom gravitation innan försiktigt aspirera supernatanten utan att störa vävnaden. Efter tvätt fragmenten en andra gång som just visat, ersätta PBS med 10 milliliter av låg glukos Dulbecco modifierade Eagle medium.Ta bort supernatanten efter att vävnaderna har satts, och återanvänd bitarna i tre milliliter av matsmältningsmedium. Placera vävnaderna på 37 grader Celsius i 30 minuter, med trituration av muskelfragmenten var 10 minuter med en en milliliter serologisk pipett. I slutet av inkubationen, tillsätt 83 mikroliter av ytterligare matsmältningsmedium och 24 mikroliter av Dispase-lösning till proverna, och triturtera vävnaderna var femte till 10 minuter med en bred-bore pipetter spets tills en enhetlig flytgödsel uppnås.En enhetlig slurry är viktigt för maximal återhämtning av de mänskliga muskeln stamceller. Fortsätt matsmältningen om slurry inte passerar genom en standard 1, 000-microliter pipett spets. För att isolera de Pax7-positiva cellerna, färga och grind cellerna enligt protokollet.Sortera CD56, CD29 dubbel positiv mänskliga muskel stamceller på ett flöde cytometer med en 100-mikrometer munstycke vid ett tryck på 20 pounds per kvadrattum i insamlingsrör som innehåller en 300-mikroliter kudde av fluorescens-aktiverad cell sortering buffert. Sedan utsäde sorterade mänskliga muskel stamceller i kollagen-belagda 24-brunn plattor som innehåller förv warmed tillväxt medium på en 3,5 gånger 10 till den fjärde celler per centimeter kvadrat koncentration. Om du vill utföra sammanflödesskanningar, ladda plattan på en avbildningscytometer och välj Skapa ny skanning och plattans kategori, plattans profil och Plåt-ID.Under Tillämpning väljer du Sammanflödet och sammanflödet 1 och väljer en brunn som du vill visa.Leta reda på ett plan med fokus där cellerna visas vita jämfört med bakgrunden och välj Registrera manuellt. Använd musen för att markera alla de brunnar som måste skannas, och välj Starta skanning. Hela brunnsområdet kommer automatiskt att skannas.Välj de analysinställningar som är optimala för plattan och celltypen och välj Starta analys. Använd avbildningscytometern för att mäta sammanflödet initialt. Sedan att räkna cellerna på bildframställning cytometer, ersätta mediet i varje brunn med 200 mikroliter av färgningslösning.Efter 15 minuter vid 37 grader Celsius, byt färgningslösning med 100 mikroliter av färsk Hams F12. Returnera plattan till bildcytometern, och under Tillämpning väljer du Cell Viability och Live Dead Total. Live-kanalen kommer att vara en ljusfältsbild, Dead-kanalen kommer att visa propidium iodidfärgningen och Total-kanalen kommer att vara Hoechst 33342-färgningen.Klicka på Registrera auto under Fokusinställning. Ställ in kanalen på blå under kanalen Totalt. Använd Sök fokus för att få kärnorna i fokus och klicka på Ange förskjutning för att markera fokus.Under dead-kanalen ställer du in kanalen på rött och använder Hitta fokus för att få de döda cellerna i fokus. Klicka på Ange förskjutning för att markera fokus och välj Starta skanning för att starta genomsökningen. Välj sedan de analysparametrar som är lämpliga för plattan och celltypen och välj Starta analys för att starta analysen.När analysen är klar, visuellt kontrollera att analysen på lämpligt sätt räknade cellerna. Om skanningen och analysen är tillfredsställande, returnera plattan till inkubatorn, annars återansöka eller modifiera analysparametrarna. Mänskliga muskel stamceller kan identifieras genom att först gating händelser baserat på sidan och framåt scatter-området för att eliminera döda celler eller skräp, följt av att välja endast de celler som är negativa för 7-AAD och därför är livskraftiga.De celler som är positiva för både CD56 och CD29 cell markörer cell sedan representerar den mänskliga muskeln progenitor cellpopulationen. Mänskliga muskel stamceller kan också identifieras genom deras Pax7 uttryck. Faktum är att Pax7 är berikad i den totala befolkningen efter FACS och upprätthålls genom flera passager.Här visas en representativ sammanflödesskanning. De gröna konturerna genererades av den bildframställningscytometern och visar hur den bildgivande cytometern bestämde sammanflödet baserat på de valda analysinställningarna. En heterogenitet och kärnor räknas är vanligt mellan givare.Upptäcka och exakt karakterisera denna heterogenitet är en viktig tillämpning av avbildning cytometer. Sammanflödet mätningar och kärnor räknas från unika givare, dock är starkt korrelerade. Mänskliga muskel stamceller differentierade för att bilda myotubes kan särskiljas genom sina embryonala myosin tunga kedjan uttryck.Det är viktigt att vara konsekvent när man väljer gating parametrarna på flödescytometern för att isolera samma population av celler från varje givare. När isolerade, mänskliga muskel stamceller kan användas för flera ändamål, inklusive identifiera de unika metaboliska krav på spridning och differentiering av mänskliga muskel stamceller. Isoleringen av mänskliga muskel stamceller har tillåtit diskriminering av skillnaderna i cellytan markör uttryck på mänskliga och mus muskel stamceller.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolering och Kvantitativ Immuncytokemiska karakterisering av primära myogena celler och fibroblaster från Human skelettmuskulatur

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Isolering av neurala stamceller / progenitorceller från periventrikulär regionen vuxen råtta och humant ryggmärgs

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analys av Zebrafish Larver skelettmuskulatur Integrity med Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Använda Isolerad Mitokondrier från minimala kvantiteter av mus skelettmuskulatur för hög genomströmning Mikroandnings Mätningar

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskalig produktion av Cardiomyocytes från Human pluripotenta stamceller med hjälp av en mycket reproducerbar liten molekyl baserad differentiering protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Upprättande och kultur Myogenic prekursorceller / Primära myoblaster från skelettmuskulatur av vuxna och äldre människor

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Isolering av Endothelial stamceller från mänskliga navelsträngsblod

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Tillämpningen av kronisk stimulering att studera kontraktila aktivitet-inducerad råtta skelettmuskulaturen fenotypiska anpassningar

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identifiering av skelettmuskulaturen satellit celler genom immunofluorescens med Pax7 och Laminin antikroppar

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Utföra humana skelettmuskulaturen xenografts hos Immunobristfällig möss

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...